楊佳敏， 楊培龍， 曲音波， 余曉斌， 羅 瑋*

（1. 江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 21422；2. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部飼料生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 10008；3. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 10008；4. 山東大學(xué)微生物技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237）

類胡蘿卜素作為一種天然色素， 在抗衰老、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫功能等方面均能發(fā)揮重要功效。 利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)β-類胡蘿卜素是較為經(jīng)濟(jì)、安全的生產(chǎn)方法，而三孢布拉霉（Blakeslea trispora）具有生物量大、產(chǎn)量高、生長(zhǎng)迅速、不受環(huán)境影響等諸多優(yōu)勢(shì)，是工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)β-類胡蘿卜的理想菌株[1]。

CrgA 起初是在卷枝毛霉中發(fā)現(xiàn)的，是一種在類胡蘿卜素生物合成的光誘導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用的負(fù)調(diào)節(jié)因子[2]。 在藤倉鐮孢（Fusarium fujikuroi）[3]、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）[4]、三孢布拉霉[5]和布拉克須霉（Phycomyces blakesleeanus）[6]中也都鑒定到了同源基因。在卷枝毛霉中crgA基因的表達(dá)是由光脈沖活化的，且其進(jìn)程均與類胡蘿卜素合成的結(jié)構(gòu)基因相似。在卷枝毛霉中敲除crgA基因會(huì)導(dǎo)致在黑暗中類胡蘿卜素的大量積累，參與類胡蘿卜素合成的結(jié)構(gòu)基因carB基因和carRP基因在黑暗和光照條件下均被活化表達(dá)[7]，表明CrgA 可能作為一種與carB和carRP基因合成有關(guān)的負(fù)調(diào)控因子參與類胡蘿卜素的合成。 McCrgA 和BtCrgA 都含有2個(gè)環(huán)指結(jié)構(gòu)域和不完整的LON 結(jié)構(gòu)域，見圖1。 環(huán)指結(jié)構(gòu)域的存在顯示其具有泛素連接酶活性。 Silva等的研究顯示，McCrgA 參與MCWC-1b 的非降解型的單泛素化和雙泛素化修飾，導(dǎo)致MCWC-1b 失活但并不降解， 在黑暗中CrgA 則通過單泛素化和雙泛素化MCWC-1b 使其失活[8]，影響了調(diào)控因子進(jìn)而抑制類胡蘿卜素的合成。

圖1 McCrgA 及BtCrgA 結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 1 Strudure representation of McCrgA and BtCrgA

三孢布拉霉crgA基因?qū)刖碇γ沟腸rgA缺陷型菌株后產(chǎn)生了相同的光誘導(dǎo)和光適應(yīng)現(xiàn)象，表明CrgA 參與的調(diào)節(jié)機(jī)制在這些真菌之間基本保守， 三孢布拉霉中CrgA 的調(diào)節(jié)機(jī)制可能與卷枝毛霉相似[5]。 鞏尊洋等構(gòu)建了三孢布拉霉的crgA缺陷型突變株并對(duì)其進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)缺陷型菌株中參與類胡蘿卜素合成的3 種結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄顯著增強(qiáng)，生產(chǎn)的類胡蘿卜素水平相較于野生型提高了31.2%[9]，因此三孢布拉霉CrgA 同樣也是作為一種負(fù)調(diào)控因子調(diào)節(jié)類胡蘿卜素的相關(guān)合成，且在功能上可能與卷枝毛霉CrgA 相似， 其對(duì)類胡蘿卜素合成的調(diào)控可能也是通過對(duì)WC-1b 蛋白的泛素化的調(diào)控進(jìn)而影響類胡蘿卜素的合成。

由于目前三孢布拉霉遺傳轉(zhuǎn)化操作困難，三孢布拉霉類胡蘿卜素合成機(jī)制的解析也較為困難，在已知BtCrgA 作為類胡蘿卜素合成的負(fù)調(diào)控因子的情況下， 作者嘗試通過異源表達(dá)及體外檢測(cè)對(duì)BtCrgA 參與的機(jī)制進(jìn)行初步分析，期望通過基因挖掘和生物信息學(xué)分析三孢布拉霉泛素化相關(guān)酶的基本性質(zhì)，并獲得體外泛素化反應(yīng)候選酶，通過異源表達(dá)、 親和純化及體外泛素化來構(gòu)建BtCrgA 的體外泛素化反應(yīng)體系， 以尋找能協(xié)助BtCrgA 實(shí)現(xiàn)泛素連接酶功能的相關(guān)酶， 確定BtCrgA 的泛素連接酶功能并探究其是否能實(shí)現(xiàn)對(duì)BtWC-1b 的泛素化，進(jìn)而從體外實(shí)現(xiàn)對(duì)CrgA 部分功能的探究，為解析CrgA 在三孢布拉霉菌體內(nèi)的功能及對(duì)類胡蘿卜素合成中的負(fù)調(diào)節(jié)作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒三孢布拉霉（Blakeslea trispora）NRRL 2896 （- ）、Escherichia coliBL21（DE3）： 作者所在實(shí)驗(yàn)室保藏菌株， 表達(dá)載體為pET-28a。

1.1.2 試劑 真菌總RNA 抽提純化試劑盒、 硫酸卡那霉素： 生工生物 （上海） 有限公司；HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒： 康為世紀(jì)生物科技有限公司； 質(zhì)粒提取、DNA 產(chǎn)物純化試劑盒：天根生化科技（北京）有限公司；泛素兔單克隆抗體：武漢愛博泰克生物科技有限公司；0.2 μmPVDF 膜、Myc 抗體（小鼠單抗）、Flag抗體（小鼠單抗）、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG：上海碧云天生物技術(shù)有限公司；DNA marker、BamH I 限制性內(nèi)切酶、Sac I 限制性內(nèi)切酶：Takara 公司；蛋白質(zhì)預(yù)染marker、2×Phanta Max Master Mix、ClonExpress?II One Step Cloning Kit、高敏型ECL 化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒：諾唯贊生物科技股份有限公司；其他試劑：國藥集團(tuán)藥業(yè)股份有限公司；引物合成、基因合成及測(cè)序均由蘇州金唯智公司完成。

1.2 方法

1.2.1 泛素化相關(guān)因子基因挖掘 利用真菌總RNA 提取試劑盒提取三孢布拉霉NRRL 2896（-）總RNA。 利用HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。

根據(jù)卷枝毛霉E1（EPB87762）氨基酸序列，從三孢布拉霉NRRL2456 全基因組數(shù)據(jù)庫（https：//mycocosm.，jgi.doe.gov/pages/blast-query.jsf?db=Blatri1）中的Blast 功能得到同源蛋白質(zhì)的基因位置信息，根據(jù)氨基酸序列與堿基序列對(duì)應(yīng)關(guān)系初步拼接基因序列并設(shè)計(jì)引物，以三孢布拉霉cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過測(cè)序獲得完整序列信息。

從UbiProt 數(shù)據(jù)庫（http：//ubiprot.org.ru/）中下載釀酒酵母的所有UBC 蛋白質(zhì)序列，利用TBTools 軟件以釀酒酵母所有UBC 蛋白質(zhì)氨基酸序列與三孢布拉霉的全氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)， 得到候選E2 酶家族成員。 根據(jù)候選E2 酶的氨基酸序列與全基因組序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)獲得基因位置信息，根據(jù)氨基酸序列與堿基序列對(duì)應(yīng)關(guān)系初步拼接基因序列并設(shè)計(jì)引物。 以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，通過測(cè)序獲得完整序列信息。

1.2.2 三孢布拉霉泛素化相關(guān)因子生物信息學(xué)分析 利用ProtParam 預(yù)測(cè)BtE1 的基本性質(zhì)。 根據(jù)基因組位置信息對(duì)所有BtUBC 蛋白質(zhì)進(jìn)行重新命名，并利用ProtParam 預(yù)測(cè)各UBC 蛋白質(zhì)基本性質(zhì)。 在Euk-mPLoc 網(wǎng)站預(yù)測(cè)各蛋白質(zhì)的亞細(xì)胞定位。 利用TBtools 的Batch SMART 功能從SMART 數(shù)據(jù)庫批量獲取各UBC 蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)， 分析結(jié)果并作圖。 利用MEGA7 軟件對(duì)酵母UBC 蛋白質(zhì)和三孢布拉霉UBC 蛋白質(zhì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 重組載體構(gòu)建、 異源表達(dá)及純化 以cDNA為模板， 克隆BtE1、BtCrgA、BtWC-1b 以及BtUBC基因，利用ClonExpress? II One Step Cloning Kit 將目的基因片段克隆到pET-28a 載體的BamH I/Sac I位點(diǎn)， 其中BtCrgA 與Myc 標(biāo)簽融合，BtWC-1b 與Flag 標(biāo)簽融合， 通過熱擊將重組載體導(dǎo)入E.coli BL21（DE3）。

將含有各重組載體的E.coli 在50 mL LB 液體培養(yǎng)過夜，接種于TB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8， 加入0.3 mmol/L 的異丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG），在16 ℃、125 r/min 誘導(dǎo)表達(dá)20 h。 誘導(dǎo)后菌液經(jīng)離心棄去上清液、PBS 緩沖液洗滌重懸后，超聲破碎細(xì)胞， 于4 ℃、8000 r/min 離心10 min 后取上清液，經(jīng)0.45 μm 濾膜抽濾后，使用Ni-NTA 進(jìn)行蛋白質(zhì)純化， 純化得到的蛋白質(zhì)經(jīng)SDS-PAGE驗(yàn)證。

1.2.4 CrgA 泛素連接酶功能分析 參考Honda等[10]的反應(yīng)體系進(jìn)行CrgA 參與的泛素連接酶功能探究，30 μL 的體外泛素化反應(yīng)體系中包含了1.5 μL 20×反應(yīng)緩沖液（1 mol/L Tris-HCl、40 mmol/L ATP、100 mmol/L MgCl2、40 mmol/L DTT、pH 7.5）， 加入300 ng BtE1、300 ng BtE2、2 μg 泛素、1 μg BtCrgA及1 μg BtWC-1b 蛋白質(zhì)，30 ℃反應(yīng)2 h， 加入5×SDS-PAGE 上樣緩沖液，煮沸5 min，在SDS-PAGE凝膠上進(jìn)行電泳分離，進(jìn)行Western blot 分析，將凝膠中分離的蛋白質(zhì)經(jīng)半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，用含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBST 溶液室溫封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST 溶液洗滌3 次，二抗孵育1 h， 洗滌3 次后使用ECL 發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行成像。

2 結(jié)果與討論

2.1 三孢布拉霉泛素化相關(guān)酶基因挖掘

泛素化修飾是一種重要的蛋白翻譯后修飾途徑， 完整途徑包括了泛素活化酶E1 （ubiquitinactivating enzyme，UBA）、泛素結(jié)合酶E2（ubiquitinconjugation enzyme，UBC ） 和泛素連接酶 E3（ubiquitin-protein ligase）[11]， 要實(shí)現(xiàn)對(duì)BtCrgA 泛素連接酶功能的體外探究，首先需要獲得泛素活化酶及泛素結(jié)合酶的相關(guān)序列信息。

根據(jù)卷枝毛霉已報(bào)道的泛素活化酶序列以及三孢布拉霉全基因組信息設(shè)計(jì)引物，以三孢布拉霉cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增， 得到全長(zhǎng)約為3000 bp 的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，對(duì)擴(kuò)增得到的序列進(jìn)行測(cè)序，得到3030 bp 的序列，對(duì)應(yīng)的氨基酸序列與卷枝毛霉E1 酶序列同源性為88.4%， 可初步認(rèn)定該蛋白為E1 酶，將該基因命名為BtE1，見圖2。

圖2 BtE1 及BtUBC 基因編碼序列核酸電泳圖Fig. 2 Nucleic acid electrophoresis of BtE1 and BtUBC gene coding sequences

利用TBtools 軟件， 以酵母已報(bào)道的泛素結(jié)合酶序列為模板，從三孢布拉霉基因組數(shù)據(jù)庫信息中共篩選得到三孢布拉霉的18 種UBC 蛋白質(zhì)， 根據(jù)基因信息設(shè)計(jì)引物，以三孢布拉霉cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到不同長(zhǎng)度的基因序列，經(jīng)測(cè)序后得到BtUBC 基因編碼序列長(zhǎng)度在411～1227 bp。

2.2 三孢布拉霉泛素化相關(guān)酶特征分析

2.2.1 泛素活化酶基本性質(zhì)分析 泛素活化酶E1，是泛素化修飾途徑中的重要起始酶類，依賴ATP 作用下激活泛素并將其轉(zhuǎn)移至E2 酶[12]。三孢布拉霉泛素活化酶BtE1 由1009 個(gè)氨基酸組成，蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量預(yù)測(cè)為113700，等電點(diǎn)為5.02，為穩(wěn)定性蛋白質(zhì)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)顯示它位于細(xì)胞質(zhì)中。

2.2.2 泛素結(jié)合酶基本性質(zhì)分析 泛素結(jié)合酶E2在泛素化途徑中起到接受E1 酶的泛素并將泛素轉(zhuǎn)移給E3 酶或底物蛋白質(zhì)的作用，E2 酶的主要特征是含有高度保守的泛素結(jié)合（UBC）結(jié)構(gòu)域[13]。 目前僅鑒定出三十幾個(gè)物種的泛素結(jié)合酶E2 家族成員，主要為釀酒酵母、秀麗線蟲、多種植物及人類，且不同物種中的泛素結(jié)合酶E2 數(shù)目在十幾到數(shù)十個(gè)不等[14]。而從三孢布拉霉中一共鑒定到18 種泛素結(jié)合酶。 這18 種三孢布拉霉UBC 蛋白質(zhì)由136～408個(gè)氨基酸組成， 蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量在15200到46100，基因內(nèi)含子數(shù)量為1～9，蛋白質(zhì)大多數(shù)位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)位于細(xì)胞骨架或細(xì)胞膜上，這表明BtUBC 多在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中發(fā)揮作用。 不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同（4.17～9.62），BtUBC 蛋白質(zhì)均屬于不穩(wěn)定蛋白質(zhì)，親水性平均系數(shù)代表蛋白質(zhì)的親水性情況，除BtUBC C 蛋白質(zhì)外，其余蛋白質(zhì)均為親水性蛋白質(zhì)。

對(duì)所有BtUBC 蛋白質(zhì)進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示所有BtUBC 蛋白質(zhì)均含有UBCc 結(jié)構(gòu)域，見圖3（a）。 表明這18 種蛋白質(zhì)均屬于UBC 蛋白質(zhì)，在BtUBC A/E/G/I/K/L/N/O 中含有一個(gè)低復(fù)雜度結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)可能具有位置依賴作用，其在序列中的位置可能與蛋白質(zhì)的結(jié)合特性及生物學(xué)作用有關(guān)[15]，BtUBC I 和BtUBC O 的N 端含有跨膜結(jié)構(gòu)域。

對(duì)所有BtUBC 保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行多序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，見圖3（b）。 多序列比對(duì)結(jié)果顯示這些UBC 保守結(jié)構(gòu)域序列的一致性為36.58%， 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示在UBC 保守結(jié)構(gòu)域中含有4 個(gè)α 螺旋和3 個(gè)β 折疊，另外幾乎所有BtUBC 蛋白質(zhì)中均含有泛素硫酯中間體相互作用殘基和E3 相互作用殘基， 大部分蛋白質(zhì)含有半胱氨酸活性位點(diǎn)，部分蛋白質(zhì)如BtUBC E/I/K/O/P 則缺乏半胱氨酸活性位點(diǎn)，可能屬于類E2 酶，主要是與通過活性E3 酶合作在泛素化修飾中發(fā)揮功能[16]。 對(duì)14 個(gè)釀酒酵母和18 個(gè)三孢布拉霉E2 酶成員進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析，見圖3（c）。 BtUBC 蛋白質(zhì)與ScUBC 蛋白質(zhì)在進(jìn)化上并不是完全對(duì)應(yīng)關(guān)系，表明在進(jìn)化不同物種進(jìn)化過程中UBCs 發(fā)生了不同的變化， 酵母和三孢布拉霉的E2 成員分布在7 個(gè)亞家族中。 根據(jù)結(jié)構(gòu)特征， 各UBC 蛋白質(zhì)又可分為4 類 （以不同標(biāo)記區(qū)分），分別為僅含有UBC 結(jié)構(gòu)域的I 類、含有C 端延伸及UBC 結(jié)構(gòu)域的II 類、含有N 端衍生及UBC 結(jié)構(gòu)域的III 類和含有C 端、N 端延伸及UBC 結(jié)構(gòu)域的IV 類[17-19]，在涉及的UBC 蛋白質(zhì)中，BtUBC D/J/B/P/H/C/Q/R 和ScUBC 4/5/7/9/13/MMS2 屬于I 類，BtUBC G/I/L/N/O 和ScUBC1/2/3/6/8 屬于II 類，BtUBC A/F 和ScUBC 12/X 屬于IV 類，BtUBC E/K屬于IV 類。 系統(tǒng)發(fā)育樹上相同或相似分支的大部分ScUBC 蛋白質(zhì)和BtUBC 蛋白質(zhì)屬于同一類型的UBC， 但也有少數(shù)類型不一致， 如ScUBC X 和BtUBC C、ScUBC 2 和BtUBC R。

2.3 泛素化相關(guān)酶的異源表達(dá)及蛋白質(zhì)純化

Rad18 是一種泛素連接酶， 能與泛素結(jié)合酶Rad6（UBC 2）形成復(fù)合物，實(shí)現(xiàn)底物蛋白質(zhì)的單泛素化修飾[20]。 McCrgA 含有的RAD18 超家族結(jié)構(gòu)表明McCrgA 可能也屬于Rad18 這類蛋白質(zhì)，而BtCrgA 雖然不含RAD18，但它與McCrgA 有很高的同源性， 所以考慮將與ScUBC 2 親緣關(guān)系較近的BtUBC A/E/K/N/Q/R 作為候選泛素結(jié)合酶。 此外，ScUBC4/5 具有強(qiáng)大的泛素轉(zhuǎn)移活性，可以協(xié)助各種泛素連接酶進(jìn)行泛素化修飾功能[21]，因此BtUBC D蛋白質(zhì)也同樣作為候選E2 酶。 這些BtUBC 基因成功構(gòu)建出重組載體， 但只有BtUBC A、BtUBC D 和BtUBC Q 成功實(shí)現(xiàn)異源表達(dá)。BtUBC E、BtUBC N 和BtUBC R 經(jīng)過密碼子優(yōu)化后可以在大腸桿菌中表達(dá)，而BtUBC K 即使經(jīng)過密碼子優(yōu)化也無法表達(dá)。

所有能表達(dá)異源蛋白質(zhì)的重組菌經(jīng)培養(yǎng)、誘導(dǎo)表達(dá)、超聲破碎、親和純化獲得相應(yīng)蛋白質(zhì)，并進(jìn)行SDS-PAGE 檢測(cè)。 其中BtE1 蛋白質(zhì)的預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量約為113000，BtCrgA 蛋白質(zhì)約為70000，BtWC-1b 蛋白質(zhì)約為85000。 BtUBC A、BtUBC D、BtUBC E、BtUBC N、BtUBCQ 和BtUBC R 的蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量分別為20300、16900、37500、18400 和17300。SDS-PAGE 結(jié)果顯示，目標(biāo)蛋白質(zhì)條帶出現(xiàn)在相應(yīng)位置，BtWC-1b 蛋白質(zhì)的實(shí)際大小大于預(yù)測(cè)的相對(duì)分子質(zhì)量，見圖4。

圖4 泛素化相關(guān)蛋白質(zhì)純化圖Fig. 4 Purification of ubiquitination related proteins

2.4 CrgA 泛素連接酶功能體外分析

以純化得到的各組分進(jìn)行體外泛素化反應(yīng)，經(jīng)SDS-PAGE 分離、轉(zhuǎn)膜后利用泛素抗體、Myc 抗體以及Flag 抗體檢測(cè)反應(yīng)情況， 結(jié)果顯示在BtUBC A/D/E/N/Q/R 這6 種UBC 蛋白質(zhì)中，僅有BtUBC D 可介導(dǎo)BtCrgA 發(fā)生泛素化，但并未導(dǎo)致WC-1b 發(fā)生泛素化， 可能是尚未找到能協(xié)助CrgA 發(fā)揮對(duì)WC-1b 蛋白質(zhì)泛素化功能的UBC 蛋白質(zhì)， 可能是目前的體外泛素化條件并未達(dá)到要求等原因?qū)е拢缒承〦2 酶就是與泛素樣分子發(fā)生作用而不是與泛素分子。

為進(jìn)一步確定反應(yīng)的泛素化情況， 排除是E1酶、E2 酶泛素化反應(yīng)后產(chǎn)生該類結(jié)果的可能， 分別設(shè)置缺乏不同成分的對(duì)照組進(jìn)行體外泛素化反應(yīng)和Western Blot 檢測(cè)， 結(jié)果顯示當(dāng)E1、E2、E3 均存在的條件下，CrgA 能夠發(fā)揮其泛素連接酶的功能，自身會(huì)發(fā)生泛素化，而WC-1b 則并未受到影響，見圖5。

圖5 不同UBC 蛋白質(zhì)的體外泛素化反應(yīng)結(jié)果Fig. 5 In vitro ubiquitination of different UBC proteins

泛素化反應(yīng)是由泛素激活酶E1 酶起始，E1 酶在ATP 作用下與泛素形成高能硫酯鍵，活化后的泛素轉(zhuǎn)移到泛素結(jié)合酶E2 上， 最后泛素連接酶催化底物蛋白質(zhì)與泛素連接[22]，修飾形式涉及單一泛素附著（單泛素化）、幾個(gè)單一泛素分子或泛素鏈附著（多泛素化）[23]。 在6 種候選泛素結(jié)合酶參與的反應(yīng)中， 僅有BtUBC D 參與的反應(yīng)可以導(dǎo)致BtCrgA 發(fā)生泛素化修飾，而BtWC-1b 未受到影響，表明在該作用下BtCrgA 與泛素形成的連接方式可能并不適用于將泛素轉(zhuǎn)移給BtWC-1b。該反應(yīng)涉及步驟大致為BtE1 在ATP 作用下激活泛素并與之結(jié)合， 隨即泛素能夠轉(zhuǎn)移到BtUBC D 上，最后可能由于缺乏相應(yīng)底物蛋白質(zhì)， 或者BtCrgA 自身可能就是一種底物蛋白質(zhì)，導(dǎo)致BtCrgA 發(fā)生泛素化修飾，形成多泛素化，見圖6。 這種對(duì)于BtCrgA 的泛素化修飾可能與BtCrgA 在菌體內(nèi)的質(zhì)量濃度及活性調(diào)節(jié)有關(guān)。

圖6 不同組分體系的泛素化反應(yīng)結(jié)果Fig. 6 Results of ubiquitination reaction of different components

有研究表明含有環(huán)指結(jié)構(gòu)域的E3 酶通過向自身添加多聚泛素鏈，進(jìn)而進(jìn)入降解途徑或發(fā)生功能的改變從而調(diào)控其作為E3 酶的酶活力[24]，從構(gòu)建的三孢布拉霉和釀酒酵母UBC 蛋白質(zhì)的系統(tǒng)進(jìn)化樹中可以發(fā)現(xiàn)，與BtUBC D 蛋白質(zhì)親緣關(guān)系較近的為ScUBC 4 和ScUBC 5 兩類蛋白質(zhì)，而這兩類蛋白質(zhì)在酵母中往往是與不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)相關(guān)[25]。 有研究顯示， 在野生型卷枝毛霉中，CrgA 難以被特異性抗體檢測(cè)到， 而在酵母中異源表達(dá)CrgA 時(shí)同樣顯示出CrgA 的不穩(wěn)定性[26]，這也可能是由于這類與酵母UBC4、UBC5 同源的UBC 蛋白質(zhì)參與到了CrgA 的泛素化反應(yīng)中， 促使CrgA 蛋白質(zhì)進(jìn)入26s-蛋白酶體降解途徑或其他途徑導(dǎo)致CrgA 的降解， 從而維持了CrgA 在菌體內(nèi)的極低水平。 因此，BtUBC D 也可能只直接介導(dǎo)了BtCrgA 的自泛素化而不用將泛素再轉(zhuǎn)移至其他底物蛋白質(zhì)， 這對(duì)于維持CrgA 在菌體內(nèi)的水平可能具有重要意義。 而關(guān)于BtCrgA對(duì)BtWC-1b 的泛素化作用，目前仍未得到驗(yàn)證，可能是由于缺乏必要的泛素化反應(yīng)條件才導(dǎo)致無法實(shí)現(xiàn)該反應(yīng)，見圖7。

圖7 BtCrgA 泛素化修飾示意圖Fig. 7 Schematic diagram of BtCrgA ubiquitination modification

3 結(jié)語

作者基于基因組數(shù)據(jù)挖掘，從三孢布拉霉中發(fā)現(xiàn)了一種泛素活化酶和18 種泛素結(jié)合酶， 利用生物信息學(xué)分析了泛素活化酶和泛素結(jié)合酶的基本性質(zhì)， 對(duì)三孢布拉霉UBC 蛋白質(zhì)和釀酒酵母UBC蛋白質(zhì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，該家族中的蛋白質(zhì)分屬于7 種蛋白質(zhì)亞家族，并篩選出6 種BtUBC 蛋白質(zhì)作為候選基因構(gòu)建體外泛素化反應(yīng)體系。 通過基因克隆和基因合成在E.coli 中實(shí)現(xiàn)了BtE1、6 種BtUBC、BtCrgA 以及BtWC-1b 的異源表達(dá)。 通過不同UBC 蛋白質(zhì)參與的體外泛素化反應(yīng)，最終檢測(cè)到BtUBC D 蛋白質(zhì)能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)BtCrgA 的泛素化修飾。 通過不同組分泛素化反應(yīng)體系的檢測(cè)結(jié)果顯示，只有當(dāng)E1、E2、E3 均存在的條件下，才能檢測(cè)到CrgA 的泛素化， 驗(yàn)證了CrgA 的泛素連接酶功能。BtUBC D 蛋白質(zhì)與ScUBC 4 以及ScUBC 5 同源，這可解釋CrgA 在菌體內(nèi)的不穩(wěn)定性及極低的含量，在這個(gè)泛素化反應(yīng)體系中，泛素經(jīng)泛素激活酶BtE1活化后轉(zhuǎn)移給泛素結(jié)合酶BtUBC D，最后轉(zhuǎn)移至泛素連接酶BtCrgA 上， 導(dǎo)致BtCrgA 發(fā)生了泛素化修飾。 目前的研究尚未實(shí)現(xiàn)對(duì)BtWC-1b 泛素化，或可通過構(gòu)建三孢布拉霉的crgA 缺陷型菌株來從體內(nèi)探究CrgA 與WC-1b 之間的關(guān)系，從而進(jìn)一步解析三孢布拉霉類胡蘿卜素的合成機(jī)制。 另外也可構(gòu)建crgA 突變型的三孢布拉霉菌株以探究CrgA 的關(guān)鍵性結(jié)構(gòu)域?qū)τ谌卟祭购铣深惡}卜素的影響，以期為解析類胡蘿卜素合成機(jī)制以及提高類胡蘿卜素產(chǎn)量提供部分依據(jù)。