陳 浩， 吉宏武*， 張 迪， 劉書成，宋文奎， 郝記明

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院， 廣東 湛江 524008；2. 廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 湛江 524008；3. 廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524008；4. 廣東省海洋食品工程技術(shù)研究中心，廣東 湛江 524008；5. 水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524008）

蝦青蛋白（crustacyanin，CR）是甲殼動物中特有的一種載脂蛋白，屬于脂鈣蛋白（lipocalin）家族，常與蝦青素特異性結(jié)合， 從而為甲殼等組織提供顏色。 Wade 等人研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)提高飼料中類胡蘿卜素的水平并養(yǎng)殖于黑色底質(zhì)， 斑節(jié)對蝦（Penaeus monodon）表皮中的蝦青蛋白含量顯著增加，體色隨之變得更藍(lán)更黑[1]。 而Budd 等人采用RNA 干擾技術(shù)沉默蝦青蛋白基因，斑節(jié)對蝦體色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色[2]；顯微結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)蝦表皮上只有紅色的蝦青素顆粒，卻未見有藍(lán)色的蛋白質(zhì)顆粒。Gao 等人采用類似方法干擾脊尾白蝦蝦青蛋白的表達(dá)，其體色也發(fā)生了較大的改變[3]。 由此可見，蝦青蛋白在提供甲殼水產(chǎn)品體表顏色以及參與色澤調(diào)控等方面發(fā)揮著重要作用。

蝦青蛋白存在多種類型的亞基，依據(jù)相對分子質(zhì)量、氨基酸組成和序列等性質(zhì)的不同，主要分為CR-A 亞型（包含A2 和A3） 和CR-C 亞型（包含A1、C1 和C2）。目前，從不同甲殼動物體表結(jié)構(gòu)中純化的天然蝦青蛋白，均是由CR-A 或CR-C 亞型的一種或多種組合而成的多聚體，呈現(xiàn)藍(lán)色、黃色等多種顏色，如來自歐洲龍蝦（Homarus gammarus）甲殼的β-蝦青蛋白呈現(xiàn)紫色，由A1 和A3 亞基組成[4]。近年來，天然蝦青蛋白多聚體的呈色機(jī)制越來越受到學(xué)者的關(guān)注，研究者運(yùn)用晶體學(xué)、量子力學(xué)等方法對天然蝦青蛋白多聚體結(jié)構(gòu)進(jìn)行了剖析，陸續(xù)提出了極化作用、共平面效應(yīng)、激子耦合、烯醇化等理論[5-8]。 但是，蝦青素與蝦青蛋白亞基之間相互作用引起復(fù)合物光譜紅移的機(jī)制仍無定論。 為此，Chayen 等將蝦青蛋白多聚體脫去蝦青素，純化后得到單一的亞基并研究該亞基與蝦青素的相互作用，取得了較好的效果[9]。 但是該方法純化難度較大，耗時(shí)費(fèi)力。 因此，快速簡便制備蝦青蛋白亞基能夠?yàn)槲r青蛋白呈色機(jī)制研究奠定良好基礎(chǔ)。 作為一種成熟的表達(dá)系統(tǒng)，大腸桿菌早已廣泛應(yīng)用于藻藍(lán)蛋白等其他色素結(jié)合蛋白質(zhì)的研究中[10-11]。 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)制備重組蛋白質(zhì)，具有操作簡便、經(jīng)濟(jì)快捷、純度較高等優(yōu)點(diǎn)。 然而，蝦青蛋白亞基異源重組表達(dá)的報(bào)道很少，關(guān)于克氏原螯蝦蝦青蛋白亞基的表達(dá)至今未有人研究。 因此，以大腸桿菌為表達(dá)宿主，研究克氏原螯蝦蝦青蛋白亞基異源重組表達(dá)具有重要意義。

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii），屬甲殼綱、十足目、鰲蝦科，原產(chǎn)于北美洲，現(xiàn)已廣泛養(yǎng)殖于長江中下游水域。 近年來，因其色澤紅亮、味道鮮美而廣受消費(fèi)者的追捧。2020 年總產(chǎn)量已達(dá)240 萬t，約占我國甲殼類水產(chǎn)品總養(yǎng)殖產(chǎn)量的56.2%[12]。 目前，克氏原螯蝦相關(guān)研究多集中在養(yǎng)殖模式、食品安全監(jiān)測、病毒與免疫等方面，而色澤與蝦青蛋白相關(guān)研究較少[13-15]。 作者所在課題組前期從克氏原螯蝦甲殼中純化得到一個(gè)藍(lán)色的蝦青素蛋白多聚體，亞基相對分子質(zhì)量為21000（命名為PcCRA2），經(jīng)質(zhì)譜鑒定以及氨基酸比對分析推測該亞基屬于蝦青蛋白家族。 迄今，關(guān)于PcCRA2 編碼基因、組織分布以及異源表達(dá)還未有研究報(bào)道。 作者通過基因克隆獲得PcCRA2 基因（命名為cra2）的DNA 和cDNA序列，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）分析cra2基因在不同組織的表達(dá)特征，構(gòu)建原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中進(jìn)行重組表達(dá)，為進(jìn)一步研究蝦青蛋白呈色機(jī)制及蝦類色澤調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

克氏原螯蝦： 購自潛江市楚淼水產(chǎn)品有限公司，平均體長（11±1） cm，平均體質(zhì)量（32±4） g，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)1 d。 隨機(jī)挑取6 只健康的克氏原螯蝦進(jìn)行解剖，分別取表皮、肌肉、心臟、血淋巴、胃、肝胰腺、腸道、神經(jīng)、眼柄等9 種組織用液氮速凍后，置于-80 ℃保存待用。

1.2 菌種和質(zhì)粒

大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）、大腸桿菌感受態(tài)Top10、質(zhì)粒pET28a（+）、pMD19-T 載體：安徽通用生物系統(tǒng)有限公司。

1.3 主要試劑

Ezup 柱式DNA 抽提試劑盒、 柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒、柱式DNA 膠回收試劑盒、T-載體PCR 產(chǎn)物克隆試劑盒： 上海生工生物工程有限公司；HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit、AceQ qPCR SYBR Green Master Mix： 南京諾唯贊生物科技股份有限公司；LB 肉湯、LB 瓊脂： 北京陸橋技術(shù)股份有限公司；鎳-次氮基三乙酸（Ni-NTA）瓊脂糖凝膠：德國Qiagen 公司；限制性內(nèi)切酶Xho I 和Nco I、T4 DNA 連接酶：寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒、 蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)： 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；蝦青素（ATX）：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；卡那霉素 （Kan）、 異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）、曲拉通（Triton X-100）、尿素（Urea）、咪唑：北京索萊寶科技有限公司。

1.4 主要儀器

GeneAmp 9700 基因擴(kuò)增儀： 美國Applied Biosystems 公司；CFX96 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、GelDoc XR+凝膠成像系統(tǒng)： 美國Bio-Rad 公司；Cary 60 紫外可見分光光度計(jì)： 美國Agilent 公司；JY92-2D 超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；SW-CJ-2FD 超凈工作臺：蘇州凈化設(shè)備有限公司；HZQ-X100 全溫振蕩培養(yǎng)箱：蘇州市培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.5 克氏原螯蝦cra2 基因克隆

使用Ezup 柱式DNA 抽提試劑盒提取克氏原螯蝦肌肉的基因組總DNA。根據(jù)美國國家生物信息中心數(shù)據(jù)庫 （NCBI） 公布的紅螯螯蝦蝦青蛋白A（GenBank：ALC79588.1）和凡納濱對蝦蝦青蛋白A2（GenBank：XP_027238673.1） 高度保守氨基酸序列MFTT（L/V）（V/I）AA 和TAECVYRA，設(shè)計(jì)一對簡并引物A2-Fw 和A2-Rev 用于PCR 擴(kuò)增，見表1。 以克氏原螯蝦基因組總DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，然后將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物純化回收后與克隆載體pMD19-T 進(jìn)行連接反應(yīng)，得到的反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10。 通過菌液PCR 驗(yàn)證獲得陽性轉(zhuǎn)化子， 提取陽性轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒進(jìn)行酶切和測序驗(yàn)證，最終獲得cra2 基因的DNA 序列。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物序列Table 1 Primers used in experiments

根據(jù)已獲得的cra2 基因DNA 序列設(shè)計(jì)一對引物CA2-Fw 和CA2-Rev 用于cra2 基因cDNA 克隆。使用柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒提取克氏原螯蝦肌肉總RNA， 通過HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄， 以反轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物為模板， 以引物CA2-Fw 和CA2-Rev 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、連接以及篩選驗(yàn)證均和cra2基因DNA 序列實(shí)驗(yàn)過程一致， 最終獲得cra2 基因cDNA 序列。

1.6 基因序列分析

用軟件DNAMAN 6.0 查找開放閱讀框（ORF），并推導(dǎo)出氨基酸序列。 通過NCBI BLASTp 進(jìn)行同源比對， 并下載其他蝦種蝦青蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN 6.0 進(jìn)行氨基酸序列多重對比， 并用MEGA 6.0 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。 用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)；用SignalP 4.0 Server （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）分析信號肽；用Tmpred program（https：//www.expasy.org/resources/tmpred） 分析跨膜區(qū)；用ScanProsite（http：//prosite.expasy.org/）搜索蛋白質(zhì)功能結(jié)構(gòu)域；用CDD Search（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測。

1.7 克氏原螯蝦不同組織cra2 基因表達(dá)分析

按照柱式Trizol 總RNA 抽提試劑盒分別提取克氏原螯蝦9 種組織的總RNA，采用1.0 g/dL 瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 質(zhì)量和完整性。 分別以9種組織總RNA 為模板， 使用HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈，-20 ℃保存。根據(jù)已獲得的cra2 基因cDNA 序列設(shè)計(jì)引物CRA-F 和CRA-R，同時(shí)以克氏原螯蝦βactin 基因序列（GenBank：D14612.1）為內(nèi)參設(shè)計(jì)引物ACT-F 和ACT-R。 以獲得的cDNA 為模板，通過RT-qPCR 測定cra2 基因在9 種組織中的表達(dá)情況。 RT-qPCR 反應(yīng)體系10 μL：cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，2×AceQ qPCR SYBR Green Mix 5 μL，ddH2O 2 μL。 擴(kuò)增程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃35 s， 進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)；95 ℃15 s，60 ℃60 s，95 ℃30 s，95 ℃15 s。 每個(gè)樣品重復(fù)3 次。 根據(jù)熒光定量數(shù)據(jù)，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各組織中cra2 基因的相對表達(dá)量， 結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。 采用SPSS 20.0 進(jìn)行單因素方差分析和Duncan 多重比較分析，P＜0.05 表示差異顯著。

1.8 PcCRA2 原核重組表達(dá)

1.8.1 表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 用在線軟件JAVA Condon Adaption Tool（https：//www.jcat.de/）將克氏原螯蝦cra2 基因cDNA 序列按照大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化。 優(yōu)化后的基因序列由安徽通用生物系統(tǒng)有限公司合成，合成過程中額外添加了限制性內(nèi)切酶Xho I 和Nco I 的酶切位點(diǎn)和6×His 標(biāo)簽。合成好的基因和pET28a 載體分別用Xho I 和Nco I進(jìn)行雙酶切，并將酶切產(chǎn)物分別純化回收后進(jìn)行連接反應(yīng)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Top10，經(jīng)菌液PCR 鑒定后，選取陽性克隆單菌落質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切和測序驗(yàn)證。 最后將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌株E. coli BL21（DE3）中。

1.8.2 重組PcCRA2 誘導(dǎo)表達(dá)條件優(yōu)化 將構(gòu)建成功的重組菌E. coli BL21 （DE3） 劃線于含Kan（100 mg/L）的LB 固體平板上，挑取單菌落，接種于4 mL 含Kan（100 mg/L）的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h（OD600約為1.0），然后按體積比1∶100 接種于4 mL 含Kan（100 mg/L）的LB 液體培養(yǎng)基中。

1）最佳IPTG 誘導(dǎo)終濃度的確定 接種后培養(yǎng)3 h， 加入IPTG 并使其終濃度分別為0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol/L，37 ℃、200 r/min 振蕩誘導(dǎo)4 h。

2）最佳誘導(dǎo)起始點(diǎn)的確定 分別向接種后培養(yǎng)2、3、4、5、6 h 的菌液中加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，37 ℃、200 r/min 振蕩誘導(dǎo)4 h。

3）最佳誘導(dǎo)溫度的確定。 向接種后培養(yǎng)4 h 的菌液加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，分別在16、23、30、37、44 ℃的條件下200 r/min 振蕩誘導(dǎo)4 h。

4）最佳誘導(dǎo)時(shí)長的確定 向接種后培養(yǎng)4 h 的菌液加入終濃度為0.5 mmol/L 的IPTG，30 ℃、200 r/min 下分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10 h。 分別取出1 mL菌液，經(jīng)4 ℃、5000 g 離心3 min，收集菌體，超聲（300 W 超聲10 s，間隔15 s，共30 次）處理后，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳分析，并使用設(shè)備自帶軟件分析電泳條帶灰度來確定目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量。

1.8.3 重組蛋白的分離與純化 按最優(yōu)條件擴(kuò)大至1 L 培養(yǎng)。 所得菌體按1 g∶50 mL 用包涵體洗滌液（2 mol/L Urea，體積分?jǐn)?shù)1%的Triton X-100，50 mmol/L 的pH 7.4 PBS）洗滌2 次，4 ℃、5000 g 離心3 min。 所得沉淀按1 g∶10 mL 加入變性液（8 mol/L Urea，50 mmol/L 的pH 7.4 的PBS） 于4 ℃攪拌溶解。按說明書使用Ni-NTA 柱進(jìn)行親和層析純化，8 mol/L 尿素—不同濃度咪唑（10、20、50、100、200 mmol/L）溶液由低至高進(jìn)行梯度洗脫，分別收集洗脫液，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳檢測。 收集符合要求的洗脫液，使用尿素梯度（6、4、2、0 mol/L）透析復(fù)性，超濾濃縮，得到重組PcCRA2。

1.8.4 重組PcCRA2 與蝦青素特異性結(jié)合 參照PAN 等[16]的方法，稍作調(diào)整。 將40 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）、0.2 mol/L 硫酸銨溶液和12 mmol/L 蝦青素丙酮溶液等體積混合，加入重組PcCRA2 并使其終濃度為5 mmol/L，混合均勻，裝入透析袋置于20 mmol/L PBS 溶液中，4 ℃過夜。 超濾除去游離蝦青素后，測定其在220～800 nm 的紫外可見光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 cra2 基因的克隆及序列分析

DNA 和cDNA 擴(kuò)增結(jié)果見圖1。 電泳檢測分別在750～1000 bp 和500～750 bp 處有單一條帶。 通過測序分別獲得cra2 基因DNA 序列和cDNA 序列。 將cra2 基因DNA 序列和cDNA 序列分別提交至NCBI 數(shù)據(jù)庫， 序列登錄號分別為MW727506 和MW727507。

圖1 克氏原螯蝦cra2 基因的擴(kuò)增圖譜Fig. 1 Amplification of the cra2 gene from P. clarkii

cra2 基因cDNA 序列全長為573 bp， 共編碼190 個(gè)氨基酸，見圖2。 由ProtParam 預(yù)測分析可知，PcCRA2 蛋白分子式為C960H1433N237O286S9， 相對分子質(zhì)量為21158.9，理論等電點(diǎn)為5.59，屬酸性蛋白質(zhì)。不穩(wěn)定系數(shù)39.29，推測該蛋白質(zhì)為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。 脂肪系數(shù)為66.74，平均親水性系數(shù)-0.162，說明該蛋白質(zhì)為親水蛋白質(zhì)。 SignalP4.0 和SMART 分析顯示，PcCRA2 蛋白為分泌蛋白， 信號肽序列為1～16 氨基酸，ARM 保守結(jié)構(gòu)域 （lipocalin） 為43～184。 通過Tmpred蛋白質(zhì)跨膜區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，PcCRA2 蛋白存在2個(gè)由內(nèi)向外的跨膜區(qū)（第1～19、102～122 氨基酸位）和1 個(gè)由外向內(nèi)的跨膜區(qū) （第1～19 氨基酸位）。ScanProsite 分析結(jié)果顯示，PcCRA2 蛋白存在1 個(gè)肌鈣蛋白標(biāo)記（lipocalinsignature），位于36～49 氨基酸處。

圖2 克氏原螯蝦cra2 基因cDNA 序列及推導(dǎo)的氨基酸序列Fig. 2 Nucleotide and deduced amino acids sequences of cra2 gene from P. clarkii

2.2 氨基酸同源性比較及系統(tǒng)發(fā)育分析

BLAST 比對結(jié)果表明，克氏原螯蝦PcCRA2 與NCBI 公布的其他100 種蝦類蝦青蛋白氨基酸序列的相似性在57.89%～91.58%。 其中，與紅螯螯蝦蝦青蛋白A（Cherax quadricarinatus，ALC79588.1）的相似度最高，達(dá)91.58%；與歐洲龍蝦蝦青蛋白A2（H.gammarus，P80007.1）、 美洲龍蝦蝦青蛋白A2（Homarus americanus，XP_042227234.1）和天鵝龍蝦（Panulirus cygnus，ACL37112.1） 相似度分別達(dá)到87.93%、87.37%和73.68%。 多重比較氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，克氏原螯蝦與其他9 種蝦的蝦青蛋白均具有脂鈣蛋白（lipocalin）家族典型區(qū)域SCR-1（G-X-W，X代表不同的氨基酸）、SCR-2 （T-D-Y） 和SCR-3（R）， 而且這些區(qū)域在不同物種間具有高度保守性，見圖3。

利用MEGA5.0 軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析， 結(jié)果顯示，克氏原螯蝦與紅螯螯蝦先聚在一起，再與歐洲龍蝦、美洲龍蝦、天鵝龍蝦聚為一大支，而同屬對蝦科的日本對蝦、凡納濱對蝦、寬溝對蝦、刀額新對蝦、斑節(jié)對蝦聚為另一大支，見圖4。此外，遺傳距離分析結(jié)果表明，克氏原螯蝦與紅螯螯蝦具有最近的親緣關(guān)系。

圖4 蝦青蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of crustacyanin

2.3 cra2 基因組織表達(dá)分布

運(yùn)用RT-qPCR 檢測cra2 在克氏原螯蝦9 種組織中的表達(dá)水平見圖5。 cra2 mRNA 在各組織中均有表達(dá)，其中在表皮中的相對表達(dá)量顯著高于其他組織（P＜0.05），其次是腸道、肝胰腺，而肌肉中的表達(dá)量最低。

圖5 克氏原螯蝦cra2 基因mRNA 在不同組織中表達(dá)水平Fig. 5 Expression level of cra2mRNA in different tissues of P. clarkii

2.4 PcCRA2 原核重組表達(dá)

2.4.1 原核表達(dá)載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化 根據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性， 優(yōu)化了克氏原螯蝦cra2 基因cDNA 序列。 GC 比例由優(yōu)化前的54%減少至46%，密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaptation index）由0.69 提高至0.94，與理想值1.0 更為接近，有利于目標(biāo)基因高效表達(dá)[17]。 經(jīng)雙酶切和測序驗(yàn)證，表達(dá)載體pET28a-cra2 未發(fā)現(xiàn)移碼、堿基突變等情況，與預(yù)期目標(biāo)基因一致，表明cra2 基因cDNA 序列成功插入表達(dá)載體pET28a 中。

2.4.2 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件的優(yōu)化 如圖6（a）所示，除了對照組（未誘導(dǎo)），不同終濃度的IPTG 誘導(dǎo)下目標(biāo)蛋白質(zhì)均有表達(dá)（22000），但表達(dá)量不同。當(dāng)IPTG 終濃度為0.1 mmol/L 時(shí)， 目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量為18.9%；IPTG 繼續(xù)增加濃度至0.5、1.0 mmol/L，目標(biāo)表達(dá)量均明顯增加，但是相差不大；當(dāng)IPTG 濃度增至1.5、2.0 mmol/L 時(shí)， 目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)反而減少。 綜合考慮目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量和成本， 選擇0.5 mmol/L 為最佳IPTG 誘導(dǎo)終濃度。

如圖6（b）所示，接種后4 h 時(shí)開始誘導(dǎo)，目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量最高，約占菌體總蛋白質(zhì)的31.3%。接種后生長2 h 和6 h，目標(biāo)蛋白質(zhì)占菌體總蛋白質(zhì)比例均不高。 因此，選擇接種生長4 h 為最佳誘導(dǎo)起始點(diǎn)。

如圖6（c）所示，隨著溫度的升高，目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量先升高后降低，30 ℃時(shí)達(dá)到最大。 當(dāng)16 ℃和23 ℃誘導(dǎo)時(shí)，目標(biāo)蛋白質(zhì)電泳條帶在22000 處，顏色較淺，但在菌體總蛋白質(zhì)中的比例分別為23.5%，25.6%。 當(dāng)誘導(dǎo)溫度升高至44 ℃，目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)量降低。 因此，選擇30 ℃為最佳誘導(dǎo)溫度。

如圖6（d）所示，誘導(dǎo)時(shí)長在2～6 h 時(shí)，目的蛋白質(zhì)表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間而逐漸增加；超過6 h 時(shí)，目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)逐漸降低。 因此，選擇6 h 為最佳誘導(dǎo)時(shí)長。

誘導(dǎo)最佳條件為： 接種4 h 后加入0.5 mmol/L的IPTG，于30 ℃誘導(dǎo)6 h。

2.4.3 重組PcCRA2 與蝦青素特異性結(jié)合 重組PcCRA2 的Tris-HCl 溶液在270 nm 處出現(xiàn)單峰，見圖7。 蝦青素的丙酮溶液在474 nm 處有最大吸收峰。 超濾除去游離蝦青素后，重組PcCRA2 與蝦青素反應(yīng)溶液在265 nm 和505 nm 處均出現(xiàn)最大吸收峰， 說明重組PcCRA2 與蝦青素發(fā)生特異性結(jié)合。 相比游離蝦青素，可見光區(qū)最大吸收峰發(fā)生了紅移，從474 nm 移至520 nm 處。

圖7 重組PcCRA2 與蝦青素特異性結(jié)合的UV-vis 圖Fig. 7 UV-vis spectra of the specific binding of recombinant PcCRA2 to astaxanthin

2.5 討論

通過同源克隆獲得了克氏原螯蝦cra2 基因的DNA 和cDNA 序列， 并通過cDNA 序列獲得PcCRA2 氨基酸序列。 PcCRA2 氨基酸序列中含16個(gè)氨基酸（N 端） 的信號肽和174 個(gè)氨基酸的成熟肽，其中43～184 氨基酸位為lipocalin 保守結(jié)構(gòu)域，而且具有脂鈣蛋白家族3 個(gè)典型區(qū)域SCR-1 （GX-W）、SCR-2（T-D-Y）和SCR-3（R），表明PcCRA2屬于脂鈣蛋白家族。 這些典型區(qū)域在不同物種蝦青蛋白中高度保守，說明蝦青蛋白該區(qū)域在進(jìn)化上相對保守，這可能與蝦青蛋白均具有β-桶形空間結(jié)構(gòu)有關(guān)[2]。 另外，通過基因和氨基酸序列比對，可以確定PcCRA2 屬于蝦青蛋白A2 亞基。 迄今為止，在甲殼動物中只發(fā)現(xiàn)了2 個(gè)編碼蝦青蛋白的基因：cra和crc 基因， 它們同時(shí)或單獨(dú)存在于同一物種中表達(dá)CR-A 亞型或CR-C 亞型蝦青蛋白[18]。而且，同一亞型蝦青蛋白可能在翻譯后發(fā)生酰胺化或糖基化等修飾，從而導(dǎo)致它們的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)等存在差異[19]。由此，克氏原螯蝦cra2 基因?qū)儆赾ra 基因，但是克氏原螯蝦中是否還存在crc 基因有待進(jìn)一步研究。系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，PcCRA2 與紅螯螯蝦、 歐洲龍蝦、美洲龍蝦等聚為一支，說明其與鰲蝦科蝦類有血緣關(guān)系，而與對蝦科蝦類有明顯區(qū)分。

克氏原螯蝦cra2 基因的表達(dá)具有組織特異性，在表皮中表達(dá)量最高。 Tlysty 等人認(rèn)為蝦青素主要在表皮中與蝦青蛋白特異性結(jié)合形成結(jié)合蛋白質(zhì)，而后轉(zhuǎn)移至甲殼中繼續(xù)修飾成不同顏色的多聚體[20]。在羅氏沼蝦中，crc 基因在表皮中的表達(dá)量高于其他組織，且在蛻殼期間比其他生長階段表達(dá)高[21]。干擾該基因后，其在表皮中的表達(dá)量明顯減少，此時(shí)蝦的體色轉(zhuǎn)變成紅色。 另外，李清清等人發(fā)現(xiàn)cra1基因在中華絨螯蟹表皮中表達(dá)相對較高，而crc1 基因和crc2 基因卻在肝胰腺和卵巢中表達(dá)更高[22]。 他認(rèn)為前者可能主要參與蟹的色澤調(diào)控，后者更多地參與卵巢色澤形成和發(fā)育。 由此，克氏原螯蝦cra2基因可能主要參與其體色的形成以及色澤的調(diào)控，但是具體調(diào)控機(jī)制有待后續(xù)研究。

原核系統(tǒng)具有基因修飾簡便、 生產(chǎn)周期較短、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，因而在各種蛋白質(zhì)表達(dá)研究中被廣泛使用。為獲得大量重組PcCRA2，作者采用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)， 并使用目前調(diào)控T7 啟動子效果最優(yōu)的乳糖類似物IPTG 作為誘導(dǎo)劑。 考慮到表達(dá)元件和外界環(huán)境均能影響原核表達(dá)效果，對誘導(dǎo)劑終濃度、誘導(dǎo)起始點(diǎn)、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間等條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明，IPTG 終濃度為0.5 mmol/L和1.0 mmol/L 時(shí)目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)效果較好。 尼羅羅非魚Galectin-4 基因的原核表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，IPTG 濃度在0.4 mmol/L 表達(dá)量最大， 而在0.4～1.0 mmol/L 內(nèi)沒有明顯增加， 與本研究結(jié)果相似[23]。 當(dāng)IPTG 濃度超過1.0 mmol/L 時(shí)，目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)量下降，這可能是IPTG 具有潛在毒性，過量會抑制菌體生長和蛋白質(zhì)表達(dá)[24]。以接種后生長4 h作為起始誘導(dǎo)點(diǎn)，重組PcCRA2 表達(dá)量最大，此時(shí)重組菌處于對數(shù)期。 誘導(dǎo)處于生長遲緩期和穩(wěn)定期的菌體均不利于目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)和積累[25]。 在30 ℃誘導(dǎo)時(shí)，目標(biāo)蛋白質(zhì)表達(dá)效果最好。溫度過低，重組菌生長緩慢，菌體密度不高；溫度過高，重組菌加速增殖，不利于蛋白質(zhì)的表達(dá)，而且容易使目標(biāo)蛋白質(zhì)形成包涵體，增加了后續(xù)純化的難度[26]。誘導(dǎo)6 h 時(shí)，重組PcCRA2 表達(dá)量達(dá)到最大，這與哈維氏弧菌PspF 基因的異源表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果一致[27]。

由于大腸桿菌系統(tǒng)表達(dá)的蛋白質(zhì)主要以包涵體形式存在，容易在生成過程中出現(xiàn)未折疊或錯(cuò)誤折疊等情況而使重組蛋白質(zhì)喪失活性，純化時(shí)需要增加復(fù)性操作[28]。 本研究獲得的目標(biāo)蛋白質(zhì)包涵體占78.2%， 故采用尿素濃度梯度透析法對其進(jìn)行了復(fù)性。 復(fù)性后的純化重組PcCRA2 能與蝦青蛋白特異性結(jié)合， 在265 nm 和505 nm 處出現(xiàn)最大吸收峰。 而Ferrari 等人制備的重組美洲龍蝦蝦青蛋白H2 與蝦青素結(jié)合后，不僅在580 nm 處出現(xiàn)最大吸收峰，還在520 nm 處有肩峰[29]。 此外，重組PcCRA2與蝦青素結(jié)合率（A505/A265）為0.38，略高于Ferrari 等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 雖然結(jié)合效率不高，但是為后續(xù)研究蝦青蛋白亞基與蝦青素的相互作用提供可能。

3 結(jié)語

采用同源克隆獲得了克氏原螯蝦cra2 基因的DNA 和cDNA 序列，RT-qPCR 發(fā)現(xiàn)該基因在克氏原螯蝦9 種組織中均有表達(dá)， 其中表皮表達(dá)量最高。 構(gòu)建了表達(dá)載體pET28a-cra2， 并獲得重組PcCRA2，證實(shí)了該蛋白質(zhì)能與蝦青素特異性結(jié)合。本研究結(jié)果可為獲取重組蝦青蛋白亞基、探究其生物功能提供參考。