孔振翔， 姚延祿， 周新麗

（上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200093）

實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）作為普遍使用的核酸檢測(cè)技術(shù)之一，具有檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)單、高特異性和靈敏度的優(yōu)點(diǎn)[1-2]。 但是，該方法耗時(shí)長(zhǎng)且容易產(chǎn)生假陽性結(jié)果[3]。 微流控芯片技術(shù)可以將核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)等功能集成到一片數(shù)平方厘米的芯片中[4-5]，具有微型化、集成化、高通量、自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)[6]。 微流控PCR 儀將微流控芯片技術(shù)與PCR 技術(shù)相結(jié)合[7]，把檢測(cè)過程中的核酸提取、試劑的預(yù)存儲(chǔ)以及后續(xù)的擴(kuò)增與熒光檢測(cè)環(huán)節(jié)集成在一臺(tái)儀器中，可以減少試劑消耗，提高熱循環(huán)速度，提高檢測(cè)儀器的自動(dòng)化程度，顯著提升檢測(cè)效率[8-10]，解決核酸擴(kuò)增領(lǐng)域中存在氣溶膠污染的問題[11]。

目前， 微流控PCR 儀的研制也存在兩大難點(diǎn)：一是將核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)的功能全部集成在一張芯片上；二是微流控芯片專用PCR 儀所需3 個(gè)溫度的快速、精準(zhǔn)控制。

在擴(kuò)增平臺(tái)的一體化、 自動(dòng)化方面，BioFire 公司的FilmArray 產(chǎn)品使用柔性袋進(jìn)行核酸提取，使用巢式多重PCR 技術(shù)進(jìn)行核酸擴(kuò)增，同時(shí)搭配熒光檢測(cè)， 在相同的血液樣本中可一次檢測(cè)出24 種不同的病原體[12]。 Cepheid 公司研發(fā)的GeneXpert 分子診斷試劑盒和配套使用的全自動(dòng)測(cè)試儀器，采用半導(dǎo)體制冷片對(duì)PCR 反應(yīng)管的上下兩側(cè)進(jìn)行溫度控制，搭配風(fēng)扇散熱，通過熒光組件實(shí)時(shí)測(cè)算PCR 的循環(huán)狀態(tài)[13]。 以上2 種自動(dòng)化核酸檢測(cè)儀器均集成了核酸提取、核酸擴(kuò)增及熒光檢測(cè)全過程，但這些過程并不都在微流控芯片上完成， 還借助了柔性袋、試劑盒等，且核酸提取和溫度控制部分的硬件控制都很復(fù)雜，儀器制造成本較高。

在擴(kuò)增平臺(tái)的溫度控制上，根據(jù)微流控芯片中液體加熱方式的不同，可以分為靜態(tài)微池PCR[14]和連續(xù)流動(dòng)PCR[15]。 李松晶等通過溫控單元對(duì)溶液加熱，使芯片不同區(qū)域之間產(chǎn)生溫差，利用溫差所產(chǎn)生的熱對(duì)流來推動(dòng)溶液循環(huán)流動(dòng)[16]。但是，此方法需使用冷卻液對(duì)溶液降溫，降溫速率不可控，且隨著PCR 擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)行，冷卻液溫度逐漸回升，進(jìn)而會(huì)影響降溫速率。Jung 等設(shè)計(jì)了一種旋轉(zhuǎn)PCR 分析儀，該平臺(tái)使用步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)芯片依次通過3 個(gè)加熱塊，完成基因擴(kuò)增僅需25.5 min[17]。 但是此平臺(tái)只有PCR 擴(kuò)增功能，未集成核酸提取以及檢測(cè)功能。

從以上分析可以看出，要實(shí)現(xiàn)核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)集成，目前仍有一些關(guān)鍵問題需要解決。 作者設(shè)計(jì)并搭建了一套旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)，在步進(jìn)電機(jī)低轉(zhuǎn)速條件下使用微流控芯片可完成基于磁珠法的核酸提取，之后直接利用此旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)擴(kuò)增平臺(tái)完成擴(kuò)增步驟， 實(shí)現(xiàn)核酸提取、擴(kuò)增一體化。首先，作者對(duì)三溫區(qū)PCR 擴(kuò)增平臺(tái)各模塊進(jìn)行功能分析以及機(jī)械結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)，然后對(duì)各模塊進(jìn)行裝配并進(jìn)行溫度測(cè)試，最后使用核酸提取芯片對(duì)大腸桿菌進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳評(píng)估擴(kuò)增效果。 本研究結(jié)果將為實(shí)現(xiàn)核酸提取、擴(kuò)增一體化的微流控PCR 設(shè)備的研發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

光學(xué)級(jí)聚甲基丙烯酸甲酯（polymethylmethacrylate，PMMA）板材：恒心亞克力制品有限公司；聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）膠帶：晨光塑業(yè)有限公司；光學(xué)級(jí)雙面膠：深圳泰贏科技有限公司。

Trans 1k Plus Ⅱ Molecular Marker、10 ×loading buffer、Easy Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、10×EasyTaq buffer（含Mg2+）、dNTPs（2.5 mmol/mL）：北京天根生化科技有限公司。

大腸桿菌（ATCC43895）：中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院動(dòng)植物檢疫所。

二氧化碳激光雕刻機(jī) （VLS2.30）： 美國(guó)UNIVERSAL；超聲波清洗機(jī)（YQ-620C）：上海易凈超聲波儀器有限公司；芯片貼合機(jī)（TBK508）：深圳市深旺達(dá)科技有限公司；核酸提取儀：西安天隆科技有限公司；9700 型PCR 儀： 美國(guó)Applied Bio systems 公司； 超純水儀： 美國(guó)PALL 公司；Mini Protean Ⅲ型電泳槽、PowerPac300 多用電泳儀：美國(guó)Bio-Rad 公司；凝膠成像儀：美國(guó)UVI 公司；ST16 低溫離心機(jī)：北京賽默飛科技有限公司。

1.2 芯片的設(shè)計(jì)與制作

芯片由4 層厚度分別為0.3、2.0、1.0、0.3 mm 的PMMA 板材組成[18]，第一層為蓋板層，包括進(jìn)樣孔以及抽樣孔，進(jìn)樣孔是將裂解混合液進(jìn)入微流控芯片的孔，抽樣孔是將核酸洗脫液抽出進(jìn)行質(zhì)量濃度測(cè)定；第二層為腔室層，主要包括裂解腔、清洗腔1～4、擴(kuò)增腔，用于試劑存儲(chǔ)以及將各腔室隔離，位于通道層之內(nèi)，各腔室的體積分別為163、180、100、180、60、50 μL[19]；第三層為通道層，通道層與腔室層厚度差為1 mm， 利用此厚度差使得磁珠在各腔室之間轉(zhuǎn)移，完成清洗以及洗脫步驟；第四層為底板層，主要用于密封鍵合芯片，其結(jié)構(gòu)見圖1。

微流控芯片的制作采用二氧化碳激光雕刻法。首先使用SolidWorks 軟件設(shè)計(jì)出微流控芯片的三維結(jié)構(gòu)，通過結(jié)構(gòu)分割將芯片劃分為4 層，包括蓋板層、腔室層、通道層及底板層，并使用CAD 軟件繪制各層圖案。 然后，將繪制好的各層幾何圖案通過數(shù)據(jù)傳輸傳送至二氧化碳激光雕刻機(jī)進(jìn)行平面雕刻，雕刻參數(shù)為：功率80 W，速度20 s，PPI 1000，得到各通道層基片。 然后，將雕刻好的各層PMMA基片放入含有去離子水的超聲清洗機(jī)中清洗15 min 并放入烘箱中烘10 min， 再將各層使用光學(xué)級(jí)雙面膠并置于真空貼合機(jī)中鍵合， 鍵合參數(shù)設(shè)置為：真空度100 kPa、鍵合壓力4.2 kg/cm2、鍵合時(shí)間10 min。最后將鍵合后的芯片放入除泡室中，設(shè)置除泡壓力7.5 kg/cm2、除泡10 min，即獲得最終芯片。

1.3 旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)的搭建

旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)，采用空間上溫度循環(huán)代替時(shí)間上溫度循環(huán)的設(shè)計(jì)思路，其整體結(jié)構(gòu)見圖2。根據(jù)擴(kuò)增系統(tǒng)的功能需求，分為溫度控制模塊和旋轉(zhuǎn)循環(huán)模塊。 溫度控制模塊包括陶瓷加熱片和比例-積分-微分 （proportion- integralderivative，PID）恒溫控制器。 旋轉(zhuǎn)循環(huán)模塊包括轉(zhuǎn)軸、步進(jìn)電機(jī)和驅(qū)動(dòng)控制器。

圖2 旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)示意圖Fig. 2Schematic diagram of the rotary three -temperaturezonemicrofluidicPCR amplification platform

1.3.1 溫度控制模塊 采用熱均勻性良好的陶瓷加熱片作為加熱元件，樹莓派開發(fā)板作為中央控制器，通過PID 恒溫控制器XH-W1419 來控制陶瓷加熱片。 在實(shí)際操作中，中央控制器先將設(shè)定的溫度值發(fā)送給恒溫控制器，之后以1 Hz 的頻率讀取溫度傳感器的溫度值，當(dāng)接近設(shè)定值時(shí)，則緩慢改變電壓來維持溫度的穩(wěn)定，同時(shí)將計(jì)算出的溫度值通過串口傳遞給中央處理器。 中央處理器在接收到返回的溫度值后刷新屏幕，實(shí)現(xiàn)溫度的控制與實(shí)時(shí)顯示。

1.3.2 旋轉(zhuǎn)循環(huán)模塊 采用發(fā)熱低的日本山社57步進(jìn)電機(jī)控制微流控芯片的旋轉(zhuǎn)角度，即控制芯片在不同溫度的加熱片上做周期性旋轉(zhuǎn)，從而完成核酸擴(kuò)增過程中的變性、退火、延伸。 同時(shí)，為了承載陶瓷加熱片、PID 恒溫控制器、步進(jìn)電機(jī)、電機(jī)驅(qū)動(dòng)器以及驅(qū)動(dòng)控制器，設(shè)計(jì)一個(gè)旋轉(zhuǎn)循環(huán)轉(zhuǎn)臺(tái)來放置這些配件。 轉(zhuǎn)臺(tái)整體采用不銹鋼材料，且厚重的底板可以保證電機(jī)在高速運(yùn)動(dòng)的狀況下不會(huì)出現(xiàn)位移和抖動(dòng)。 轉(zhuǎn)軸的作用是連接芯片與電機(jī)，實(shí)現(xiàn)電機(jī)動(dòng)力的傳輸。 整個(gè)擴(kuò)增平臺(tái)的運(yùn)行流程見圖3。

圖3 旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)流程圖Fig. 3 Flow chart of rotary three -temperature zone microfluidic PCR amplification platform

1.4 旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)的性能測(cè)試

1.4.1 陶瓷加熱片的性能 為了保證加熱模塊的溫控性能，對(duì)陶瓷加熱片表面的溫度進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性測(cè)試。 通過PID 溫度控制器對(duì)3 個(gè)加熱片設(shè)置3 個(gè)不同溫度（95、55、72 ℃），并在陶瓷加熱片的中心和對(duì)角線位置處放置3 個(gè)熱電偶（a，b，c），用安捷倫34970A 數(shù)據(jù)采集儀對(duì)加熱片表面溫度進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。

1.4.2 升降溫速率 在旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR擴(kuò)增平臺(tái)上，待加熱片加熱至預(yù)設(shè)溫度后，將插有熱電偶探頭的微流控芯片放至離心轉(zhuǎn)臺(tái)。 當(dāng)反應(yīng)腔室轉(zhuǎn)至加熱片上方時(shí)，記錄下此刻的時(shí)間和芯片內(nèi)部溶液的溫度， 待芯片內(nèi)溶液加熱至目標(biāo)溫度后，再次記錄此刻的時(shí)間和芯片溶液內(nèi)部的溫度，即可得到升溫速率。 然后轉(zhuǎn)動(dòng)微流控芯片90°至另一加熱片之上，繼續(xù)記錄相對(duì)應(yīng)的時(shí)間和溫度，得到降溫速率。

1.5 芯片上大腸桿菌的核酸擴(kuò)增

將大腸桿菌加載到微流控芯片中，按照姚延祿的方法[18]，通過磁珠法在微流控芯片中提取核酸，提取到的核酸保存在擴(kuò)增腔中。 在搭建的旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)上，提前對(duì)3 個(gè)加熱片進(jìn)行預(yù)熱。 然后，將芯片上轉(zhuǎn)動(dòng)至第一塊加熱片上方，芯片內(nèi)溶液加熱到95 ℃維持30 s， 完成高溫變性反應(yīng)；再將芯片轉(zhuǎn)動(dòng)90°，到達(dá)第二塊加熱片上方，芯片內(nèi)溶液加熱到55 ℃維持30 s， 完成低溫退火反應(yīng)；繼續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)芯片90°，使反應(yīng)區(qū)到達(dá)第三塊加熱片上方，芯片內(nèi)溶液加熱到72 ℃維持20 s，完成延伸反應(yīng)。至此，完成一輪PCR 反應(yīng)，如圖4 所示。隨后，使芯片繼續(xù)沿同方向轉(zhuǎn)動(dòng)180°， 回到初始位置，按照上述過程，使芯片循環(huán)旋轉(zhuǎn)35 次。

圖4 核酸擴(kuò)增過程示意圖Fig. 4 Schematic diagram of nucleic acid amplification process

在9700 型PCR 儀上，設(shè)置擴(kuò)增程序?yàn)椋涸?5 ℃下初始變性5 min，95 ℃下變性30 s，55 ℃下退火30 s 和72 ℃下延伸20 s 進(jìn)行35 次循環(huán)， 最后在72 ℃下進(jìn)行10 min 的最終延伸。

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后， 取9700 型PCR 儀和微流控芯片中的擴(kuò)增產(chǎn)物各25 μL， 在1 g/dL 瓊脂糖凝膠上使用120 V 電壓電泳30 min，用0.5 mg/L 的溴化乙啶（EB）染色，然后將凝膠置于凝膠成像儀上，在紫外燈照射下觀察并拍攝。

2 結(jié)果與分析

2.1 陶瓷加熱片的性能

通過在陶瓷加熱片的不同位置處放置熱電偶對(duì)其進(jìn)行均勻性和穩(wěn)定性的測(cè)試，可以發(fā)現(xiàn)各個(gè)加熱片上不同測(cè)溫點(diǎn)的溫度曲線近乎重合， 溫度在0.1 ℃的范圍內(nèi)波動(dòng)， 且每個(gè)測(cè)溫點(diǎn)的誤差均在±0.3 ℃的范圍內(nèi)，如圖5 所示。 由此可見，該加熱片上不同位置的溫度波動(dòng)不大，具有良好的溫度均勻性和溫度穩(wěn)定性。

圖5 陶瓷加熱片的溫度均勻性和溫度穩(wěn)定性測(cè)試Fig. 5 Temperature uniformity and stability of ceramic heaters

2.2 升降溫速率

對(duì)芯片腔室內(nèi)溶液的溫度進(jìn)行采集，結(jié)果見圖6。隨著步進(jìn)電機(jī)的轉(zhuǎn)動(dòng)，芯片腔室內(nèi)溶液的溫度也隨之變化， 且芯片腔室內(nèi)溶液的升溫速率為3.5 ℃/s，降溫速率為2.67 ℃/s，完成1 個(gè)PCR 溫度循環(huán)的時(shí)間為110 s。 相較于9700 型PCR 儀，升溫速率提升了約36.19%， 降溫速率提升了約24.77%， 單次PCR溫度循環(huán)縮減了70 s，對(duì)于整個(gè)PCR 擴(kuò)增過程來說（35 次循環(huán)），至少可以節(jié)約40 min，提高核酸擴(kuò)增的效率。

圖6 芯片內(nèi)部溶液的升降溫曲線Fig. 6 Heating and cooling curve of the solution inside the chip

2.3 大腸桿菌核酸擴(kuò)增的結(jié)果

使用旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)與9700 型PCR 儀同時(shí)進(jìn)行PCR 擴(kuò)增， 擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見圖7。 左側(cè)為9700 型PCR 儀擴(kuò)增結(jié)果，右側(cè)為旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)的擴(kuò)增結(jié)果，且左右兩側(cè)5 個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均在369 bp 左右出現(xiàn)條帶，二者亮度基本一致，說明旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)的擴(kuò)增效果和重復(fù)性與9700型PCR 儀基本相同。

圖7 大腸桿菌擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 7 Electropherogram of E. coli

Salman 等提出一種并列式的微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)，該平臺(tái)搭載3 個(gè)加熱片，通過電機(jī)的旋轉(zhuǎn)將微流控芯片加載到相應(yīng)的加熱片上，實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增[20]。但是， 該平臺(tái)升溫速率和降溫速率分別為1.8 ℃/s和2 ℃/s，導(dǎo)致整個(gè)核酸擴(kuò)增的循環(huán)時(shí)間有所延長(zhǎng)。

將9700 型PCR 儀、 單溫區(qū)半導(dǎo)體制冷片微流控芯片、Salman 等搭建的三溫區(qū)PCR 擴(kuò)增平臺(tái)與本研究所搭建的旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)進(jìn)行對(duì)比分析，如表1 所示。 相較于Salman 等搭建的三溫區(qū)PCR 擴(kuò)增平臺(tái)，作者搭建的旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)在升降溫速率上更快，尤其在升溫速率上，提升了將近2 倍。 與其他2 款采用單溫區(qū)的PCR 擴(kuò)增平臺(tái)相比，作者搭建的擴(kuò)增平臺(tái)采用三溫區(qū)分別對(duì)微流控芯片內(nèi)部的溶液進(jìn)行加熱，避免在單個(gè)溫控片上進(jìn)行升降溫操作，提高升降溫速率的同時(shí)也縮短了循環(huán)時(shí)間，并且溫度控制也更加容易。

表1 PCR 擴(kuò)增平臺(tái)性能對(duì)比Table 1 Comparison of PCR amplification performance

3 結(jié)語

微流控芯片與PCR 技術(shù)相結(jié)合雖然取得了很大進(jìn)展，但在微流控芯片的集成度和溫度的控制上仍存在一定的問題。 為此， 作者在微流控芯片與PCR 技術(shù)的基礎(chǔ)上，采用空間上溫度循環(huán)代替時(shí)間上溫度循環(huán)的設(shè)計(jì)思路，搭建了一套旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)，測(cè)量陶瓷加熱片上不同區(qū)域的溫度和單點(diǎn)溫度隨時(shí)間的變化，結(jié)果表明陶瓷加熱片不同區(qū)域之間的溫差在0.1 ℃范圍內(nèi)， 單點(diǎn)的熱穩(wěn)定性在±0.3 ℃范圍內(nèi)，具有較好的熱均勻性和熱穩(wěn)定性。 與其他3 款擴(kuò)增平臺(tái)相比，本平臺(tái)的升降溫速率有著較大的提升，能夠縮減PCR 擴(kuò)增的時(shí)間，提高工作效率。 對(duì)大腸桿菌的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析， 可以發(fā)現(xiàn)本平臺(tái)的電泳條帶亮度與9700型PCR 儀基本一致，但在擴(kuò)增時(shí)間上有著較大的提升，僅需110 s 即可完成單次循環(huán)，在一個(gè)完整的擴(kuò)增周期內(nèi)可以節(jié)約40 min 左右的時(shí)間。旋轉(zhuǎn)式三溫區(qū)微流控PCR 擴(kuò)增平臺(tái)在保證熱均勻性和熱穩(wěn)定性的情況下，簡(jiǎn)化了溫控結(jié)構(gòu)、提升了升降溫速率、縮短了循環(huán)時(shí)間。 未來的研究可以嘗試將核酸檢測(cè)的功能集成到該平臺(tái)上，在微流控芯片上實(shí)現(xiàn)核酸提取、擴(kuò)增、檢測(cè)的功能，實(shí)現(xiàn)平臺(tái)的一體化、自動(dòng)化。