陳愛萍 吳偉東 王瑛 古佳升

[摘 要]目的 探討透明質(zhì)酸栓塞后對動脈壁的影響，以及對白介素1（IL-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）和血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達(dá)差異。方法 將9只白兔采用隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、HA組和結(jié)扎組，各3例。對照組注射生理鹽水，HA組注射透明質(zhì)酸栓塞血管，結(jié)扎組使用外科縫線結(jié)扎動脈血管阻斷血管血流。術(shù)前、注射后1、3、5 d抽取各組兔耳中央動脈栓塞部位遠(yuǎn)心端血液5 ml，實(shí)時熒光PCR法檢測其動脈血中IL-1、MMP9和VEGF表達(dá)水平，并進(jìn)行組間比較。第5天終止實(shí)驗(yàn)，處死所有白兔，取兔耳中央動脈血管壁經(jīng)HE染色后在顯微鏡下觀察。結(jié)果 QPCR結(jié)果顯示：結(jié)扎組與HA組IL-1、MMP9和VEGF的表達(dá)水平均高于對照組（P<0.05）；結(jié)扎組IL-1、MMP9和VEGF表達(dá)水平均高于HA組（P<0.05）。HE染色結(jié)果顯示：對照組動脈壁結(jié)構(gòu)完整；HA組有輕微內(nèi)膜增生；結(jié)扎組內(nèi)膜增生嚴(yán)重，平滑肌層紊亂。結(jié)論 透明質(zhì)酸注射栓塞血管或動脈結(jié)扎血管均可引起動脈血IL-1、MMP9和VEGF表達(dá)水平升高，引起動脈壁重塑，但透明質(zhì)酸注射引起的栓塞較結(jié)扎動脈對IL-1、MMP9和VEGF表達(dá)水平及動脈壁重塑的影響更小。

[關(guān)鍵詞] 透明質(zhì)酸；動脈栓塞；基質(zhì)金屬蛋白酶

[中圖分類號] R543 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1004-4949（2024）01-0036-05

Effects of Hyaluronic Acid Embolization on the Structure of Arterial Wall and the Expression of IL-1， VEGF and MMP9 in Arterial Blood

CHEN Ai-ping1， WU Wei-dong1， WANG Ying2， GU Jia-sheng1

（1.Department of Cardiothoracic Surgery， Guangzhou Red Cross Hospital Affiliated to Jinan University， Guangzhou 510000， Guangdong， China； 2.Guangzhou Xiaoman Waist Medical Equipment Co.， LTD.， Guangzhou 510000， Guangdong， China）

[Abstract]Objective To investigate the effect of hyaluronic acid embolization on arterial wall and the expression of interleukin 1 （IL-1）， matrix metalloproteinase 9 （MMP9） and vascular endothelial growth factor （VEGF）. Methods Nine white rabbits were randomly divided into control group， HA group and ligation group， with 3 rabbits in each group. The control group was injected with normal saline， the HA group was injected with hyaluronic acid to embolize the blood vessels， and the ligation group was ligated with surgical suture to block the blood flow of the blood vessels. 5 ml blood samples were collected before operation and 1， 3 and 5 days after injection， and the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in arterial blood were detected by real-time PCR. All white rabbits were sacrificed on the 5th day， and the vascular wall of the central artery of the rabbit ear was stained with HE and observed under a microscope. Results The QPCR results showed that expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in ligation group and HA group were higher than those in control group （P<0.05）， and the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in the ligation group were higher than those in the HA group （P<0.05）. HE staining results showed that the arterial wall structure of the control group was intact. There was slight intimal hyperplasia in HA group. The intimal hyperplasia was severe and the smooth muscle layer was disordered in the ligation group. Conclusion The expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF in arterial blood can be increased by hyaluronic acid injection embolization or artery ligation， which can lead to arterial wall remodeling. However， the embolization caused by hyaluronic acid injection has less effect on the expression levels of IL-1， MMP9 and VEGF and arterial wall remodeling than that of artery ligation.

[Key words] Hyaluronic acid； Arterial embolism； Matrix metalloproteinase

目前，透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）已經(jīng)廣泛用于皮膚美容，但注射不當(dāng)會引起皮膚壞死、腫塊、脫發(fā)等多種不良反應(yīng)，其中動脈栓塞是HA注射不良反應(yīng)中最嚴(yán)重的并發(fā)癥[1]。由于頭頸面部的血管解剖結(jié)構(gòu)復(fù)雜，注射過程中可能導(dǎo)致HA進(jìn)入血管，引起血管栓塞，并造成組織缺氧、壞死等不良反應(yīng)[2]。近年來，HA注射后血管栓塞引起組織缺氧壞死的機(jī)制有了一定的研究成果[3，4]，但在血管微觀下的影響尚未報道。白細(xì)胞介素1（interleukin-1，IL-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinases 9，MMP9）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）均能通過不同機(jī)制參與血管重構(gòu)[5-7]。HA在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移，但HA引起栓塞后，在血管內(nèi)是否會通過各種機(jī)制加重血管壁的損傷重塑，尚無研究。本實(shí)驗(yàn)就通過構(gòu)建HA引起的動脈栓塞模型，以物理結(jié)扎為對照，評價HA栓塞后短期內(nèi)血管壁在微觀下的改變以及各種細(xì)胞分子的表達(dá)水平。

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 成年實(shí)驗(yàn)雄性新西蘭兔9只，周齡6周，體重3～3.5 kg（購自廣東明珠生物科技有限公司）。動物實(shí)驗(yàn)通過動物倫理審批（倫理審批號：C202307-10），按照《國立衛(wèi)生研究院實(shí)驗(yàn)動物護(hù)理與使用指南》進(jìn)行飼養(yǎng)。兔在室溫（25±2）℃，相對濕度（50±5）%，12 h明暗交替的環(huán)境下分籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，飼養(yǎng)7 d。

1.2 主要試劑與儀器 臺式高速冷凍離心機(jī)[天美儀拓實(shí)驗(yàn)室設(shè)備（上海）有限公司，型號：CT14RDⅡ]；實(shí)時熒光定量PCR儀[閎龍生物科技（上海）有限公司型號CFX96，品牌：BIORAD]；顯微鏡[成貫儀器（上海）有限公司，型號：尼康CI-S]；攤烤片機(jī)（湖北安立信醫(yī)療實(shí)業(yè)有限公司，型號：ATK-7）；脫水機(jī)（型號：JJ-12J）和包埋機(jī)（型號：JB-P5）均購自武漢俊杰電子有限公司；Trizol-RNA提取試劑（湖南艾科瑞生物工程有限公司，型號：AG21101）；注射用透明質(zhì)酸鈉（華熙生物科技股份有限公司，批準(zhǔn)文號：20143132037，規(guī)格：0.5 ml∶10 mg）；熒光素鈉注射液（廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字H44023401，規(guī)格：3 ml）；IL-1、MMP9、VEGF和GADPH引物均由廣州伯信生物科技有限公司提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組 9只白兔采用完全隨機(jī)抽樣法分為對照組，HA組和結(jié)扎組，各3例。對照組注射生理鹽水、HA組注射透明質(zhì)酸，結(jié)扎組使用外科縫線結(jié)扎血管。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1構(gòu)建兔耳中央動脈栓塞模型 固定白兔，去除兔耳被毛，采用7%水合氯醛經(jīng)耳緣靜脈注射麻醉，注射量3.5～4.5 ml/kg體重。待白兔完全麻醉后，留置針刺入兔耳中央動脈，緩慢均勻注射透明質(zhì)酸鈉1 ml，減少血管被動擴(kuò)張及材料向近端動脈的反流。注射完畢后予以加壓包扎穿刺部位，確認(rèn)動脈無漏血后，采用20%熒光素鈉，劑量為15 mg/kg，經(jīng)耳后靜脈外側(cè)支或耳前靜脈注射熒光素鈉，并在紫外光下觀察，確認(rèn)動脈栓塞成功。對照組操作同上，僅注射生理鹽水。結(jié)扎組使用縫線結(jié)扎兔耳中央動脈，保障血流成功阻礙，其余操作同上。分別于0 d（術(shù)前）及術(shù)后1、3、5 d進(jìn)行大體拍照記錄。由于第5天觀察到HA組動脈栓塞的血管開始出現(xiàn)通暢，于是選擇終止了實(shí)驗(yàn)，處死兔后從中央動脈取樣，進(jìn)行后續(xù)HE染色實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 QPCR法檢測兔耳動脈血中IL-1、MMP9和VEGF的表達(dá) 分別在0 d（術(shù)前）及術(shù)后1、3、5 d抽取各組兔耳中央動脈栓塞部位遠(yuǎn)心端血液5 ml，置入離心管，在室溫下以3000 r/min離心12 min，靜置后收集上層清液，使用Trizol試劑提取總RNA，根據(jù)PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆錄。采用2-ΔΔCt法對動脈血液中IL-1、MMP9和VEGF的表達(dá)水平進(jìn)行相對定量分析。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)。引物序列見表1。

1.4.3 蘇木精-伊紅染色實(shí)驗(yàn) 切取兔耳中動脈組織后進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)制片染色，在光學(xué)顯微鏡下找到目標(biāo)部位，拍照。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x-±s）表示，行t檢驗(yàn)；P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.1 兔耳動脈血液IL-1、MMP9和VEGF表達(dá)水平比較 兔耳栓塞部位動脈血液取樣后，QPCR結(jié)果顯示：結(jié)扎組與HA組IL-1、MMP9和VEGF的表達(dá)水平均高于對照組（P<0.05）；結(jié)扎組IL-1、MMP9和 VEGF表達(dá)水平均高于HA組（P<0.05），見圖1。

2.2 HE染色切片結(jié)果 在對照組中，動脈內(nèi)膜、中膜及外膜結(jié)構(gòu)層次整齊、分界清晰，內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞排列整齊有序，中膜完整。在HA組中，動脈腔內(nèi)可見透明質(zhì)酸殘留，少量巨噬細(xì)胞聚集，部分內(nèi)膜結(jié)果破壞，內(nèi)膜外出現(xiàn)一部分平滑肌細(xì)胞，中膜已出現(xiàn)在內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，中膜完整。在結(jié)扎組中，動脈腔內(nèi)大量紅細(xì)胞淤積，可見血栓形成，動脈內(nèi)膜中大量巨噬細(xì)胞聚聚，大量的中膜生長至內(nèi)膜內(nèi)側(cè)，中膜結(jié)構(gòu)遭到破壞，變薄稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂，外膜結(jié)構(gòu)不完整，見圖2。

HA是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，常用于皮膚美容[8]。由于面部血管分支的復(fù)雜性及部分操作者技術(shù)不成熟操作不規(guī)范，血管栓塞事件常有報道[9-11]。研究透明質(zhì)酸栓塞對血管的影響及機(jī)制具有重要意義。在生理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均能產(chǎn)生少量IL-1，但在病理狀態(tài)下如缺氧、炎癥反應(yīng)時，IL-1大量表達(dá)[12]。IL-1在血管損傷后動脈中膜平滑肌細(xì)胞的遷移過程中發(fā)揮重要作用，可抑制IL-1表達(dá)，減輕內(nèi)膜增生[5， 13]，因此IL-1的表達(dá)水平在一定程度能反應(yīng)內(nèi)膜增生的趨勢。MMP9屬于明膠酶，可降解各種膠原和包括彈力蛋白在內(nèi)的多種蛋白[14]。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性結(jié)合生長因子，當(dāng)炎癥、缺氧等原因引起VEGF大量表達(dá)并激活后，VEGF引起血管通透性增加并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和新生血管形成[15，16]。

在正常狀態(tài)下，動脈壁內(nèi)膜中并不存在平滑肌細(xì)胞，在血管損傷后，平滑肌細(xì)胞遷移至內(nèi)膜增生，成為內(nèi)膜的主要細(xì)胞[17]。在本實(shí)驗(yàn)中觀察到，對照組HE染色切片鏡下顯示動脈各層結(jié)構(gòu)清晰完整。在使用HA注射或結(jié)扎引起血管栓塞后，血流動力障礙形成，血管及周圍組織缺氧，誘發(fā)炎癥反應(yīng)，各種炎細(xì)胞聚集，同時IL-1、MMP9及VEGF表達(dá)升高。VEGF引起的血管通透性增加進(jìn)一步誘導(dǎo)炎細(xì)胞聚集，同時促進(jìn)平滑肌細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞增生，MMP9降解動脈壁中細(xì)胞外基質(zhì)各種蛋白的同時，協(xié)同IL-1促進(jìn)平滑肌細(xì)胞從中膜轉(zhuǎn)移至內(nèi)膜，平滑肌細(xì)胞進(jìn)入中膜后繼續(xù)增生，并伴隨平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，促進(jìn)血栓形成或引起動脈狹窄[18]。在第5天在HE染色切片下觀察到HA組動脈的內(nèi)膜中已經(jīng)出現(xiàn)了少量的平滑肌細(xì)胞，動脈內(nèi)膜中僅有少量中膜和巨噬細(xì)胞，但中膜結(jié)構(gòu)仍然完整，結(jié)扎組內(nèi)膜中出現(xiàn)了大量的平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，中膜結(jié)構(gòu)極其紊亂且變薄，IL-1、MMP9和VEGF的表達(dá)水平較HA組更高。HA會在HA酶的作用下降解[19]，且HA引起的栓塞并不會像結(jié)扎血管那樣嚴(yán)重?fù)p傷血管[20]，因此，HA組IL-1、MMP9及VEGF的表達(dá)水平較結(jié)扎組低。

綜上所述，HA栓塞后會引起IL-1、MMP9和VEGF表達(dá)升高，損傷動脈壁正常結(jié)構(gòu)，但較完全阻斷血流引起的栓塞相比，程度較輕微，并不會在栓塞的基礎(chǔ)上進(jìn)一步加重血管結(jié)構(gòu)重塑。本實(shí)驗(yàn)的不足之處是僅能確定HA引起的栓塞會引起IL-1、MMP9和VEGF表達(dá)升高和動脈壁重塑，但不能確定HA是否參與了這個過程，HA是否會引起動脈壁重塑，或在栓塞時保護(hù)血管免受重塑，其機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

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收稿日期：2023-11-17 編輯：扶田