徐邱鴻等

[摘要] 目的 探討外源性骨橋蛋白（OPN）對(duì)卵巢癌細(xì)胞（SKOV3）生長(zhǎng)及遷移侵襲能力的影響。 方法 選用SKOV3及人正常卵巢上皮細(xì)胞（IOSE80）。應(yīng)用Elisa及蛋白印跡方法檢測(cè)OPN含量。CCK8方法測(cè)定細(xì)胞增殖。劃痕實(shí)驗(yàn)及小室穿梭實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞遷移侵襲能力。蛋白印跡的方法檢測(cè)細(xì)胞信號(hào)通路活化及蛋白表達(dá)量。 結(jié)果OPN的分泌量及表達(dá)量在SKOV3細(xì)胞中均高于IOSE80（P均<0.05）。OPN濃度分別為20、50、80、110 ng/mL時(shí)，均促進(jìn)了SKOV3的增殖（P均<0.05）?？瞻讓?duì)照組及OPN（50 ng/mL）組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)面積分別為（26.1±0.9）%和（42.9±1.5）%（P<0.05）?？瞻讓?duì)照組與OPN（50 ng/mL）組跨膜細(xì)胞數(shù)量分別為（165±7.63）個(gè)/孔和（333.3±8.8）個(gè)/孔（P<0.05）。OPN（50 ng/mL）干預(yù)15 min明顯上調(diào)磷酸化Akt及MMP2表達(dá)量。應(yīng)用PI3K抑制劑預(yù)處理后，OPN（50 ng/mL）干預(yù)對(duì)磷酸化Akt及MMP2表達(dá)量沒有明顯影響。 結(jié)論 SKOV3比IOSE80表達(dá)分泌更多OPN。外源性O(shè)PN促進(jìn)了SKOV3的增殖、遷移侵襲能力。OPN激活PI3K通路上調(diào)MMP2是可能機(jī)制之一。

[關(guān)鍵詞] 卵巢癌；骨橋蛋白；基質(zhì)金屬蛋白酶

[中圖分類號(hào)] R737.31 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2014）36-0001-04

Osteopontin promote proliferation， migration and invasion of the ovarian cancer cell line

XU Qiuhong1 LU Qingling1 CHEN Hongyu1 WANG Mingfang1 MA Xiuyan1 LOU Xiuhui1 YU Xin2 SONG Lixin2 WANG Qian2 WANG Li1

1.Department of Gynaecology and Obstetrics， Heilongjiang Provincial Hospital， Harbin 150030，China； 2.Harbin University of Science and Technology， Harbin 150080， China

[Abstract] Objective To investigate the impact of osteopontin（OPN） on proliferation and invasion of ovarian cancer cell line （SKOV3）. Methods Routinely cultured SKOV3 cells were treated with OPN for certain times. And cell numbers were measured using CCK8. The cell migration and invasion were assessed by wound healing test and transwell chamber assay， respectively. Elisa and western blotting were used to detect the protein expressions of p-Akt， Akt and MMP2. Results Compared with IOSE80 cells， SKOV3 secreted and expressed more OPN （P<0.05）. Compared with control group， 20， 50， 80， 110 ng/mL OPN promote proliferation of SKOV3 cells（P<0.05）. SKOV3 cells treated with 50 ng/mL OPN showed increased ability of migration and invasion （both P<0.05）. 50 ng/mL OPN treated for 15 minutes significantly increased the phosphorylation of Akt and the protein expressions of MMP2 of SKOV3. Specifically blocked the phosphorylation of PI3K inhibited the phosphorylation of Akt and the protein expressions of MMP2 when treated with OPN. Conclusion OPN could promote the migration and invasion of SKOV3 cells possibly by regulating the phosphorylation of PI3K and the expression of MMP2.

[Key words] Ovarian cancer；Osteopontin；Matrix metalloproteinase

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤，其發(fā)病隱匿，轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高，嚴(yán)重影響疾病治療及預(yù)后。CA125是目前卵巢癌的主要血清學(xué)標(biāo)志物，但仍有約30%患者表達(dá)陰性[1]。近年來(lái)多種新的卵巢癌標(biāo)志物被提出，其中骨橋蛋白（osteopontin， OPN）備受關(guān)注[2]。但是，OPN對(duì)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移侵襲能力所起作用至今仍未明確闡明。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探討OPN對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3生長(zhǎng)及遷移侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

OPN（4264，Sigma）、anti-OPN（ab91655，Abcam）、AKT（9272，cell signaling technology）、p-AKT（9271，cell signaling technology）、MMP2（ab110186，Abcam），GAPDH（上海威奧生物）、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（碧云天）、PI3K抑制劑（LY294002， Cell Signaling Technology）、OPN ELISA Kit（上海信然生物），DMEM高糖培養(yǎng)液（吉諾生物）、澳洲牛血清（Biosun），PBS（吉諾生物）、0.25%胰酶-EDTA（吉諾生物）、吉姆薩染液（南京建成生物公司）、CCK8 Kit（碧云天）、RIPA、PMSF、磷酸酶抑制劑及蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、蛋白印跡配膠試劑盒（碧云天）。

1.2 細(xì)胞株

SKOV3卵巢癌細(xì)胞株及IOSE80人正常卵巢上皮細(xì)胞購(gòu)于上海斯信生物。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清液收集

接種培養(yǎng)細(xì)胞至覆蓋約85%～90%，PBS洗3遍，無(wú)血清DMEM培養(yǎng)12 h。取培養(yǎng)液，于-20℃保存。

1.4 細(xì)胞增殖測(cè)定

按4×103個(gè)/mL將單細(xì)胞懸液0.1 mL接種至96孔板，加入不同濃度的OPN培養(yǎng)液（20、50、80、110 ng/mL）培養(yǎng)， OPN（0 ng/mL）培養(yǎng)液為對(duì)照組。在不同時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用CCK8法測(cè)量450 nm波長(zhǎng)的吸光度值以反映細(xì)胞增殖情況。每組3個(gè)復(fù)孔。

1.5 細(xì)胞遷移侵襲能力測(cè)定

遷移實(shí)驗(yàn)：接種培養(yǎng)細(xì)胞至覆蓋約85%～90%，無(wú)菌10 μL槍頭均勻劃痕，以O(shè)PN（50 ng/mL）培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞遷移，OPN（0 ng/mL）培養(yǎng)液為對(duì)照組，每組3個(gè)復(fù)孔。采用ImageJ軟件分析細(xì)胞運(yùn)動(dòng)面積。侵襲實(shí)驗(yàn)：Matrigel在4℃自然融化過(guò)夜，用預(yù)冷的無(wú)血清培養(yǎng)液以1∶8比例稀釋。取稀釋后的Matrigel加入transwell小室，將小室放入24孔板，37℃孵育4 h呈凝膠狀。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，用無(wú)血清培養(yǎng)液稀釋調(diào)整濃度到1×106個(gè)/mL，每上室加入0.2 mL。下室加入10%血清培養(yǎng)液，每組3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h后取上室，棉簽擦去Matrigel膠及上室內(nèi)細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min。吉姆薩染色20 min后拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞量。

1.6 蛋白印跡測(cè)定細(xì)胞信號(hào)通路

OPN（50 ng/mL） 培養(yǎng)液作用15 min，在冰上裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白。OPN（0 ng/mL）培養(yǎng)液為對(duì)照組。測(cè)定蛋白濃度，每孔蛋白上樣量約50 μg。根據(jù)說(shuō)明書配置SDS-PAGE膠（濃縮膠為5%，分離膠為12%）。恒壓電泳（120V）至溴酚藍(lán)脫落，4℃下恒壓（100V）轉(zhuǎn)膜3 h。5%TBSA室溫封閉1 h，4℃一抗（1∶1000）過(guò)夜。TBST洗膜3次，每次5 min。二抗（1：4000）室溫1 h。TBST洗膜3次，每次5 min，用化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）于凝膠成像系統(tǒng)曝光，ImageLab3.0定量分析結(jié)果。

1.7 細(xì)胞培養(yǎng)上清液OPN測(cè)定

加入稀釋好的標(biāo)準(zhǔn)品于反應(yīng)孔中。立即加入50 μL的生物素標(biāo)記抗體。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30 s，甩去液體，用吸水紙拍干。重復(fù)操作4次。加入底物50 μL，輕輕振蕩均勻，避光37℃溫育5 min。取出酶標(biāo)板，迅速加入50 μL終止液，立即上機(jī)測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的各孔吸光值。每孔3個(gè)復(fù)孔。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SKOV3及IOSE80細(xì)胞株OPN表達(dá)量測(cè)定

取兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清液應(yīng)用ELISA測(cè)定OPN含量，結(jié)果SKOV3分泌量（23.79±0.48）ng/mL顯著高于IOSE80（11.09±0.76）ng/mL（t=15.31，P<0.05）。SKOV3細(xì)胞OPN蛋白表達(dá)量亦高于IOSE80細(xì)胞。見表1、圖1。

圖1 人正常卵巢上皮細(xì)胞株與卵巢癌細(xì)胞株OPN表達(dá)量比較

注：左圖為Elisa測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中分泌OPN的含量，SKOV3分泌量（23.79±0.48）ng/mL顯著高于IOSE80（11.09±0.76）ng/mL，（t=15.31，P<0.05）；右圖為蛋白印跡法測(cè)定兩細(xì)胞株總蛋白中OPN的表達(dá)量，SKOV3表達(dá)量高于IOSE80

表1 人正常卵巢上皮細(xì)胞株與卵巢癌細(xì)胞株OPN（ng/mL）分泌表達(dá)量

2.2 OPN對(duì)SKOV3增殖影響

培養(yǎng)3 d時(shí)，不同濃度OPN對(duì)SKOV3增殖均起到促進(jìn)作用，且與對(duì)照組相比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（OPN濃度為20、50、80、110 ng/mL的四組與對(duì)照組比較，t=5.051、22.26、21.64、28.02，P均<0.05）。對(duì)OPN濃度為20、50、80、110 ng/mL四組行方差分析，得到P<0.05（F=74.51，df（組間）=4，df（組內(nèi)）=10）（表3），再采用Bonferroni方法行兩兩比較，發(fā)現(xiàn)50、80、110 ng/mL組與20 ng/mL組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均<0.05），而三組之間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)培養(yǎng)4 d時(shí)的細(xì)胞增殖結(jié)果分析，結(jié)果與培養(yǎng)3 d相似。見表2、圖2。

圖2 OPN對(duì)SKOV3增殖影響

注：不同濃度組外源性O(shè)PN對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖均有明顯促進(jìn)作用。50、80、110 ng/mL組的促進(jìn)增殖能力相當(dāng)，且優(yōu)于20 ng/mL組。圖示為各組與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01

表2 OPN對(duì)SKOV3增殖影響（x±s）

表3 細(xì)胞增殖第4天方差檢驗(yàn)Bonferroni多組配對(duì)檢驗(yàn)t值

注：*P<0.05，**P<0.01

2.3 OPN對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)照組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)面積為總劃痕面積（26.1%±0.9），OPN（50 ng/mL）組細(xì)胞運(yùn)動(dòng)面積為總劃痕面積（42.9%±1.5）。50 ng/mL OPN明顯促進(jìn)了SKOV3細(xì)胞的遷移距離（t=9.15，P<0.05）。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果示對(duì)照組與OPN（50 ng/mL）組跨膜細(xì)胞數(shù)量分別為（165±7.63）個(gè)/孔和（333.3±8.8）個(gè)/孔。50 ng/mL OPN明顯促進(jìn)了SKOV3細(xì)胞的侵襲能力（t=14.43，P<0.05）。見圖3。

圖3 OPN對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響

注：上圖：與對(duì)照組相比，OPN50 ng/mL顯著提高了細(xì)胞遷移面積；下圖：兩組細(xì)胞穿越小室細(xì)胞染色（吉姆薩染色）

2.4 OPN影響SKOV3細(xì)胞信號(hào)通路激活并提高M(jìn)MP2表達(dá)

采用蛋白印跡的方法檢測(cè)OPN對(duì)SKOV3細(xì)胞信號(hào)通路的影響。結(jié)果提示，OPN 50 ng/mL培養(yǎng)15 min時(shí)，Akt發(fā)生磷酸化激活。OPN 50 ng/mL培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞總蛋白分析，發(fā)現(xiàn)MMP2表達(dá)增高。見圖4。

圖4 OPN激活SKOV3 PI3K通路且提高M(jìn)MP2表達(dá)

2.5 阻斷Akt通路激活，抑制OPN引起的MMP2表達(dá)提高

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)SKOV3細(xì)胞分別應(yīng)用LY294002（50 μmol/L）和對(duì)照DMSO處理6 h，再加用OPN 50 ng/mL處理15 min。提取細(xì)胞總蛋白用蛋白印跡檢測(cè)p-Akt及MMP2的量。LY294002抑制了OPN對(duì)Akt的激活，同時(shí)抑制了MMP2表達(dá)提高。見圖5。

圖5 阻斷PI3K通路激活，抑制OPN引起的MMP2表達(dá)提高

3 討論

卵巢癌患者死亡率一直居高不下，一方面原因是約70%患者在確診時(shí)疾病已是晚期，另一方面很重要的原因是腫瘤易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移，且患者在接受手術(shù)或化療后，也許經(jīng)過(guò)了幾個(gè)月或幾年的無(wú)疾病間期（disease-free intervals），但是疾病復(fù)發(fā)仍難避免。腫瘤細(xì)胞的腹腔種植是主要的卵巢癌轉(zhuǎn)移途徑。現(xiàn)今，卵巢癌轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的機(jī)制仍未闡明。但是，腫瘤微環(huán)境的改變及其對(duì)腫瘤表型的調(diào)節(jié)作用在腫瘤細(xì)胞的遷移、侵襲上起到重要作用[3]。

OPN是一種44kDa的帶負(fù)電荷的鈣結(jié)合糖基化磷蛋白。其在體內(nèi)廣泛存在且參與多種生理過(guò)程，如損傷修復(fù)、膠原原纖維形成、骨修復(fù)、巨噬細(xì)胞與中性粒細(xì)胞遷移以及血管形成。然而新的研究發(fā)現(xiàn)，異常升高的血清OPN濃度與包括肺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生相關(guān)[4]。目前在卵巢癌的研究中認(rèn)為OPN是有效的卵巢癌血清標(biāo)記物之一，并且與卵巢癌的發(fā)生及進(jìn)展相關(guān)[2]，抑制OPN的表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力[5]。我們研究探討了外源性O(shè)PN對(duì)卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖及遷移侵襲能力的影響，闡明外源性O(shè)PN通過(guò)激活PI3K通路并提高了MMP2的表達(dá)，從而促進(jìn)了SKOV3的增殖及遷移侵襲能力。

通過(guò)比較培養(yǎng)液中的分泌OPN及總細(xì)胞蛋白中的胞內(nèi)OPN含量，我們發(fā)現(xiàn)SKOV3比較于IOSE80表達(dá)且分泌更高的OPN。提示盡管OPN在體內(nèi)表達(dá)、分布廣泛，但在卵巢癌細(xì)胞中的表達(dá)量的確有異常增高。進(jìn)而，我們研究了外源性O(shè)PN對(duì)SKOV3增殖能力的影響，結(jié)果提示各濃度的外源性O(shè)PN對(duì)SKOV3均有促進(jìn)增殖的作用，并且該作用呈濃度依賴性。但是，當(dāng)外源性O(shè)PN濃度達(dá)到50 ng/mL時(shí)，繼續(xù)提高濃度，其對(duì)SKOV3的促進(jìn)作用不再有明顯增高。與Dan Lu等針對(duì)151例卵巢癌患者血清OPN濃度的研究結(jié)果相似。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)進(jìn)展期卵巢癌患者血清OPN濃度均值約55 ng/mL，并且絕大多數(shù)患者血清OPN濃度小于100 ng/mL，而疾病穩(wěn)定的患者其血清OPN均值約35 ng/mL，并且絕大多數(shù)患者血清OPN濃度小于50 ng/mL[6]。

根據(jù)梯度外源性O(shè)PN濃度對(duì)SKOV3增殖能力實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，我們選擇采用50 ng/mL濃度檢測(cè)OPN對(duì)SKOV3細(xì)胞遷移侵襲能力的影響。結(jié)果提示外源性O(shè)PN對(duì)SKOV3細(xì)胞的遷移、侵襲能力有明顯的促進(jìn)作用。曾有研究提示OPN促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲能力可能是通過(guò)上調(diào)MMP2和MMP9的表達(dá)[7-9]。MMP2和MMP9屬于鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，主要降解Ⅳ、Ⅴ型膠原、纖維連接蛋白及彈性蛋白。一方面通過(guò)降解腫瘤基質(zhì)使得腫瘤細(xì)胞突破基質(zhì)屏障，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移，另一方面可誘導(dǎo)新生血管形成，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散[10]。同樣，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示外源性O(shè)PN可以上調(diào)MMP2，并且可能是其促進(jìn)SKOV3細(xì)胞的遷移及侵襲能力的機(jī)制之一。

在對(duì)信號(hào)通路的研究中，我們的結(jié)果提示外源性O(shè)PN很可能是增強(qiáng)了Akt的磷酸化激活進(jìn)而提高了MMP2的表達(dá)。曾有研究提示，OPN與其配體CD44配接可募集細(xì)胞膜表面的整合素，并分別活化PI3K依賴及PLC-γ依賴的Akt磷酸化激活[11]。本實(shí)驗(yàn)中，我們應(yīng)用了PI3K特異抑制劑（LY294002），發(fā)現(xiàn)當(dāng)阻斷了PI3K的激活SKOV3細(xì)胞的MMP2表達(dá)量隨之下調(diào)，提示外源性的OPN主要是引起了PI3K依賴的Akt磷酸化激活并進(jìn)而提高了SKOV3細(xì)胞的MMP2表達(dá)量。

近年來(lái)，篩選卵巢癌早期診斷的血清學(xué)標(biāo)志物是研究重點(diǎn)，而OPN作為特異性及敏感性均較好的血清學(xué)標(biāo)志物備受矚目。本研究提示，卵巢癌腫瘤細(xì)胞分泌的過(guò)多的OPN不僅可作為以篩選、診斷的指標(biāo)，同時(shí)也能夠以自分泌的形式作用于腫瘤細(xì)胞本身，對(duì)其增殖及侵襲產(chǎn)生一定的促進(jìn)作用。

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（收稿日期：2014-10-24）

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（收稿日期：2014-10-24）

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（收稿日期：2014-10-24）