宋磊+孟國(guó)慶+郭燕風(fēng)+王傳寶+王宜磊

摘要：本研究利用乙醇初步提取發(fā)酵液中透明質(zhì)酸，確定最佳提取方案為乙醇體積分?jǐn)?shù)60%，洗滌次數(shù)為兩次。然后，以透明質(zhì)酸含量為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用根據(jù)Box-Behnken原理設(shè)計(jì)的響應(yīng)面法優(yōu)化透明質(zhì)酸純化工藝。方差分析和交互作用分析表明，最佳純化工藝為NaCl濃度45 g/L，溫度55℃，pH值9.6，在此工藝條件下，透明質(zhì)酸含量為93.71%。本工藝所生產(chǎn)的透明質(zhì)酸純度較高，符合化妝品、醫(yī)藥行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：透明質(zhì)酸；發(fā)酵液；分離純化；響應(yīng)面

中圖分類號(hào)：TS218文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2017）03-0134-06

AbstractIn this research， the hyaluronic acid was preliminarily extracted from fermentation broth using alcohol. The best extraction parameters were ethanol volume fraction of 60% and washing for two times. Using the content of hyaluronic acid as indicator， single-factor experiments were performed. Then the response surface analysis based on Box-Behnken experimental design was carried out to optimize the purification process of hyaluronic acid. Through analysis of variance and interaction， the optimal purification process was NaCl additive amount of 45 g/L， temperature of 55℃ and pH value of 9.6. Under the optimized conditions， the actual content of hyaluronic acid reached up to 93.71%. By this process， the content of hyaluronic acid was higher， which conformed to the stands of cosmetic and pharmaceutical industries， so it had extensive application value.

KeywordsHyaluronic acid； Fermentation broth； Separation and purification； Response surface

透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）是一種高分子量的酸性黏多糖，由N-乙酰葡萄糖胺和葡萄糖醛酸通過(guò)β-1，4和β-1，3糖苷鍵反復(fù)交替連接而成[1]，由于其獨(dú)特的流變學(xué)特性、黏彈性、保濕性以及良好的生物相容性，透明質(zhì)酸在化妝品、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用[2]。透明質(zhì)酸用于食品領(lǐng)域還處于起步階段。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外關(guān)于HA口服后吸收、代謝和功效的研究越來(lái)越多，大量科學(xué)證據(jù)證明了其功效。特別是2008年5月，國(guó)家衛(wèi)生部按照《新資源食品管理辦法》的規(guī)定發(fā)布相關(guān)公告，批準(zhǔn)透明質(zhì)酸鈉作為一種新資源食品用于保健食品原料。這一公告的發(fā)布必將進(jìn)一步推動(dòng)HA在我國(guó)保健食品中的應(yīng)用。

微生物發(fā)酵法是目前透明質(zhì)酸的主要生產(chǎn)方式，而下游分離純化工藝是獲得高純度HA的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，也是制約多數(shù)企業(yè)生產(chǎn)高標(biāo)準(zhǔn)透明質(zhì)酸的瓶頸。根據(jù)透明質(zhì)酸國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，成品中熱源蛋白質(zhì)含量越低，透明質(zhì)酸含量越高，產(chǎn)品質(zhì)量越高。因此，除去發(fā)酵液中的熱源蛋白是透明質(zhì)酸分離純化的首要任務(wù)。

依據(jù)文獻(xiàn)，從發(fā)酵液中分離提純透明質(zhì)酸主要有大量稀釋膜濾法、季銨鹽法、氯仿法、酶法、離子交換層析等[3-5]，這些方法存在生產(chǎn)成本高、操作復(fù)雜、純度和回收率低、環(huán)境不友好等諸多缺點(diǎn)，不利于在工業(yè)中應(yīng)用。本研究利用乙醇對(duì)發(fā)酵液中透明質(zhì)酸進(jìn)行初步粗提，之后采用響應(yīng)面法優(yōu)化純化工藝，得到了純度和產(chǎn)率都較高的透明質(zhì)酸，并在山東某透明質(zhì)酸生產(chǎn)工廠得到應(yīng)用，具有較大的實(shí)際生產(chǎn)參考價(jià)值。

1材料與方法

1.1材料與儀器

透明質(zhì)酸發(fā)酵液：山東某透明質(zhì)酸生產(chǎn)公司提供；β-葡萄糖醛酸：購(gòu)自Sigma公司；牛血清白蛋白（BSA）：購(gòu)自北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；其他試劑均為分析純；水為二次去離子水。

UV-1910型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析），D2F-6090真空烘箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），LXJ-ⅡB 低速大容量離心機(jī)（上海精密儀器儀表有限公司），79480型真空冷凍干燥機(jī)（Labconco 公司），ALC-1100型電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1工藝流程透明質(zhì)酸發(fā)酵液→乙醇粗提→洗滌→溶解→純化→過(guò)濾→調(diào)整pH值→95%乙醇沉淀→真空冷凍干燥→成品。

1.2.2透明質(zhì)酸粗提①粗提乙醇體積分?jǐn)?shù)的選擇：在快速攪拌下，分別向1 000 mL新鮮HA發(fā)酵液中加入95%的乙醇，使混合液中乙醇終體積分別控制在30%、40%、50%、60%、70%。加入過(guò)程需緩慢，避免大結(jié)塊沉淀產(chǎn)生。加入完畢后快速攪拌10 min，靜置1 h后置于1 000 r/min離心機(jī)中離心5 min。取沉淀，測(cè)HA含量，考察添加不同體積乙醇對(duì)于HA提取量的影響。②洗滌次數(shù)的確定：取離心后沉淀，加入300 mL 95%乙醇進(jìn)行洗滌，洗滌次數(shù)分別為1、2、3次?？疾煜礈齑螖?shù)對(duì)于溶液透光率、HA提取量的影響。③透明質(zhì)酸溶解方案的確定：取洗滌后沉淀，加入1 500～4 000 mL去離子水進(jìn)行溶解。以溶解后粘度作為確定溶解相應(yīng)方案的指標(biāo)。