閆彩霞+張浩+李春娟+趙小波+王娟+單世華

摘要：為明確黃曲霉（Aspergillus flavus L.）侵染后花生（Arachis hypogaea）種仁的細胞學變化及抗黃曲霉相關種質的群體結構，將黃曲霉菌接種于高抗侵染種質J11和高感病種質泉花10號上，制成石蠟切片，數(shù)碼顯微鏡下觀察籽仁結構變化。結果顯示，與抗侵染種質相比，黃曲霉侵染對感病種質的胚細胞組織破壞更嚴重，其發(fā)生遠早于黃曲霉在種皮上的定殖。根據(jù)46個SSR位點的等位變異矩陣，利用Structure 2.3.3軟件，采用基于貝葉斯數(shù)學模型的聚類方法對48個抗感黃曲霉相關材料進行群體結構檢測，將供試材料劃分為兩大類4個亞群，分別命名為POP1、POP2、POP3和POP4，各亞群包含的材料數(shù)依次為8、13、9和15，另有3份材料屬于混合亞群。利用NTSYS-pc 2.l0e以UPGMA法對全部種質進行PCoA分析，分組結果與群體結構中亞群劃分結果比較吻合，兩種分組結果均與種質的抗性特點有明顯的相關性。

關鍵詞：花生；黃曲霉；顯微結構；群體結構；PCoA分析

ZTFLH：S435.652 文獻標識碼：A

Abstract： To clarify the cytological change of peanut seeds after Aspergillus flavus L. infection and population structure of 48 resistant-related genotypes， A. flavus was inoculated into high-resistant peanut genotype J11 and susceptible peanut genotype Quanhua 10， and then the paraffin section of seeds were observed under a digital microscope. The results showed that the tissues of embryo cells of susceptible genotype were more seriously damaged than those of resistant genotype， and the cell disintegration and nutrient loss occurred earlier than the colonization of A. flavus in seed coat. Using the allele array of 46 SSR loci covering peanut genome and Bias mathematical model， 48 genotypes were divided into four conservative subpopulations named POP1， POP2， POP3 and POP4， which contained 8， 13， 9 and 15 accessions respectively， and the other 3 accessions belonged to mixed subpopulation. By UPGMA clustering method of NTSYS software， principal component analysis divided all accessions into four quadrants， the result was basically in accordance with the composition of subpopulations. Two grouping results were both obviously correlated with the resistant characteristics of peanut genotypes.

Key words： Peanut； Aspergillus flavus； Microstructure； Population structure； PCoA analysis

ZTFLH：S435.652； Document code：A

黃曲霉毒素（aflatoxin）主要是由黃曲霉菌（Aspergillus flavus L.）侵染花生、玉米、大米、大豆以及堅果類寄主后產生的一類次級代謝產物，具有極強的毒性和致癌特性[1-4]，嚴重威脅食品安全和人類健康。我國是世界上花生黃曲霉毒素污染較為嚴重的國家。中國農業(yè)科學研究院油料作物研究所對全國22個省市區(qū)的花生仁和花生油進行了黃曲霉毒素檢測，結果花生仁污染率為26.3%，花生油的污染率為47.3%[5]。黃曲霉毒素對花生的污染主要發(fā)生在兩個階段：一是在收獲前，土壤中發(fā)育莢果受黃曲霉菌侵染并產毒；二是在收獲后的干燥、貯藏及加工階段。花生結莢期遭遇干旱、高溫天氣，尤其是當種子含水量降至31%以下以及溫度為28～30.5℃時，莢果很容易被黃曲霉菌侵染[6，7]。花生莢果的成熟程度和破損程度也與黃曲霉毒素污染有很大關系，不成熟的、較小的、過熟的以及昆蟲引起的受傷莢果，黃曲霉毒素的污染程度顯著高于完整莢果[8]?；ㄉ斋@后，含水量逐漸下降，當莢果含水量降至12%～30%時，極易感染黃曲霉（高度危險期），毒素污染程度與莢果干燥時間、貯藏花生含水量呈正相關[9]。

國內外多年研究結果表明，花生對黃曲霉毒素污染的抗性主要有兩種類型：一種是基于種皮結構及生化成分的抗性，即抗侵染，黃曲霉菌在具有這種抗性的花生上很難侵染和定殖；另一種是抗產毒，即在黃曲霉菌侵染后抑制其產生毒素，該抗性與花生的種皮及胚均有關系[10，11]。顯微和超顯微觀察顯示，抗性品種細胞壁較厚、表皮細胞間結合緊密、柵欄組織細胞層較密和厚、裂縫和氣孔較少等；感病品種的種皮細胞壁相對較薄、細胞間結合較疏松、裂縫和氣孔較大[12， 13]。此外，品種的抗性與種臍的結構有一定的關系，通?？剐云贩N的種臍較小且關閉，而感病品種種臍較長且開放[14]?？剐云贩N種皮蠟質層較厚，滲透性低，具有較多的木質素和酚類化合物，在莢果的中心區(qū)域有密集的木質化細胞，在正常的情況下不易破損[15-17]，而感病品種則反之。

不同花生品種或種質對黃曲霉侵染抗性的差異以及表現(xiàn)方式為抗黃曲霉種質資源的篩選提供了理論依據(jù)和研究基礎。Gopalan[18]首先在世界范圍內鑒定出了第一個抗黃曲霉產毒花生種質US26。Mixon和Rogers[19]最早報道了兩個抗黃曲霉侵染的花生種質P1337394F和P1337409，種子侵染率在5%以下。Mixon[20]在1986年又鑒定出GFA-l、GFA-2、AR-1、AR-2、AR-3、AR-4等6個抗侵染花生種質。Pua等[21]報道了4個抗侵染花生種質ACC63、CES48-30、Celebes和UplPN4。Mehan等[22]發(fā)掘出UF71513、Ah7223、J11、Var.27、RMP12等近20份抗侵染花生種質。Wilson等[23]鑒定出低產毒花生品種Tifton-8。Waliyar[24]證實了花生J11、55-437、ICGV81707、ICGV87094、ICGV87110的田間侵染抗性。Xiao等[25]鑒定出兩個產毒量較低的花生種質91322、91048。以上品種均是由田間侵染鑒定獲得的，受環(huán)境影響較大，耗時耗力且易對環(huán)境造成污染。分子標記及基因組測序技術的發(fā)展為花生黃曲霉抗性篩選和鑒定提供了有力的研究手段。Hong等[26]鑒定到5個和抗黃曲霉侵染高度相關的SSR標記，其中標記pPGSseq19D9能區(qū)分所有的抗感品種。黃莉等[27]檢測到16個SSR位點與黃曲霉侵染病情指數(shù)、黃曲霉產毒量相關聯(lián)，表型變異解釋率為5.23%～17.19%。Wang等[28]比較了收獲后黃曲霉侵染的抗感花生品種的轉錄組表達模式，得到了842個防御相關基因。

到目前為止，有關抗感黃曲霉花生超微結構差異的研究主要集中于種皮，且未施加任何處理，針對侵染后花生胚的發(fā)育動態(tài)、抗病種質的群體結構、抗黃曲霉與抗旱、抗旱與抗其他真菌病的關系等的研究均鮮見報道。本研究利用數(shù)碼顯微鏡觀察黃曲霉菌侵染后花生胚細胞的顯微結構變化、SSR標記檢測抗感黃曲霉相關種質的群體結構以及利用PCoA分析抗病種質間的遺傳關系，從組織病理學和群體分化角度探討花生對黃曲霉的抗性機制，為花生抗病育種提供有價值的抗源材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞顯微結構觀察材料 試驗對象為高抗黃曲霉侵染花生種質J11和高感黃曲霉侵染花生種質泉花10號（Quanhua10），種仁表面用70%乙醇均勻消毒，無菌水沖洗，種植于盛有滅菌土壤的花盆中，25～30℃溫室培養(yǎng)。

1.1.2 群體結構分析材料 選用國內外已鑒定的48份抗感黃曲霉相關種質為材料（包括7份抗其它真菌和8份抗旱種質，見表1），每份資源材料選取3粒種子，水培法生長至三片真葉出現(xiàn)，剪取三片幼葉液氮研磨，CTAB法提取基因組DNA備用，工作濃度為30 ng/μL。

1.2 試驗方法

1.2.1 黃曲霉菌的培養(yǎng)和侵染 產黃曲霉毒素菌株A. flavus 2810來自福建農林大學油料作物研究所，在察氏培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)7 d后，用無菌水沖洗，配制成濃度為1×106 個/mL的孢子懸浮液，接種玉米粕，待玉米粕長滿綠色的黃曲霉菌后備用。將J11和泉花10號花生材料分別分試驗組和對照組，每組10株，分別種植在不同的鑒定池中，收獲前30 d開始對試驗組和對照組花生植株分別進行干旱處理，試驗組于處理15 d后撥開根周土壤，將玉米粕均勻灑在植株基部，5 d后再接種1次，之后每隔3 d從植株基部取花生莢果一次，每次5粒，共3次，取后直接投入10%戊二醛中保存?zhèn)溆?。對照組不做任何接種處理，取樣時間和方式與試驗組相同。

1.2.2 細胞顯微結構研究的樣品制備和觀察 剝取試驗組和對照組的花生種仁，迅速投入廣口瓶中采用10%戊二醛進行前固定，乙醇梯度（80%、95%、100%）脫水，二甲苯： 100%乙醇（1：1）透明，熔點為54～56℃的切片石蠟透蠟2次，包埋，切片，二甲苯脫蠟，乙醇梯度（100%、95%、80%、50%）復水，1‰蘇木素和1%曙紅染色，乙醇梯度（95%、100%）脫水，二甲苯透明，最后封片。在Leica DMS1000數(shù)碼顯微鏡下放大40倍觀察。

1.2.3 SSR標記的多態(tài)性與群體結構分析

46個多態(tài)性高、條帶單一的多態(tài)性標記用于分析48份抗感黃曲霉及相關種質的遺傳多樣性[29]，其引物序列及所在連鎖群見表2。利用Quantityone 4.6.2軟件獲得目的條帶的分子量，根據(jù)SSR重復單元進行矯正，確定每一位點在不同材料中的等位變異，形成等位變異矩陣。利用軟件Stucture 2.3.3進行基于貝葉斯（Bayesian Clustering）數(shù)學模型的亞群劃分，估測群體結構，并計算材料相應的Q值[30]。采用Admixed Model估計最佳群體數(shù)K，取值范圍為1～10，參數(shù)Iterations設為50 000，Burnin-period設為50 000，每個K 值重復運行3次，然后依據(jù)似然值最大原則選取一個合適的△K 值。

1.2.4 種質的主成分分析

PCR擴增產物電泳結果以“0，1”方式統(tǒng)計，即在相同遷移率位置上，有帶的賦值為1，無帶賦值為0，建立“0，1”數(shù)據(jù)陣。利用NTSYS-pc 2.l0e軟件以UPGMA法（類平均法）進行PCoA分析。

2 結果與分析

2.1 黃曲霉侵染對花生胚細胞顯微結構的影響

從圖1可以看出，黃曲霉侵染后，抗病種質J11和感病種質泉花10號的胚表皮細胞完整而連續(xù)，無明顯差異，但內部的胚細胞卻發(fā)生了顯著變化。侵染后3、6 d及9 d，J11胚細胞壁和細胞膜依然比較完整，脂肪粒成團聚集存在；而泉花10號的細胞壁和細胞膜則逐漸裂解，脂肪粒大量流失，侵染后9 d，部分細胞的脂肪粒已完全消失。由此看出，在花生胚表皮出現(xiàn)肉眼可見的黃曲霉定殖之前，籽仁內部的細胞結構和化學成分已發(fā)生了質變。收獲后花生籽仁篩選以及種質抗病性的判斷不能以表皮癥狀為依據(jù)，而要以胚組織的結構變化來判斷。

2.2 SSR標記在基因組上的分布及其多態(tài)性

46個多態(tài)性SSR標記中，除7個來自其他連鎖圖譜或未定位外，其余標記分布于16個不同的連鎖群上，LG13、LG14、LG19、LG20、LG21等5個連鎖群上各有1個，LG6上分布最多，為7個，其余2～5個不等（圖2），覆蓋較為均勻。標記的多態(tài)性信息含量（PIC值）見于閆彩霞等[31]的研究結果，這些標記的變異豐富且在基因組的分布較為均勻，比較適合進行種質的群體結構分析。

2.3 抗感黃曲霉相關種質的群體結構分析

根據(jù)48個抗感黃曲霉相關材料46個SSR位點的等位變異矩陣，利用Structure 2.3.3軟件，采用基于貝葉斯數(shù)學模型的聚類方法對全部種質進行群體結構檢測，亞群數(shù)由最大似然值對應的△K值確定，結果表明，供試材料的確存在群體結構。當K=2時，△K出現(xiàn)最大峰值，似然值最大（圖3），因此判斷，供試材料可劃分為兩大類（圖4）；而當K=4的時候，△K又出現(xiàn)了一個較高的峰值，表明這48份材料可進一步劃分成4個亞群，分別命名為POP1、POP2、POP3和POP4（圖3、5）。

2.4 種質的亞群劃分

成員概率（Membership Probabilities）≥0.5的材料被劃分到相應的亞群，成員概率<0.5的材料劃為混合亞群，每一份材料的劃分信息見圖5。各亞群包含的材料數(shù)依次為8、13、9和15，只有3份材料屬于混合亞群，分別為香鄉(xiāng)、泉花10號和茶杵豆，其中香鄉(xiāng)和泉花10號均為POP2和POP3的混合亞群，茶杵豆為POP1和POP2的混合亞群。從整體來看，這些種質的群體結構非常理想。

分析亞群組成發(fā)現(xiàn)，其亞群劃分與材料的地理來源及生長習性無明顯關系，而與其抗病性呈一定相關性。例如，POP1的8份材料中，有AR-1、AR-2及ICGV87110共3份抗黃曲霉種質，以及紅膜七十日早、蒲廟花生、石龍紅花生、萬安花生及贛榆小站秧共5份抗旱種質；POP2的13份材料中，有PI337409F、ICGV87094、ICGV92243、ICGV94379、ICGV94434、ICGV95440及新會小粒共7份抗侵染種質，91048和91322共2份低產毒種質，瑤上大麻殼和粵油92共2份抗旱種質，還有金花1012和白沙1016共2份高感種質；POP3的9份材料中，包含有Tiffrunner、C11-2-39、C209-6-60、C724-25-22、C156-47和C76-16共6份抗其它真菌種質，US26和Tifton-8共2份低產毒種質，以及抗黃曲霉種質湛秋48；POP4則包含材料3～14、16、17和18共15份抗侵染種質，以及抗根腐?。═hielariopsis basicola）的PERRY。

2.5 主成分（PCoA）分析

從圖6可以看出，在0坐標軸上，將所有種質劃分成4個象限，其中第Ⅰ和第Ⅲ象限集中了群體結構分析中POP1的全部種質，第Ⅳ象限集中了POP3中幾乎全部種質，第Ⅰ和第Ⅱ象限集中了POP2和POP4 的幾乎全部種質。屬于POP1和POP2混合亞群的茶杵豆則處于4個象限的交匯處。香鄉(xiāng)與泉花10號處于第Ⅳ象限中。綜上所述，當坐標軸為0時，主成分分析的分組結果與群體結構中亞群劃分結果是比較吻合的，也證實了48份材料的分群是比較可靠的。

3 結論與討論

3.1 黃曲霉侵染對花生籽仁的影響

花生籽仁是花生收獲的主要目標產物，決定著花生產量和品質的形成，但花生籽仁在生長過程中容易受到黃曲霉等病菌的侵染，特別是后期遭遇干旱或生長過程中遭遇間歇性干旱。從本試驗結果可以看出，侵染后9 d，抗病種質的胚細胞膜依然比較完整，脂肪粒聚集成團，而感病種質的胚細胞膜開始裂解，脂肪粒流失。以前的研究認為種皮是花生抵御黃曲霉侵染的第一道屏障，收獲后花生種仁的篩選或者是抗感黃曲霉種質的鑒定均是以種皮是否有無黃曲霉侵染或定殖為依據(jù)，但實際上種仁內部也就是胚細胞的解體、化學物質的滲漏早已開始，抗病基因的表達此時也迅速增強[32]。關于種仁脂肪、蛋白質等化學物質的組成、性質是否改變，以及黃曲霉毒素的含量變化還需要進一步確定。

3.2 群體結構分析

本研究將全部材料劃分為兩大類4個亞群，亞群間分化系數(shù)（Fst）為1.239～1.347，分組結果與其抗性基本一致，而與材料的地理來源無明顯關系。Kameswara等[33]利用73個SSR標記評價美國微核心種質的72份花生材料，發(fā)現(xiàn)其遺傳距離為0.088～0.254，聚類分析發(fā)現(xiàn)其類群劃分是基于亞種分類和植物學類型。利用同樣的材料，Wang等[34]和Belamkar等[35]先后進行了研究，發(fā)現(xiàn)美國核心種質存在群體結構，可劃分為4個主要的亞群，亞群劃分與2個變種和4個植物學類型有關。Naito等[36]將日本花生種質分成了多粒型亞群以及多粒型和珍珠豆型的混合亞群。這些研究與本研究結論并不一致，因此需要對本研究材料的植物學類型做進一步劃分。本研究中香鄉(xiāng)和泉花10號均為POP2和POP3的混合亞群，這與之前的聚類結果也是非常一致的[31]，證明其遺傳基礎較為復雜，Peng等[37]在107份美國微核心種質和31個育成花生品種中也發(fā)現(xiàn)了類似情況。

3.3 干旱與抗黃曲霉及抗黃曲霉與抗其他真菌病害的關系

本研究選用在全基因組范圍分布較為均勻的46個多態(tài)性SSR標記對48份抗感黃曲霉花生種質、抗其它真菌類種質及抗旱種質進行群體結構及PCoA分析，將這些種質劃分為4個亞群和四個象限，可以看出，抗其它真菌類的種質幾乎全部劃分到POP3和第Ⅳ象限中，表明黃曲霉菌雖然也屬于真菌范疇，但其抗病機理不同，是由不同的抗病基因控制的[32]；8份抗旱種質和抗黃曲霉種質主要集中于第Ⅰ和第Ⅱ象限，表明抗黃曲霉與干旱有一定關系。Waliyar等[38]和Sudhakar等[39]的研究也證實在干旱條件下，會阻止植物抗毒素產生，而有利于黃曲霉菌生長，從而導致黃曲霉毒素產生[40-42]。但從亞群組成上看，抗旱種質全部劃分到POP1和POP2中，抗黃曲霉種質則主要分布于POP2和POP4中，并不一致，表明在大田中干旱雖然是黃曲霉毒素污染的主要誘因，但其也受干旱發(fā)生階段、頻率、地溫或氣溫等其他因素的影響[43]。

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