張?jiān)浦?+方佳++鐘秋平

摘 要 通過單因素實(shí)驗(yàn)法研究了水楊酸（SA）、萘乙酸（NAA）、殼聚糖（CTS）、吲哚丁酸（IBA）、茉莉酸（JA）、激動(dòng)素（KT）和甲基茉莉酸（MJ） 等7種誘導(dǎo)劑對(duì)印楝懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)印楝素的作用，篩選出SA、NAA、CTS、IBA等4種刺激效果明顯的誘導(dǎo)劑，利用響應(yīng)面法優(yōu)化了該4種誘導(dǎo)劑的最佳組合為SA 92.00 mg/L、NAA 6.0 mg/L、CTS5 4.0 mg/L和IBA 3.0 mg/L，得到印楝素含量的實(shí)際值為8.61 mg/g，與理論預(yù)測(cè)值8.69的相對(duì)誤差為0.92%。回歸方程的預(yù)測(cè)值和實(shí)驗(yàn)值差異不顯著，所得回歸方程模型擬合情況良好，符合要求。

關(guān)鍵詞 印楝 ；細(xì)胞懸浮培養(yǎng) ；印楝素 ；響應(yīng)面

分類號(hào) S722.7

印楝（Azadirachta indica A. Juss）是一種極其安全的藥用資源植物[1]，在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保、化妝及食品中應(yīng)用廣泛[2-4]。起藥用效果的主要是印楝籽通過次級(jí)代謝產(chǎn)生的印楝素，不僅具有高效殺蟲、拒食等功效，還能抑制生長(zhǎng)發(fā)育、胃毒、呼吸和昆蟲激素分泌等，并具有降低昆蟲生育能力和殺滅微生物等作用[5-9]。但印楝籽1 a只產(chǎn)1次，數(shù)量有限，不能長(zhǎng)久保存，且印楝籽中的印楝素含量受種源、降雨、種子形態(tài)、采樣期和組培條件等因素的影響[10-11]。由于從印楝籽中提取印楝素具有局限性，因此采用懸浮細(xì)胞培養(yǎng)規(guī)?；_發(fā)印楝素則是行之有效的方法。梁軍等[12]建立了印楝懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系，Balaji等[13]考察了生物及非生物誘導(dǎo)子對(duì)印楝懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)印楝素的影響?？紤]到誘導(dǎo)子之間存在協(xié)同效應(yīng)，本試驗(yàn)研究不同誘導(dǎo)子如SA、NAA、CTS、IBA、JA、KT及MJ對(duì)印楝懸浮細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)印楝素的影響，選擇最優(yōu)誘導(dǎo)劑，并考察它們之間相互作用的效果，以期為提高懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的印楝素產(chǎn)量提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

印楝愈傷組織來(lái)自野生印楝籽源經(jīng)固體培養(yǎng)基多次繼代誘導(dǎo)培養(yǎng)產(chǎn)生的生長(zhǎng)旺盛、色澤嫩黃、疏松易碎的組織。

1.2 懸浮培養(yǎng)系的誘導(dǎo)

將2 g愈傷組織接種到裝有40 mL MS液體培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，內(nèi)含不同濃度誘導(dǎo)子。接種后置于旋轉(zhuǎn)搖床振蕩培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為90 r/min，溫度為25℃。

1.3 懸浮培養(yǎng)系的建立

將生長(zhǎng)良好的細(xì)胞株培養(yǎng)液30 mL接種到內(nèi)含蔗糖40 g/L+BA 2.0 mg/L的MS液體培養(yǎng)基中，500 mL的三角瓶裝液量為150 mL，25 ℃培養(yǎng)，每天光照16 h/黑暗8 h。

1.4 誘導(dǎo)子的篩選

分別選用SA、NAA、CTS、IBA、JA、KT及MJ作為誘導(dǎo)子，其濃度如表1所示。將不同濃度的誘導(dǎo)子在懸浮培養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)加入，培養(yǎng)約8 d后接入已建立的懸浮培養(yǎng)系中，培養(yǎng)至第15天時(shí)收集細(xì)胞并分析印楝素的含量。用水和95%乙醇溶解的誘導(dǎo)子，在對(duì)照試驗(yàn)時(shí)分別加入同樣量的水和乙醇。

1.5 響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別選用SA、NAA、CTS及IBA作進(jìn)一步的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)水平如表2所示。每組實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)至第15天時(shí)分別收集細(xì)胞并測(cè)定印楝素的含量。

1.6 細(xì)胞干重的測(cè)定

將培養(yǎng)好的細(xì)胞懸浮液，搖勻后取100 mL，3 000 r/min 離心20 min，沉淀用蒸餾水清洗2次，50℃烘干至恒重，稱量即為細(xì)胞干質(zhì)量。

1.7 印楝素的提取和測(cè)定

用甲醇萃取干細(xì)胞中的印楝素，萃取參考梁軍等[12]的方法。萃取液用0.45 μm濾膜過濾，清液采用HPLC法檢測(cè)樣品中印楝素的含量。色譜條件為C-18柱，乙腈∶水（10∶90）為流動(dòng)相，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm，柱溫30℃。結(jié)果以1 g干愈傷組織中印楝素的mg數(shù)表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用采用SPSS與Design Expert 8.0.6統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同誘導(dǎo)子對(duì)印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的影響

2.1.1 SA對(duì)印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的影響

SA對(duì)細(xì)胞干重和印楝素含量影響如表1所示。從表1可以看出，細(xì)胞干重和印楝素含量隨著SA濃度的提高而提高，當(dāng)SA濃度為20 mg/L時(shí)，印楝素的含量為對(duì)照的1.24倍。當(dāng)SA濃度提高至80 mg/L時(shí)，印楝素含量急劇增加為對(duì)照的2.36倍。在SA所試的各種濃度之間及各濃度與對(duì)照之間，印楝素含量差異顯著（P<0.05），說明SA能有效誘導(dǎo)懸浮細(xì)胞合成印楝素。SA對(duì)印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)也有顯著影響，SA各濃度間及各濃度與對(duì)照間差異顯著（P<0.05）。由此說明，SA不僅可以刺激印楝懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且還可以促進(jìn)印楝素的生物合成。SA是一種已知的系統(tǒng)獲得性抗性（SAR）途徑的誘導(dǎo)劑[14]，其中一些抗性途徑可能與印楝素的合成有關(guān)。

2.1.2 NAA對(duì)印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的影響

NAA對(duì)印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，在所試的濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞干重隨著NAA濃度的增加而增加，但印楝素的累積卻呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)（表1），在NAA濃度為3.0 mg/L時(shí)，印楝素含量最大?？紤]到細(xì)胞生長(zhǎng)和印楝素的累積，NAA的濃度不能太高。

2.1.3 CTS對(duì)印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的影響

CTS在一些懸浮細(xì)胞培養(yǎng)中被證明是一有效的次級(jí)代謝產(chǎn)物形成的促進(jìn)劑[15]。對(duì)于印楝懸浮系的生長(zhǎng)來(lái)講，CTS的濃度不能太高，過高的CTS濃度對(duì)印楝細(xì)胞產(chǎn)生了毒害作用；對(duì)于印楝素合成來(lái)講，較低的CTS濃度有利于印楝素的累積。當(dāng)CTS濃度為40 mg/L時(shí)，細(xì)胞干重雖然比對(duì)照低，但印楝素的含量卻顯著高于對(duì)照，約為對(duì)照的2.55倍。因此，CTS濃度為40 mg/L左右為宜。

2.1.4 IBA對(duì)印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的影響

IBA對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)及印楝素合成的影響同NAA。細(xì)胞干重隨IBA濃度的提高而提高，印楝素含量隨IBA濃度的提高先升后降，在IBA濃度為2.0 mg/L時(shí)具有最高含量的印楝素，可見2.0 mg/L的IBA最好。

2.1.5 JA、KT和MJ對(duì)印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的影響

JA和KT對(duì)懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，MJ只有在低濃度即15 mg/L時(shí)，對(duì)懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)有利，高濃度對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有毒害作用。對(duì)印楝素合成和累積而言，在所試的濃度范圍內(nèi)，JA、KT和MJ雖能有效促進(jìn)印楝素的合成和累積，但效果沒有SA、NAA、CTS及IBA顯著，與對(duì)照相比，印楝素含量?jī)H有對(duì)照的1.06-1.57倍，提高的幅度遠(yuǎn)低于上述4種誘導(dǎo)劑。

2.2 印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的響應(yīng)面分析

以印楝素含量為響應(yīng)值的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表3，得到印楝素含量（Y）對(duì)SA（A）、NAA（B）、CTS（C）、IBA（D）經(jīng)剔除不顯著項(xiàng)后的二次多項(xiàng)回歸模型為：

Y=2.855+0.037A+0.246 B+0.026 C+1.634 D+0.002 AB-0.009 AD+0.009 CD-1.538 E-004 A2-0.0456 B2-5.559 E-004 C2-0.239 D2

為了檢驗(yàn)方程的有效性，對(duì)印楝素含量的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行方差分析（表4）。從表4可知，印楝素含量為響應(yīng)值時(shí)，該二次方程模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.010 0）?；貧w方程失擬性檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.096 1），表明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾很?。换貧w方程的相關(guān)系數(shù)（R2=0.962 3）及變異系數(shù)CV（1.87%）均表明模型方程能夠較好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值。該方程與實(shí)際情況擬合很好，較好地反映了印楝素含量與SA、NAA、CTS和IBA的關(guān)系，因此所得的回歸方程能較好地預(yù)測(cè)印楝素含量隨各參數(shù)的變化規(guī)律。實(shí)驗(yàn)所選4個(gè)因素中A，B，C，D和AB、AD、CD 以及二次項(xiàng)的影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中A、B、C、D 為極有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明SA、NAA、CTS和IBA均對(duì)印楝素含量有極顯著影響，SA影響最弱，但也達(dá)到了極顯著水平（P<0.01），并且AB、AD、CD交互作用極明顯。綜合以上各參數(shù)，表明該實(shí)驗(yàn)方法可靠，各因素水平間設(shè)計(jì)合理，因此可用該回歸模型代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子A、B、C、D 所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上可形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。根據(jù)回歸方程得出不同因子的響應(yīng)面分析圖及相應(yīng)等高線圖，分析兩兩因素交互作用對(duì)印楝素含量的影響。通過 Design Expert 8.0.6 軟件對(duì)各因素之間的交互作用進(jìn)行響應(yīng)面分析，根據(jù)方差分析結(jié)果，SA和IBA、SA和NAA、CTS和IBA之間交互作用呈極顯著或顯著[8]。NAA濃度一定，當(dāng)SA濃度小于90 mg/L左右時(shí)，印楝素含量隨著SA濃度的提高而增大，SA濃度超過90 mg/L時(shí)，印楝素含量開始下降，變化明顯（圖1）；SA濃度一定，印楝素含量隨著IBA濃度的增加而增加，IBA濃度3.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大值（圖2）；IBA濃度一定，印楝素含量隨著CTS濃度的提高而增加，當(dāng)CTS濃度達(dá)54 mg/L左右時(shí)，印楝素含量達(dá)最大值，此后隨著CTS濃度的進(jìn)一步增加，印楝素含量則降低（圖3）。其他交互作用方差分析P值均大于0.05，表明對(duì)于印楝素含量的影響，交互作用不明顯。

2.3 懸浮細(xì)胞發(fā)酵產(chǎn)印楝素最優(yōu)工藝及其驗(yàn)證

NAA、CTS和IBA是影響印楝素含量的最主要因素，SA次之，選擇合適的發(fā)酵條件，可獲得較高的印楝素含量。對(duì)響應(yīng)面結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)分析，以印楝素含量最高為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定發(fā)酵工藝的最佳條件如下：SA 91.60 mg/L、NAA 6.00 mg/L、CTS 54.28 mg/L、IBA 3.00 mg/L，理論預(yù)測(cè)印楝素含量為8.69 mg/g。

為實(shí)驗(yàn)方便，4種誘導(dǎo)劑的濃度分別調(diào)整為SA 92.00 mg/L、NAA 6.0 mg/L、CTS 54.0 mg/L、IBA 3.0 mg/L，得到印楝素含量的實(shí)際值為8.61 mg/g，該值與理論預(yù)測(cè)值8.69的相對(duì)誤差為0.92 %，說明該模型具有好的分析能力，可為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。

3 結(jié)論

通過對(duì)誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)印楝懸浮細(xì)胞產(chǎn)印楝素的研究發(fā)現(xiàn)，在一定濃度范圍內(nèi)，SA、NAA、CTS、IBA、JA、KT及MJ皆能使印楝懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)，并促進(jìn)懸浮細(xì)胞累積印楝素，前4種誘導(dǎo)劑的誘導(dǎo)效果明顯好于后3種誘導(dǎo)劑。經(jīng)對(duì)前4種誘導(dǎo)劑的進(jìn)一步優(yōu)化，將差異不顯著的因素剔除后的回歸方程為：

Y=2.855+0.037A+0.246B+0.026C+1.634D+0.002 AB-0.009AD+0.009CD-1.538E-004A2-0.0456 B2-5.559E-004C2-0.239D2

SA、NAA、CTS和IBA的最佳組合為SA 92.00 mg/L、NAA 6.0 mg/L、CTS 54.0 mg/L、IBA 3.0 mg/L，得到印楝素含量的實(shí)際值為8.61 mg/g，該值與理論預(yù)測(cè)值8.69的相對(duì)誤差為0.92 %，能為實(shí)際操作提供良好的指導(dǎo)。

參考文獻(xiàn)

[1] Shmutyerer H.Properties and potential of natural pesticides from the neem tree[J].Annu Rev Enmmol， 1990， 35（5）： 271-297.

[2] 林靖凌，蔡春茂，彭黎旭. 印楝種仁粗提物對(duì)植物病原菌的抑制作用研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，36（11）：4 566-4 567.

[3] 程少敏，鄧忠賢. 新型生物殺蟲劑印楝素的應(yīng)用[J]. 農(nóng)藥，2011，10：46-47.

[4] Bradley M， Katie S， Julia A. in： Mcmillan （Ed.），Neem， A Tree for Solving Global Problems，National Research council， USA[J]. Blackwell Science Inc，1992： 60-70.

[5] 賈建文，黃勁飛，王文祥，等. 不同殺蟲成分對(duì)Sf9細(xì)胞凋亡的影響[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，30（4）：29-36.

[6] Mordue A J， Blackwell A. Azadirachtin： an update [J]. Journal of Insect Physiology， 1993， 39： 903-924.

[7] Sayah F， Idaomar M， Soranzo L. Endocrine and neuroendocrine effects of azadirachtin in adult females of the earwig Labidura riparia[J]. Tissue and Cell， 1998， 30（1）： 86-94.

[8] 徐漢虹. 殺蟲植物與植物性殺蟲劑[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2001.

[9] Trand X， Tsuzuki E， Terao H， et al. Evaluation on phytotoxicity of neem （Azadirachta indica. A. Juss）. to crops and weeds[J]. Crop Protection， 2004， 23： 335-345.

[10] 王瑞波. 印楝的生長(zhǎng)及其印楝素含量的初步研究[D].碩士學(xué)位論文，云南：云南大學(xué)，2004.

[11] 彭興民，吳疆翀，程金煥.印楝農(nóng)藥原料林優(yōu)樹選擇方法與標(biāo)準(zhǔn)[J]. 福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，30（3）：265-269.

[12] 梁 軍，魏 剛，呂 全，等. 印楝細(xì)胞懸浮培養(yǎng)系的建立及懸浮培養(yǎng)[J]. 林業(yè)科學(xué)研究，2003，16（5）：568-574.

[13] Balaji K， Veeresham C， Srisilam K， et al. Azadirachtin， a novel biopesticide from cell cultures of Azadirachta indica[J]. Plant Biotechnol，2003， 5： 121-129.

[14] Zhang W， Yang X F， Qiu D W， et al. Pea Tl-induced systemic acquired resistance in tobacco follows salicylic acid-dependent pathway[J]. Mol Biol Rep， 2011， 38： 2 549-2 556

[15] Funk C， Brodelius P. Influence of growth regulator and an elicitor on phenyl propanoid metabolism in suspension cultures of Vanilla plantifolia[J]. Phytochemistry， 1990， 29： 818-828.