李維峰++王婭玲++黃艷麗++高云濤

摘 要 利用超聲耦合乙醇-硫酸銨雙水相萃取技術(shù)提取牛大力總黃酮。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)影響牛大力總黃酮提取的料液比、硫酸銨濃度、乙醇濃度和超聲時(shí)間等因素進(jìn)行探討，以建立牛大力總黃酮的提取工藝。結(jié)果顯示：影響牛大力總黃酮提取因素的主次順序?yàn)榱弦罕?乙醇濃度>硫酸銨濃度>超聲時(shí)間；最優(yōu)提取條件為乙醇濃度80%、料液比1∶40（m∶V）、超聲時(shí)間50 min、硫酸銨濃度為0.3 g/mL，在此條件下，牛大力總黃酮得率為5.82 mg/g。

關(guān)鍵詞 雙水相 ；牛大力 ；總黃酮 ；超聲耦合

分類號(hào) R284.2

牛大力（Millettia Specisoa Champ.），別名山蓮藕、大力薯、金鐘根、豬腳笠，為豆科植物崖豆藤屬植物美麗崖豆的塊根，具有清熱止咳、舒筋活絡(luò)、補(bǔ)肺滋陰等功效，用于治療腎虛、跌打損傷、慢性肝炎、肺虛咳嗽等[1]。相關(guān)研究表明，牛大力中富含揮發(fā)油、黃酮、木脂素、多糖等活性成分[2-5]，但關(guān)于牛大力中總黃酮化合物的提取研究報(bào)道較少[6]。

雙水相提取技術(shù)始于20世紀(jì)60年代，是利用物質(zhì)在互不相容的兩相中分配系數(shù)的不同來(lái)進(jìn)行提取分離的方法[7]，傳統(tǒng)聚合物與無(wú)機(jī)鹽形成的雙水相體系因?yàn)榫酆衔镎扯容^大，導(dǎo)致成本較高，提取物的后續(xù)處理比較困難等缺點(diǎn)，最近發(fā)展由低級(jí)醇如乙醇、丙醇與鹽組成雙水相體系[8-10]，該法具有提取分離條件溫和、過(guò)程易于應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)、生物適應(yīng)性廣等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于生物提取、天然產(chǎn)物分離、食品化工等行業(yè)[11-14]。本研究擬采用超聲耦合乙醇-水-硫酸銨雙水相提取牛大力總黃酮，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，為牛大力中總黃酮的提取開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

牛大力飲片（廣州南北行中藥飲片有限公司）采購(gòu)自廣東省河源市，干燥后粉碎過(guò)40目篩，冷藏備用。

1.1.2 試驗(yàn)試劑

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；其他試劑均為國(guó)藥集團(tuán)分析純?cè)噭?/p>

1.1.3 主要儀器

北京中興偉業(yè)FW-200萬(wàn)能粉碎機(jī)；上?？茖?dǎo)SK5210HP超聲清洗儀，上海精科UV759紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；梅特勒AL204電子分析天平；上海一恒DZF-6053真空干燥箱。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系制備

在硫酸銨溶液加入一定濃度的無(wú)水乙醇，利用硫酸銨的鹽析作用形成雙水相體系，并通過(guò)改變成相后乙醇的濃度和硫酸銨的濃度控制雙水相體系的組成[15]。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

總黃酮含量的測(cè)定采用分光光度法，配制0.2 mg/mL蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL于25 mL比色管中，加入1 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，然后加入1 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加入6 mL 4% NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度線[16]，搖勻，放置15 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，蘆丁濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程A=0.012 5x-0.003 5，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8。

1.2.3 樣品總黃酮的提取

取1 g牛大力干粉于100 mL圓底燒瓶中，按照超聲功率500 W，超聲溫度60℃[6]，分別研究不同料液比（1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、不同硫酸銨濃度（0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4 g/mL）、乙醇濃度（50%、60%、70%、80%、90%）、不同超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）對(duì)牛大力總黃酮提取率的影響。

1.2.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為了對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，在上述單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇浸提料液比、硫酸銨濃度、乙醇濃度和超聲時(shí)間4個(gè)因素按照L9（34）設(shè)計(jì)四因素三水平實(shí)驗(yàn)（見(jiàn)表1）。

1.2.5 樣品總黃酮的分析

取1 mL牛大力提取液，于25 mL比色管中，加入1 mL 5% NaNO2溶液，搖勻后放置6 min，然后加入1 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻后放置6 min，再加入6 mL 4% NaOH溶液，用30%乙醇定容至刻度線[16]，搖勻，放置15 min后于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，利用回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮含量，并按照下面公式計(jì)算總黃酮得率。

總黃酮得率（%）=（提取液中總黃酮質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素影響試驗(yàn)

2.1.1 料液比對(duì)提取的影響

由圖1可以看出，料液比直接影響牛大力總黃酮的得率，料液比過(guò)大或者過(guò)小都不利于總黃酮的提取，料液比過(guò)小，溶劑體積過(guò)少，黃酮類從樣品擴(kuò)散到溶劑中的速率低，而且極易達(dá)到飽和狀態(tài)；料液比過(guò)大，不但會(huì)在加熱過(guò)程中造成能源的浪費(fèi)，更會(huì)因溶劑用量過(guò)多，硫酸銨用量增大，影響雙水相的穩(wěn)定性，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降，因此選用1∶30（m∶V）為最佳料液比。

2.1.2 硫酸銨用量對(duì)提取的影響

從圖2可以看出，隨著硫酸銨用量的增加，總黃酮得率先上升后下降，在0.3 g/mL時(shí)達(dá)到最大值，總黃酮得率為0.557%。究其原因，可能是因?yàn)榱蛩徜@在0.3 g/mL時(shí)形成的雙水相最為穩(wěn)定，有利于黃酮的溶出和擴(kuò)散。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)提取的影響

乙醇濃度會(huì)影響雙水相的組成及穩(wěn)定性，進(jìn)而對(duì)總黃酮得率產(chǎn)生影響。從圖3可以看出，乙醇濃度為70%時(shí)，黃酮得率最高，達(dá)到5.72mg/g，過(guò)低的醇濃度不利于黃酮類化合物從植物細(xì)胞中溶解出來(lái)，而過(guò)高的醇濃度不易透過(guò)親水性植物細(xì)胞壁。

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)提取的影響

從圖4可以看出，超聲時(shí)間10～40 min總黃酮得率隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，在40 min時(shí)達(dá)到最大值，之后繼續(xù)超聲提取得率會(huì)有所降低，可能是超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，黃酮類化合物部分氧化降解，從而導(dǎo)致提取得率下降，所以選定40 min為最佳超聲時(shí)間。

2.2 牛大力總黃酮提取工藝的正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以牛大力總黃酮得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，使用正交設(shè)計(jì)助手Ⅱ進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2中可以看出，牛大力總黃酮的提取得率受到超聲時(shí)間、乙醇濃度、料液比、硫酸銨濃度4個(gè)因素的交叉影響，通過(guò)極差R值的比較可以看出，影響牛大力總黃酮提取得率因素的主次順序?yàn)榱弦罕?gt;乙醇濃度>硫酸銨濃度>超聲時(shí)間，牛大力總黃酮的超聲輔助雙水相提取最佳條件是A3B2C3D3，即料液比為1∶40（g/mL），硫酸銨濃度為0.3 g/mL，超聲提取時(shí)間為50 min，乙醇濃度為60%。

2.3 最佳條件組合試驗(yàn)

根據(jù)正交試驗(yàn)優(yōu)化條件，按照乙醇濃度為80%，硫酸銨濃度為0.3 g/mL配制雙水相溶液，料液比為1∶40（g/mL），超聲提取時(shí)間為50 min，牛大力總黃酮進(jìn)行5次平行提取試驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可見(jiàn)，在上述最佳提取工藝下，采用超聲耦合乙醇-硫酸銨雙水相提取牛大力總黃酮，平均得率為5.82 mg/g，實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均標(biāo)準(zhǔn)誤（RSD）為1.02%。與前人研究中超聲輔助乙醇溶液提取牛大力總黃酮方法相比，得率有明顯的提高[6]。

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，將超聲提取與乙醇-硫酸銨雙水相分離技術(shù)耦合集成，研究了牛大力中總黃酮的提取最佳工藝，并通過(guò)試驗(yàn)驗(yàn)證最佳工藝下總黃酮的得率，發(fā)現(xiàn)在乙醇濃度為80%、硫酸銨濃度為0.3 g/mL配制雙水相溶液、料液比為1∶40（g/mL）、超聲提取時(shí)間為50 min的條件下，牛大力總黃酮平均得率可以達(dá)到5.82 mg/g，該工藝耗時(shí)短，提取工藝簡(jiǎn)單，比超聲輔助單純乙醇溶液提取黃酮的得率明顯要高，具有很高的實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。

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