楊秀東++郭永真++張嬪妹++周鴻立

摘要：采用水提醇沉法及溶劑萃取法提取山荊子葉，測定不同提取物的總黃酮含量。通過對DPPH自由基、ABTS自由基和超氧陰離子清除作用研究了山荊子葉體外抗氧化活性。結(jié)果顯示，山荊子葉水提取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物及水萃取物中的總黃酮含量分別為0.98%、1.62%、4.23%、1.46%和0.313%。體外抗氧化實驗結(jié)果表明，山荊子葉乙酸乙酯萃取物具有較強的DPPH自由基、ABTS自由基活性以及超氧陰離子清除能力。山荊子葉可以作為天然抗氧化劑，為山荊子的綜合利用與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：總黃酮；山荊子；抗氧化；DPPH；ABTS

基金項目：吉林化工學院博士科研啟動基金（批準號：2016007）

中圖分類號： R284.2；R285.5 文獻標識碼： A DOI編號： 10.14025/j.cnki.jlny.2016.22.033

山荊子（Malus baccata （Linn） Borkh），為薔薇科（Rosaceae）蘋果屬多年生木本植物，主要分布于我國東北、華北和西南地區(qū)，在蒙古、朝鮮、俄羅斯西伯利亞等地也有分布[1]，吉林省內(nèi)大部分山區(qū)都有分布。隨著綠色食品的快速發(fā)展，其果實在食品工業(yè)中是釀酒和調(diào)制純綠色飲品的原料，多用于加工果脯、蜜餞和清涼飲料等[2]。其葉在我國很多地區(qū)可以煮茶用來減肥[3]。目前，國內(nèi)針對山荊子果實和葉的化學成分及藥理作用研究還鮮有報道，其果實中的主要化學成分包括萜類、酯類、烯烴類、多酚類以及黃酮類化合物，同時還含有錳、硒和鋅等微量元素[4， 5]。而葉中的主要成分為多酚類和黃酮類化合物[6]。與此同時，現(xiàn)代藥理作用研究表明，山荊子果實中的多酚類成分具有對輻射誘導(dǎo)的機體氧化損傷的保護作用[7]，山荊子不同溶劑提取物具有明顯的抗氧化活性，且其中乙酸乙酯提取物和丙酮提取物分別對人類子宮癌HeLa細胞和肝癌HepG2細胞增殖具有抑制作用[8]。另外，山荊子葉提取物對脂肪酸合酶具有抑制作用，顯示其可能應(yīng)用于減肥[3]。葉提取物還能夠明顯的改善糖尿病小鼠血糖和血脂的紊亂[6]，并對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷具有較好的保護作用[9]。本研究對山荊子葉不同溶劑萃取物的總黃酮含量進行測定，對提取物的體外抗氧化活性進行比較，并初步探討其黃酮含量與體外抗氧化活性的關(guān)系，為開發(fā)和利用山荊子資源提供科學依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

山荊子葉于2015年10月采于長春市郊，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院教授李勇鑒定為薔薇科（Rosaceae）蘋果屬（Malus）植物山荊子的干燥葉。蘆丁標準品：中國藥品生物制品鑒定所；1，1-二苯基-2-苦肼基自由基（DPPH），ABTS 購自美國sigma公司；Vitamin C 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、焦性沒食子酸、過硫酸鉀、硫酸亞鐵等藥品均為分析純試劑購自國藥集團化學試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SpectraMax Plus384型酶標儀。美國Molecular Devices公司；RE-3000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；KQ-118型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；FA2004N型分析天平，上海精密科學股份有限公司；HH-S型恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市正基儀器有限公司。

1.3實驗方法

1.3.1提取階段 精確稱取50克干燥后山荊子陰干葉，剪碎，置于1000 毫升圓底燒瓶中，加入500毫升蒸餾水，浸泡過夜，加熱回流2次，每次2小時。提取液減壓濃縮至400毫升。加入95%乙醇至醇濃度為80%，靜置過夜，抽濾，上清液減壓濃縮至體積為400毫升，然后依次將提取液分次用等體積的氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取各萃取2次，不同溶劑萃取液減壓濃縮，干燥后得浸膏，浸膏質(zhì)量分別為：氯仿部分376.24毫克，乙酸乙酯部分34.31毫克，正丁醇437.79毫克，水提液1232.37毫克。

1.3.2 總黃酮含量測定 總黃酮含量測定方法參照胡衛(wèi)成等的方法制作蘆丁標準曲線。精密配制0.2 毫克/毫升對照品蘆丁的標準液，精密吸取蘆丁對照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、3.0、4.0毫升分別置于10毫升容量瓶中，然后加入5% NaNO2溶液0.3毫升，搖勻，放置6分鐘，加入10 %Al（NO3）3溶液0.3毫升，搖勻，放置6分鐘，加入4 % NaOH溶液4.0 毫升，最后加入80 %乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15分鐘。以80%乙醇溶液為空白對照，用紫外分光光度法于515納米波長處測定上述標準溶液吸光度，制作標準曲線。計算總黃酮含量。山荊子葉提取液和不同溶劑萃取物按上述方法進行實驗，與515納米波長處測定吸光度，計算總黃酮含量。

1.3.3抗氧化活性的測定

1.3.3.1 清除DPPH自由基活性實驗 DPPH用甲醇溶解配制成0.16毫摩爾/升DPPH甲醇溶液。取不同濃度的樣品甲醇溶液和Vc甲醇溶液100微升分別加入96孔板并加入100微升的DPPH溶液，空白用甲醇代替樣品溶液。于波長517納米下測定其吸光度。每份樣品平行操作3次。

清除率（%）=[A空白-A樣品]/A空白×100

提取物的半數(shù)抑制率用IC50值表示

1.3.3.2清除ABTS自由基活性的測定ABTS陽離子自由基的產(chǎn)生是通過ABTS原液與過硫酸鉀在室溫黑暗中反應(yīng)12～16 小時完成，在供氫抗氧化劑存在的情況下，ABTS+自由基會減少。將5毫升，7 毫摩爾/升ABTS+和88 微升140 毫摩爾/升的過硫酸鉀（終濃度）混合，在室溫避光條件下靜止過夜，將生成的ABTS+工作液用水稀釋20～40倍，使其在734 微升波長下的吸光度為0.7±0.02，即得到ABTS+工作液。取不同濃度的山荊子樣品溶液和Vc甲醇溶液10 微升放入96孔板，并加入190 微升的ABTS+工作液，空白用甲醇代替樣品溶液。室溫避光放置6分鐘，于波長734納米下測定其吸光度。每份樣品平行操作3次。

計算公式為清除率（%）=[A空白-A樣品]/A空白×100

提取物半數(shù)抑制濃度用IC50值表示

1.3.3.3超氧陰離子清除實驗 稍作超氧陰離子清除實驗反應(yīng)體系包括：200微升的50 毫摩爾/升Tris-HCl緩沖溶液，20 微升不同濃度的山荊子樣品溶液或Vc溶液，20 微升的25 毫摩爾/升鄰苯三酚溶液，混合后立即放入酶標儀中，連續(xù)測定4分鐘，以吸光度變化率計算樣品對超氧陰離子的清除率。

2結(jié)果與討論

2.1總黃酮含量

以吸光度A為縱坐標，蘆丁對照品溶液的濃度C為橫坐標，進行直線回歸，制備標準曲線，回歸方程為A=13.07C-0.0075，R2=0.9993，結(jié)果表明蘆丁在0.0103～0.0824毫克/毫升濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。山荊子的總水提取物、氯仿萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物和水萃取物的總黃酮含量分別為生藥材的0.98%、1.62%、4.23%、1.46%和0.31%。實驗結(jié)果表明，山荊子乙酸乙酯萃取物的總黃酮含量最高，其次是氯仿提取物。

2.2山荊子葉的不同提取物對DPPH自由基的清除能力

由圖1可知，山荊子葉不同提取物在測試濃度范圍內(nèi)對DPPH自由基均具有一定的清除作用，且其清除作用與濃度呈現(xiàn)劑量依賴關(guān)系，其中乙酸乙酯萃取物對DPPH自由基清除作用最強，在濃度為0.1毫克/毫升和0.2毫克/毫升時，對DPPH自由基的清除率分別為76.2%和83.6%。其次為正丁醇萃取物，其DPPH清除作用僅次于乙酸乙酯提取物。而其他提取物也顯示了不同程度的DPPH清除活性。結(jié)果證明，山荊子葉具有較強的DPPH自由基清除作用。

2.3山荊子葉的不同提取物對ABTS自由基的清除能力

山荊子葉不同提取物對ABTS清除作用如圖2所示，在實驗濃度范圍內(nèi)，山荊子葉不同提取物都顯示了一定的ABTS清除作用，且其清除作用隨著樣品濃度增大而增加。其中以乙酸乙酯萃取物的ABTS自由基清除率最高，當其濃度達到0.200毫克/毫升時，ABTS自由基清除率達到最高，最高值為77.1 %，表明ABTS自由基基本被清除。而在此濃度下，正丁醇層的ABTS清除率僅次于乙酸乙酯層，清除率為72.7%。結(jié)果證明，總黃酮含量較高的乙酸乙酯萃取物能夠較好的清除ABTS。

2.4山荊子葉不同提取物對超氧陰離子自由基清除能力

由圖3可知，山荊子葉不同提取物對超氧陰離子自由基的清除能力呈濃度依賴關(guān)系，而其中乙酸乙酯萃取物對超氧陰離子自由基的清除能力明顯高于其他提取物，當濃度為2.4 毫克/毫升時，其清除率達到40.3%，相同濃度下，其他提取物的清除率均低于25%。

3 結(jié)論

黃酮類化合物是廣泛存在于植物界中的一類天然多酚類成分，具有廣譜的藥理作用，近年來已經(jīng)成為國內(nèi)外植物藥的開發(fā)熱點。本實驗采用水提醇沉法提取了山荊子陰干葉，并進一步用不同溶劑進行萃取，其中各萃取物總黃酮含量測定結(jié)果顯示乙酸乙酯萃取物的總黃酮含量最高，其次為氯仿提取物和正丁醇萃取物，而水提取物和水萃取物含量最低。

山荊子葉不同提取物抗氧化活性研究表明，乙酸乙酯萃取物對DPPH、ABTS和超氧陰離子的清除作用明顯高于其他提取物，結(jié)合其含量測定結(jié)果，其抗氧活作用與黃酮類物質(zhì)含量相關(guān)。與此同時，正丁醇萃取物的抗氧化活性較氯仿萃取物和水萃取物的作用強，可能由于山荊子葉中還含有其他多酚類物質(zhì)，而多酚類物質(zhì)同樣是具有抗氧化活性，因此正丁醇萃取物的抗氧化活性可能與多酚類物質(zhì)有關(guān)。本研究結(jié)果表明，山荊子葉是一種潛在的天然抗氧化劑，具有廣闊的開發(fā)和利用前景。

參考文獻

[1]馮章麗，于文全，顧廣軍，劉暢，卜海東，劉延杰，程顯敏，董雪梅，刑星.山荊子野生資源的研究及利用進展[J].中國林副特產(chǎn)，2016（03）：98-101.

[2]呂娜，劉陽，崔艷艷，夏海洋，趙麗丹，陳俊霞.響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取山荊子總黃酮工藝[J].中國釀造，2014，33（02）：71-

74.

[3]Wei X， Zhao R， Sun YH， Cong JP， Meng FG， Zhou HM. The leaf extract of Siberian crabapple （Malus Baccata （Linn.） Borkh） contains potential fatty acid synthase inhibitors [J]. Journal of Enzyme Inhibition & Medicinal Chemistry.2009，24（01）： 234-240.

[4]李偉.頂空固相微萃取-氣相色譜質(zhì)譜法分析山荊子花和葉中的揮發(fā)性成分[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2012（24）：490-

493.

[5]丁傳波，趙婷，董嶺，陳大勇，李慧萍，高暢，李偉，鄭毅男，劉文叢.山荊子中根皮苷和黃酮含量的測定及其乙醇提取物的抗氧化活性[J].西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）.2014，

42（06）：161-167.

[6]丁傳波，劉璐璐，趙婷，董嶺，王洲婷，韓佳彤，鄭毅男，劉文從.山荊子葉總黃酮對糖尿病小鼠血糖、血脂的作用[J].食品科學.2014，35（17）：226-230.

[7]王璐.山荊子多酚分離及對γ輻射誘導(dǎo)氧化損傷的防護作用[D].2013， 哈爾濱工業(yè)大學.

[8]王璐，王振宇，李小雨，左麗麗.山荊子不同溶劑提取物的體外抗氧化及抗癌活性[J].食品科技.2013，38（09）：201-204.

[9]胡衛(wèi)成，王新風，沈婷，王毓寧，陳銘，尤龍，紀麗蓮，李鵬霞.響應(yīng)面試驗優(yōu)化蓮蓬殼總黃酮超聲提取條件及其抗氧化活性[J].食品科學，2015，36（24）：51-56.

作者簡介：楊秀東，博士，吉林化工學院化學與制藥工程學院，講師，研究方向：天然產(chǎn)物及其生物活性研究。

通訊作者：周鴻立，吉林化工學院化學與制藥工程學院，教授，研究方向：天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。