韓建軍+寧娜+郁建生+鄒宗堯+牟少霞

摘要： 利用響應面分析法對川芎阿魏酸的微波協(xié)同酶法提取工藝進行優(yōu)化。在單因素試驗基礎上，選取纖維素酶用量、酶解溫度、酶解pH值以及酶解時間進行了4因素3水平的Box-Behnken中心組合研究，通過響應面分析法對提取條件進行了優(yōu)化，確定微波協(xié)同酶法提取川芎中阿魏酸的最佳工藝。試驗結果表明：最佳酶解條件為纖維素酶用量3.6 mg/g、酶解pH值4.6、酶解時間52 min、酶解溫度53 ℃，在該條件下，川芎阿魏酸的提取得率為89.18%。

關鍵詞： 川芎；阿魏酸；纖維素酶；微波法；響應面；提??；優(yōu)化

中圖分類號： R284.2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2016）03-0284-04

川芎為傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖，臨床上用于治療跌撲腫痛、月經不調等[1]。川芎含有揮發(fā)油類[2]、多糖類[3]、酚酸類[4]等多種化學成分，其中阿魏酸是川芎藥材的質控成分[1]。體內藥理試驗研究表明，阿魏酸具有抗菌[5]、抗抑郁[6]、降壓[7]等活性。

目前已報道的川芎中阿魏酸的提取方法主要有微波法[8]、回流法[9]、超高壓提取法[10]等。其中微波法是通過微波能加熱與藥材相接觸的溶劑，將目標成分從藥材中轉移至溶劑中的一個過程，具有高效、節(jié)能、污染低的特點[11]。生物酶解技術通過酶解作用可使植物細胞壁疏松、破裂，從而降低傳質阻力，促進有效成分的溶出，提高有效成分提取率，因而被越來越多地用于中藥有效成分的提取中[12]。本研究采用微波協(xié)同酶法提取川芎中阿魏酸，通過響應面法優(yōu)化酶解條件，以期為川芎中阿魏酸的開發(fā)利用提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

川芎，購買于重慶市中藥材市場，經銅仁職業(yè)技術學院梁玉勇教授鑒定為川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）；阿魏酸標準品，購于中國食品藥品檢定研究院；纖維素酶，購自天津利華酶制劑技術有限公司，酶活力為10 000 U/g；水為重蒸水；甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純。

儀器：LC-20AT高效液相色譜儀（自動進樣器、在線脫氣機、二元泵、DAD檢測器和LC-solution 色譜工作站，日本島津公司）；LWMC-201型微波化學反應器（南京旋光科技有限公司）；AB-135S十萬分之一電子天平（德國梅特勒公司）；RE-2000A旋轉蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；PHS-25型酸度計（杭州亞美電子儀器廠）；KS-600D 超聲清洗機（寧波科生儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永鑫實驗儀器設備廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 阿魏酸的含量測定

1.2.1.1 色譜條件[1] Kromasil-C18柱（5 μm，4.6 mm×150.0 mm）；流動相：甲醇-1%乙酸溶液（體積比30 ∶ 70）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：321 nm；進樣量：10 μL。該色譜條件下理論塔板數以阿魏酸峰計算不低于4 000，該色譜條件下測定阿魏酸標準品及川芎藥材得到的色譜結果見圖1。

1.2.1.2 標準曲線的繪制 精確稱取10.5 mg阿魏酸對照品置于25 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇定容，搖勻，得042 mg/mL阿魏酸標準溶液。精確移取0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1 mL阿魏酸對照品溶液至10 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇定容。精確吸取所配制的不同濃度的對照品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按照“1.2.1.1”節(jié)中的色譜條件測定峰面積，并以峰面積為縱坐標（y）、進樣量（x）為橫坐標繪制標準曲線：y=5 312x-1.034，r=0.999 9，線性范圍：0.042～0.420 μg。

1.2.1.3 阿魏酸含量的測定 取經干燥至恒質量的浸膏適量置于10 mL棕色容量瓶中，并用70%甲醇溶解，所得溶液用0.45 μm 的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液10 μL按照“1.2.1.1”節(jié)的色譜條件進行測定，并根據峰面積計算阿魏酸的提取得率。阿魏酸提取得率按照如下公式進行計算：

阿魏酸提取得率=[提取得到的阿魏酸含量（g）/川芎藥材中阿魏酸的含量（g）]×100%。

1.2.2 川芎中阿魏酸的提取工藝流程 川芎中阿魏酸的提取工藝流程：川芎→干燥、粉碎成粗粉（過24目篩）→酶解→微波提取→合并提取液→減壓回收溶劑→浸膏→干燥至恒質量→測定阿魏酸含量，并計算阿魏酸提取得率。其中微波提取條件的工藝參數為：8倍量的50%乙醇、微波功率為150 W、提取次數為2次、提取時間為2 min/次。

1.3 酶解條件的單因素試驗

1.3.1 纖維素酶用量對阿魏酸提取率的影響 準確稱取 10 g 川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解溫度為50 ℃、酶解pH值為4.5、酶解時間為60 min的條件下，考察不同纖維素酶用量（1、2、3、4、5 mg/g）對阿魏酸提取率的影響。

1.3.2 酶解時間對阿魏酸提取率的影響 準確稱取10 g川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在酶解pH值為4.5、纖維素酶用量為3 mg/g、酶解溫度為50 ℃的條件下，考察不同酶解時間（30、40、50、60、70 min）對阿魏酸提取率的影響。

1.3.3 酶解pH值對阿魏酸提取率的影響 準確稱取10 g川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在纖維素酶用量為3 mg/g、酶解溫度為50 ℃、酶解時間為60 min的條件下，考察不同酶解pH值（3.5、4.0、4.5、5.0、5.5）對阿魏酸提取率的影響。

1.3.4 酶解溫度對阿魏酸提取率的影響 準確稱取10 g川芎粗粉置于裝有100 mL蒸餾水的錐形瓶中，在纖維素酶用量為3 mg/g、酶解pH值為4.5、酶解時間為60 min的條件下，考察不同酶解溫度（35、40、45、50、55 ℃）對阿魏酸提取率的影響。

1.4 響應面法優(yōu)化試驗

根據單因素試驗結果，以阿魏酸的提取得率為響應值，用Design-Expert 8.0軟件的Box-Benhnken中心組合試驗設計原理對所選變量進行響應面設計。通過對數據進行回歸分析，預測微波協(xié)同酶法提取川芎中阿魏酸的最佳工藝參數。

2 結果與分析

2.1 酶解川芎藥材的單因素試驗結果

2.1.1 纖維素酶用量對川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖2可知，酶用量在1～3 mg/g時，阿魏酸提取率隨著酶用量的增加而明顯升高；當纖維素酶用量繼續(xù)增加時，阿魏酸提取得率增加緩慢。因此，纖維素酶用量宜選在3 mg/g左右。

2.1.2 酶解時間對川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖3可知，阿魏酸提取得率隨著酶解時間的增加而升高；當酶解時間超過50 min后，阿魏酸提取得率增加趨于平緩。因此，酶解時間宜選擇在50 min左右。

2.1.3 酶解pH值對川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖4可知，當酶解pH值為4.5時，阿魏酸提取得率最高。由于pH值過低或者過高都會影響纖維素酶活力，最終影響有效成分的提取，因此最佳酶解pH值選在4.5左右。

2.1.4 酶解溫度對川芎中阿魏酸提取得率的影響 由圖5可知，在酶解溫度為35～50 ℃時，阿魏酸提取得率隨著酶解溫度的升高而增加；當酶解溫度超過50 ℃時，阿魏酸提取得率有所下降，這是由于隨著溫度的不斷升高，纖維素酶活性不斷增強，但是當溫度過高即超過了纖維素酶的最適溫度時，則會引起纖維素酶失活。因此，酶解溫度宜選擇在50 ℃左右。

2.2 川芎阿魏酸提取工藝響應面法優(yōu)化分析

根據上述單因素試驗結果，以纖維素酶用量（X1）、酶解時間（X2）、酶解pH值（X3）和酶解溫度（X4）4個因素為變量，以阿魏酸提取得率（Y）為響應值，根據Box-Behnken的中心組合設計原理進行4因素3水平試驗。具體的試驗因素及水平見表1，響應面分析方案及結果見表2。

由Design-Expert 8.0.6軟件對表2中數據進行回歸擬合得到的二元多項回歸方程為：Y=88.16+3.17X1+1.95X2+3.38X3+1.99X4+0.28X1X2-0.65X1X3+1.44X1X4-3.30X2X3+1.23X2X4-0.41X3X4-3.00X12-3.56X22-4.54X32-5.45X42。

該模型回歸方程的方差分析結果見表3，可以看出，模型極顯著（P<0.000 1），失擬項（P=0.053）不顯著，表明回歸方程擬合度和可信度較高、試驗誤差較小，可用于指導阿魏酸提取試驗設計。模型中R2為0.991 2，RAdj2為 0.982 4，表明響應值98.24%的變化來源于所選變量；模型的變異系數為0.83%（<10%），表明試驗有良好的穩(wěn)定性；模型的信噪比為34.315（>4），表明該模型適用于川芎阿魏酸提取工藝的優(yōu)化。該回歸方程中的一次項中，X3對阿魏酸提取得率的影響顯著，X1、X2、X4對阿魏酸提取得率的影響極顯著；交互項中X1X4、X2X3、X2X4對阿魏酸提取得率的影響極顯著；二次項中X12、X22、X32、X42均對阿魏酸提取得率的影響極顯著。根據回歸方程中的各項系數及表3中回歸方程結果可知，在所選因素范圍內，各個因素對阿魏酸提取得率的影響順序為：酶解pH值>纖維素酶用量>酶解溫度> 酶解時間。

所考察的4個因素（纖維素酶用量、酶解時間、酶解pH值和酶解溫度）兩兩交互作用對川芎中阿魏酸提取得率的影響見圖6，響應曲面的坡度越陡峭，則表明因素交互作用對響應值的影響越顯著。由圖6可以看出，在所選的4個因素的交互作用中，酶解溫度與纖維素酶用量的交互作用、酶解pH值與酶解時間的交互作用以及酶解時間與酶解溫度的交互作用均對川芎中阿魏酸的提取得率有顯著影響，其中以酶解pH值與酶解時間的交互作用對阿魏酸提取得率的影響最為顯著。以上對響應面圖的分析結果與表3的分析結果一致。

經過Design Expert 8.0.6軟件的分析，得到川芎中阿魏酸酶解的最佳工藝條件為：纖維素酶用量3.58 mg/g、酶解時間52.35 min、酶解pH值4.62、酶解溫度52.77 ℃，在此條件下，阿魏酸理論提取的得率為89.97%。為驗證方法的可行性，采用上述酶解條件對川芎進行微波-酶法提取阿魏酸的試驗，為方便操作，將上述優(yōu)化的條件調整為纖維素酶用量3.6 mg/g、酶解時間52 min、酶解pH值4.6、酶解溫度53 ℃，在優(yōu)化條件下做3組平行試驗，測得阿魏酸平均提取率為89.18%，試驗結果與模型預測相對誤差僅為0.88%。

3 結論

本研究以川芎中阿魏酸提取得率為指標，通過單因素試驗對纖維素酶用量、酶解時間、酶解pH值以及酶解溫度進行了考察。在此基礎上，采用Design-Expert 8.0.6軟件的Box-Behnken的中心組合試驗設計響應面試驗進而建立了數學模型，得到優(yōu)化的酶解處理川芎藥材的工藝條件，即纖維素酶用量為3.6 mg/g、酶解時間為52 min、酶解pH值為4.6、酶解溫度為53 ℃，在該條件下川芎中阿魏酸的提取率達到89.18%。

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