李青青+王旭歌+鐘甲麗+李旺

摘要： 根據(jù)GenBank已報(bào)道的枯草芽孢桿菌的基因序列，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR分別從B.subtilis L、B.subtilis K基因組中擴(kuò)增得到3個(gè)纖維素酶基因序列，基因片段分別長(zhǎng)約700、1 500、1 700 bp。連接到T載體上進(jìn)行測(cè)序，獲得該3個(gè)纖維素酶基因片段的DNA序列，在線比對(duì)分析表明3個(gè)基因的部分堿基序列與已報(bào)道的纖維素酶基因的序列同源性達(dá)99%。這3個(gè)基因的全序列在GenBank中未見(jiàn)報(bào)道，且通過(guò)軟件對(duì)比，三者沒(méi)有任何相似性。根據(jù)3個(gè)纖維素酶基因的來(lái)源分別命名為L(zhǎng)cen、Ken、Kkg。借助軟件分析確定Lcen基因全長(zhǎng)699 bp，基因序列為1個(gè)完整的閱讀框，連續(xù)編碼232個(gè)氨基酸。Ken基因全長(zhǎng)1 500 bp，連續(xù)編碼499個(gè)氨基酸。Kkg基因全長(zhǎng)1 686 bp，基因序列為1個(gè)完整的閱讀框，連續(xù)編碼561個(gè)氨基酸。3個(gè)基因均屬于纖維素酶家族大類。

關(guān)鍵詞： 纖維素酶；基因；克隆；序列分析

中圖分類號(hào)： Q785 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0040-04

纖維素是地球上最豐富的可再生自然資源[1]。全球每年纖維素產(chǎn)量達(dá)2 000億 t[2]，僅我國(guó)秸稈產(chǎn)量就達(dá)5億～7億t，大部分被焚燒、丟棄，不僅浪費(fèi)資源，而且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[3]。纖維素是一種無(wú)色、無(wú)味的白色絲狀物，難溶于一般的有機(jī)溶劑及水，是植物細(xì)胞壁的主要組成部分。植物纖維素結(jié)構(gòu)基本由結(jié)晶區(qū)域、無(wú)定型區(qū)域組成，纖維素結(jié)晶區(qū)域比無(wú)定型區(qū)域難降解[4]。酶解法是目前降解纖維素最有效的方法[5]。纖維素酶是能夠分解纖維素、最終將其降解成葡萄糖的一類酶的總稱。根據(jù)纖維素酶催化反應(yīng)功能的不同可將其分為：（1）內(nèi)切葡聚糖酶，這類酶作用于纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)，隨機(jī)水解β-1，4-糖苷鍵；（2）外切葡聚糖酶，這類酶作用于纖維素線狀分子末端，水解β-1，4糖苷鍵；（3）β-葡萄糖苷酶，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子[6]。纖維素酶分子多數(shù)由球狀的催化結(jié)構(gòu)域（catalytic domains，CD）、連接橋（linker）、纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域（cellulose-binding domains，CBD）3個(gè)部分構(gòu)成[7-9]。纖維素酶分布廣泛，目前飼料用纖維素酶主要從微生物中獲得。隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)纖維素酶分子層面研究也隨之展開，纖維素酶基因的克隆與表達(dá)成了研究焦點(diǎn)。細(xì)菌、真菌的纖維素酶系不斷被人們發(fā)現(xiàn)、分離，大量纖維素酶基因得到克隆、表達(dá)，豐富了纖維素酶的研究材料[10]。結(jié)構(gòu)功能完整的纖維素酶基因克隆到高效表達(dá)載體上再進(jìn)行異源表達(dá)，能使纖維素酶的產(chǎn)量成倍提高[11]。本試驗(yàn)對(duì)纖維素酶系內(nèi)的3個(gè)纖維素酶基因進(jìn)行克隆和序列分析，旨在為后續(xù)高效聯(lián)合表達(dá)纖維素酶系基因進(jìn)行研究準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 Bacillus subtilis K、Bacillus subtilis L均由實(shí)驗(yàn)室篩選并保存，大腸桿菌DH5α購(gòu)于北京天根生化科技有限公司，pGEM-T Easy Vector System購(gòu)于Promega公司。

1.1.2 主要試劑 DL 2000 Marker、溴酚藍(lán)、瓊脂糖購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；Taq酶、DNTP、各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自Promega公司；溴化乙錠（EB）、抗生素（Amp）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；RNA酶，蛋白酶K購(gòu)于北京中科瑞泰生物科技有限公司；瓊脂粉、蛋白胨購(gòu)于Oxid公司。基因組提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、DNA膠純化回收試劑盒均購(gòu)自于中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

1.1.3 引物 試驗(yàn)中的3對(duì)引物序列：

ENF： 5′-ATGAAACGGTCAATCTCTATT-3′；

ENR： 5′-CTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3′；

CENF：5′-ATGAAAAAGATCATGAGTGCAT-3′；

CENR：5′-TTATTCAGGAAACTGAACATGG-3′；

KGF：5′-ATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG-3′；

KGR：5′-TCATATACTAATGCCCATCACAG-3′。

1.2 方法

LB培養(yǎng)基的配制：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 L，固體LB培養(yǎng)基加入20 g瓊脂粉，120 ℃高壓滅菌30 min。細(xì)菌基因組DNA的提取、質(zhì)粒DNA的提取、DNA的凝膠回收參照試劑盒提供的說(shuō)明進(jìn)行。纖維素酶基因的PCR擴(kuò)增、纖維素酶基因片段與T載體的連接、重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞、含纖維素酶基因的重組質(zhì)粒的酶切鑒定參照《分子克隆試驗(yàn)指南》規(guī)定的方法進(jìn)行。纖維素酶系基因的序列測(cè)定由北京擎科新業(yè)公司完成。用VectorNT軟件和NCBI Blast 2.0在線軟件對(duì)該纖維素酶基因的序列進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 纖維素酶基因的克隆

根據(jù)GenBank公布的纖維素酶系的內(nèi)切葡聚糖酶基因、外切葡聚糖酶基因、葡萄糖苷酶基因序列設(shè)計(jì)特異性引物：ENF（R）、CENF（R）、KGF（R），以提取得到的B.subtilis K、B. subtilis L基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1所示。擴(kuò)增得到的DNA片段大小分別為1 500、700、1 700 bp左右。根據(jù)來(lái)源不同分別將3個(gè)基因命名為Ken、Lcen、Kkg。

2.2 纖維素酶基因的鑒定

分別將片段回收，連接于T載體上轉(zhuǎn)化到大腸桿菌培養(yǎng)，挑取單菌落，進(jìn)行重組質(zhì)粒PCR鑒定（圖2-A），凝膠上有明顯的DNA條帶，與PCR擴(kuò)增的結(jié)果一樣。進(jìn)行酶切鑒定（圖2-B），凝膠上分別出現(xiàn)2條明顯的DNA條帶，一條大小約為3 kb與T-easy載體的片段大小一致，另一條帶大小分別約為1 500、700、1 700 bp，與PCR擴(kuò)增的結(jié)果一致。由此確定PCR擴(kuò)增產(chǎn)物順利連接到T-easy載體上，構(gòu)建了3個(gè)基因與T-easy連接的重組質(zhì)粒，分別命名為L(zhǎng)cenT、KenT、KkgT。

2.3 纖維素酶基因的序列分析

將3個(gè)纖維素酶基因重組質(zhì)粒LcenT、KenT、KkgT分別進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)VectorNT軟件和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)3個(gè)基因的序列進(jìn)行分析。

2.3.1 Lcen基因的序列分析 對(duì)LcenT重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到的基因序列如圖3所示。

用VectorNT軟件對(duì)Lcen基因序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長(zhǎng)699個(gè)堿基，組成1個(gè)完整的開放閱讀框（open read frame，ORF），連續(xù)編碼232個(gè)氨基酸，起始密碼ATG，終止密碼TAA。

利用NCBI網(wǎng)站上的Blast功能對(duì)該基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，基因Lcen與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因GU327817.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1十分相似，相似度為99%。對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸序列與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌胞外的葡萄糖苷酶基因NP389744.1、YP007427045.1、YP004203797.1、YP006231826.1、ZP06873100.1的氨基酸序列十分相似，相似度達(dá)到95%。故可初步確定該基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌，屬于纖維素酶基因。

對(duì)基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)得知，該基因編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)屬于罕見(jiàn)的脂蛋白（RlpA）超家族，基因序列部分與罕見(jiàn)的脂蛋白、假定的EG45-like域包含蛋白1、內(nèi)切葡聚糖酶c終端域/亞單位和相關(guān)蛋白質(zhì)相似性高。

2.3.2 Ken基因的序列分析 對(duì)KenT重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到的基因序列如圖4所示。

用VectorNT軟件對(duì)Ken基因序列分析，KenT的基因全長(zhǎng)1 500個(gè)堿基，組成1個(gè)完整的開放閱讀框，連續(xù)編碼499個(gè)氨基酸。起始密碼ATG，終止密碼TAG。利用NCBI網(wǎng)站上的Blast功能對(duì)該基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，基因Ken的序列與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因FJ800366.1、EF070194.1、KC477685.1、CP002468.1、HM543165.1基因序列十分相似，相似度為99%。對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)，該基因編碼的氨基酸序列與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌的內(nèi)切葡萄糖苷酶基因NP389695.2、AFX88666.1、YP007209477.1、ACK38261.1的氨基酸序列十分相似，相似度達(dá)到99%。故可確定該基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌，屬于纖維素酶基因。

對(duì)該基因編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸屬于水解酶超級(jí)家族，整體由2個(gè)主要部分組成（圖5），一部分為纖維素酶區(qū)域（cellulase，圖5-A），一部分為纖維素酶的綁定區(qū)域（CBM-3，圖5-B），其中的纖維素酶區(qū)域結(jié)構(gòu)符合糖基水解酶家族5的結(jié)構(gòu)特征。

2.3.3 Kkg基因的序列分析 對(duì)KkgT重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，得到的基因序列如圖6所示。

用VectorNT軟件對(duì)Kkg基因序列分析，Kkg基因全長(zhǎng)1 686個(gè)堿基，組成1個(gè)完整的開放閱讀框，連續(xù)編碼561個(gè)氨基酸。起始密碼ATG，終止密碼TGA。

利用NCBI網(wǎng)站上的Blast功能對(duì)該基因序列進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，Kkg的基因序列與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因cp002468.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1序列十分相似，相似度為99%。對(duì)其編碼的氨基酸進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸序列與枯草芽孢桿菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因YP004205293.1、YP007208039.1、YP007428400.1、YP007664110.1、ZP12669813.1的氨基酸序列十分相似，相似度達(dá)到99%。故可初步確定該基因來(lái)源于枯草芽孢桿菌，屬于纖維素酶基因的類別。對(duì)該基因編碼的氨基酸結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的氨基酸屬于 α-淀粉酶的超家族，基因編碼的氨基酸序列上包含纖維素酶活性部位、Ca綁定結(jié)構(gòu)域、催化部位（圖7）。

3 結(jié)論與討論

纖維素酶的應(yīng)用非常廣泛，然而天然纖維素酶由于酶活較低以及成本高等因素的限制，對(duì)于大規(guī)模的工業(yè)化應(yīng)用有一定困難。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的發(fā)展，對(duì)纖維素酶分子層面的研究也隨之展開，纖維素酶基因的克隆與表達(dá)成了研究焦點(diǎn)。 目前常用的基因克隆方法有人工合成法、PCR擴(kuò)增法以及構(gòu)建基因文庫(kù)等[12]。本試驗(yàn)通過(guò)GenBank檢索枯草芽孢桿菌纖維素酶基因，根據(jù)基因的編碼序列設(shè)計(jì)3對(duì)引物，從B. subtilis K、B. subtilis L基因組DNA擴(kuò)增出了3個(gè)基因片段，通過(guò)測(cè)序得到基因序列?？莶菅挎邨U菌是目前細(xì)菌纖維素酶基因的主要來(lái)源，已報(bào)道的大部分纖維素酶基因均從枯草芽孢桿菌中獲得[13-14]。已報(bào)道的枯草芽孢桿菌纖維素酶基因大多數(shù)屬于內(nèi)切葡聚糖酶（endo β-1，4 glucanase）基因[14]。在纖維素酶基因克隆上，不論是從何種微生物上進(jìn)行克隆，大部分報(bào)道均是克隆獲得1個(gè)基因。本試驗(yàn)同時(shí)從Bucillus subitilis K基因組DNA中克隆得到2個(gè)纖維素酶基因Ken、Kkg，其中Ken大小為 1 500 bp，與已報(bào)道的大多數(shù)枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶基因一致，屬于纖維素水解酶家族；Kkg基因全長(zhǎng)1 686 bp，與已報(bào)道的枯草芽孢桿菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因一致，在結(jié)構(gòu)分析上，該基因?qū)儆讦?淀粉酶的超家族。

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