秦翠靜+陳寶江+忻龍祚

摘要：為了從菌糠中篩選高產(chǎn)纖維素酶的菌株，鑒定并優(yōu)化其培養(yǎng)條件，利用纖維素剛果紅篩選平板初篩，搖瓶復(fù)篩后得到菌株，鑒定后通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)條件。結(jié)果表明，分離篩選得到的高產(chǎn)纖維素酶的菌株，經(jīng)過(guò)形態(tài)觀察、生理生化鑒定以及16S rRNA序列分析，初步鑒定為芽孢桿菌屬枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），命名為S-4。采用響應(yīng)面法對(duì)菌株S-4進(jìn)行增殖條件的優(yōu)化，得到3個(gè)顯著因子，分別為葡萄糖添加量13.08 g/L，蛋白胨添加量 6.52 g/L，KH2PO4添加量0.37 g/L。通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化后，活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%。

關(guān)鍵詞：菌糠；枯草芽孢桿菌；纖維素酶；響應(yīng)面法；培養(yǎng)基優(yōu)化

中圖分類號(hào)：S816.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）11-0457-03

菌糠是培育食用菌后所剩的糠類物質(zhì)，含有豐富的纖維素、粗蛋白等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著我國(guó)對(duì)食用菌需求量的加大，菌糠的產(chǎn)量也大大增加，菌糠資源的二次利用以及環(huán)境保護(hù)等方面面臨極大的挑戰(zhàn)[1-2]。近年來(lái)的大量研究表明，利用微生物發(fā)酵菌糠可以制成微生物制劑及飼料，纖維素、木質(zhì)素等被不同程度地降解，粗蛋白、粗脂肪均高于未經(jīng)發(fā)酵的基質(zhì)，可以緩解資源的浪費(fèi)[3]。另外，將菌糠制備成益生菌制劑用于動(dòng)物飼養(yǎng)，不僅有利于動(dòng)物的消化吸收，而且降低了飼料成本[4-5]。

以往研究中的發(fā)酵菌糠所用菌株多為保藏菌種，關(guān)于菌糠中菌種利用的報(bào)道很少。本試驗(yàn)從菌糠中篩選出1株產(chǎn)纖維素酶能力強(qiáng)的菌株S-4，該菌株產(chǎn)生的纖維素酶可以更好地利用菌糠中的纖維素，降低纖維素含量。經(jīng)生理生化、16S rRNA序列對(duì)比及分析鑒定，菌株S-4為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），羧甲基纖維素酶（carboxymethyl cellulase enzyme，CMCase）活力為67.5 U/ml。采用軟件Design-Expert 8.0的Plackett-Burman試驗(yàn)篩選出對(duì)響應(yīng)值影響較大的3個(gè)因素，利用最陡爬坡試驗(yàn)逼近最大響應(yīng)區(qū)域，用Box-Behnken試驗(yàn)進(jìn)一步優(yōu)化得到最大響應(yīng)值及最優(yōu)增殖條件。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 菌糠樣品由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院提供。

1.1.2 試劑 羧甲基纖維素鈉（簡(jiǎn)稱CMC-Na）、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏均由北京奧博星有限公司提供。MgSO4·7H2O、K2HPO4、KH2PO4、葡萄糖由天津福晨化學(xué)試劑廠提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g、加水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值7.0～8.0，121 ℃ 滅菌20 min，備用；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：CMC-Na 10 g、KH2PO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、蛋白胨5 g、酵母粉5 g，加水補(bǔ)足至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min，備用。剛果紅篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 2 g、（NH4）2SO4 2 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO4 1 g、NaCl 0.5 g、剛果紅0.4 g、瓊脂20 g，加水補(bǔ)足至1 000 mL，pH值7.0，121 ℃滅菌30 min。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株篩選

1.2.1.1 富集培養(yǎng) 菌糠中添加2%糖蜜、1%硫酸銨、60%水，于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。將發(fā)酵后的菌糠按 1 ∶9 的比例置于生理鹽水中，靜置30 min，5 000 r/min離心 5 min，將離心后得到的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，涂布后于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48 h。

1.2.1.2 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩 將培養(yǎng)后的菌糠按1 ∶9的比例溶于生理鹽水中，5 000 r/min離心5 min，將離心后得到的菌懸液進(jìn)行梯度稀釋，并涂布于剛果紅篩選培養(yǎng)基上，37 ℃ 培養(yǎng)24 h后放置2 d，測(cè)量透明圈直徑與菌落直徑，挑選出透明圈直徑與菌落直徑比值（簡(jiǎn)稱圈菌比）較大的作為初篩菌株[6-7]，在剛果紅初篩平板上進(jìn)行劃線分離純化，并于斜面保存菌種。

1.2.1.3 產(chǎn)纖維素酶菌株復(fù)篩 將初篩得到的菌株接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，于37 ℃、160 r/min培養(yǎng)48 h，后于4 ℃、5 000 r/min 離心10 min，測(cè)定上清液的羧甲基纖維素酶活性[8]。

1.2.2 菌株鑒定

1.2.2.1 形態(tài)學(xué)特征及生理生化鑒定 觀察菌株的菌落形態(tài)，革蘭氏染色后觀察菌株顯微形態(tài)。利用細(xì)菌微量生化鑒定管進(jìn)行生理生化鑒定[9]。

1.2.2.2 菌株的基因鑒定 提取菌株的基因組，并對(duì)基因組進(jìn)行擴(kuò)增，采用試劑盒割膠回收之后連接片段，進(jìn)行熱轉(zhuǎn)化，對(duì)基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增引物的合成以及測(cè)序工作由華大基因完成。得到16S序列后，在NCBI系統(tǒng)通過(guò)Blast進(jìn)行序列比對(duì)分析，利用Mega 5.0軟件的鄰接法創(chuàng)建系統(tǒng)發(fā)育樹[10-12]。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株S-4發(fā)酵條件 通過(guò)Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，從7個(gè)試驗(yàn)因素中篩選出3個(gè)顯著影響因子[13-14]，利用最陡爬坡試驗(yàn)，使因素水平值逼近最大響應(yīng)區(qū)域，結(jié)合響應(yīng)面法BB試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)一步研究，并利用Design Expert軟件進(jìn)行回歸分析[15-16]，尋求最佳水平，得到最優(yōu)發(fā)酵條件[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌糠篩菌

由表1可知，圈菌比最大的菌株S-4為產(chǎn)纖維素酶能力最強(qiáng)的菌株。

搖瓶發(fā)酵復(fù)篩結(jié)果顯示，菌株S-1、S-4的CMC活性分別為22.4、67.5 U/mL（表2）。綜合圈菌比和CMC活性可知，S-4為目的菌株。

2.2 菌株S-4的鑒定

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征及生理生化鑒定 形態(tài)觀察表明，菌株 S-4 菌落形態(tài)為圓形，邊緣不整齊，表面褶皺，干燥不透明，白色；液體培養(yǎng)形成菌膜，分層明顯；經(jīng)過(guò)染色后，油鏡下觀察到菌體形態(tài)為桿狀，單個(gè)排列，革蘭氏染色陽(yáng)性，有芽孢。表3為菌株S-4的生理生化鑒定結(jié)果。

2.2.2 菌株的分子鑒定 提取菌株S-4的基因，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳。S-4菌株16S rRNA序列的擴(kuò)增產(chǎn)物約為1 500 bp。序列信息在NCBI進(jìn)行Blast比對(duì)，S-4菌株16S rRNA序列與枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列同源性為97%。從系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹分析可知，菌株S-4與枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列相似度最高（圖1）。結(jié)合序列對(duì)比分析，初步判斷菌株S-4為枯草芽孢桿菌。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化菌株S-4發(fā)酵條件

2.3.1 PB試驗(yàn) 以枯草芽孢桿菌S-4為試驗(yàn)菌株，以菌懸液D546 nm為響應(yīng)值，于37 ℃、160 r/min搖床發(fā)酵，分析影響發(fā)酵的7個(gè)因素：A，葡萄糖；B，酵母粉；C，KH2PO4；D，K2HPO4；E，MgSO4；F，蛋白胨；G，牛肉膏。由表4可見，該模型相關(guān)性極顯著（P值=0.000 1<0.01），在90%的置信區(qū)間內(nèi)，對(duì)于活菌量影響顯著的3個(gè)因素依次為A：葡萄糖，F(xiàn)：蛋白胨，C：KH2PO4，以此作進(jìn)一步的響應(yīng)面分析。

2.3.2 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)一階方程，確定其變化的步長(zhǎng)以及方向，試驗(yàn)組合設(shè)計(jì)及結(jié)果見表5，可見第2組的Y值（D546 nm），即發(fā)酵后菌液中菌種生物含量最高。因此， 將葡萄糖含量12 g/L、蛋白胨含量6 g/L、KH2PO4含量0.4 g/L作為后續(xù)響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

2.3.3 響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn) 在本研究的條件和方法的基礎(chǔ)上，將A（葡萄糖12 g/L）、B（蛋白胨6 g/L）、C（KH2PO4 0.4 g/L）作為Box-Behnken試驗(yàn)的中心點(diǎn)，采用Design Expert 8.0軟件對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析和二次多項(xiàng)擬合。由表6可知，模型的P值=0.000 4，此模型高度顯著，可信度高。A、C、AB、BC、A2、B2、C2對(duì)響應(yīng)值都有顯著影響，表明3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。另外模型的R2=0.966 2，校正R2=0.913 7，說(shuō)明該模型可以很好地模擬和驗(yàn)證試驗(yàn)的結(jié)果。變異系數(shù)為1.77%，置信度比較高，說(shuō)明模型可以反映真實(shí)的試驗(yàn)值。

2.3.4 響應(yīng)面分析 采用響應(yīng)面法分析研究培養(yǎng)基成分，將PB試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)、Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)合。結(jié)果顯示，當(dāng)3個(gè)顯著因子分別為葡萄糖含量為13.08 g/L、蛋白胨含量為6.52 g/L、KH2PO4含量為0.37 g/L時(shí)，優(yōu)化后活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%。由圖2、圖3、圖4可知，AB、BC之間具有十分明顯的交互作用，AC之間的交互作用較小。為了驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，保證發(fā)酵條件一致，分別于基礎(chǔ)培養(yǎng)基、優(yōu)化后的培養(yǎng)基中對(duì)菌株S-4進(jìn)行試驗(yàn)，每組3個(gè)平行，并取平均值，得到優(yōu)化后的D546 nm為3.478±0.034，與響應(yīng)面分析預(yù)測(cè)結(jié)果擬合良好，基礎(chǔ)培養(yǎng)基D546 nm為2.586±0.026，優(yōu)化后的D546 nm比初始培養(yǎng)的提高了34.49%。

3 討論與結(jié)論

通過(guò)對(duì)菌糠樣品富集培養(yǎng)，利用纖維素篩選平板初篩、搖瓶發(fā)酵復(fù)篩，得到1株高產(chǎn)纖維素酶的菌株S-4。經(jīng)過(guò)生理生化鑒定，并結(jié)合16S rRNA序列對(duì)比分析，鑒定為枯草芽孢桿菌，CMC活性為67.5 U/mL。采用響應(yīng)面法分析培養(yǎng)基成分得出，當(dāng)3個(gè)顯著因子分別為葡萄糖含量 13.08 g/L、蛋白胨含量6.52 g/L、KH2PO4含量0.37 g/L時(shí)，優(yōu)化后活菌量比初始培養(yǎng)提高了34.49%?？莶菅挎邨U菌為飼用益生菌，且高產(chǎn)纖維素酶，用它來(lái)發(fā)酵菌糠，不僅可以降低粗纖維的含量，還能提高蛋白含量?？莶菅挎邨U菌也可以提高動(dòng)物腸道內(nèi)的消化利用率[18-19]。響應(yīng)面法優(yōu)化增殖培養(yǎng)條件，試驗(yàn)次數(shù)少，周期較短，且對(duì)影響試驗(yàn)的各個(gè)因素進(jìn)行分析總結(jié)，分析顯著影響因子之間的交互作用，是一種高效優(yōu)化發(fā)酵條件的途徑[20-22]。

參考文獻(xiàn)：

[1]張 昂. 菌糠的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及其在畜禽生產(chǎn)中的應(yīng)用[J]. 畜牧與飼料學(xué)，2014，35（7/8）：46-47.

[2]卜文文，陶 鴻，趙大剛，等. 食用菌菌糠綜合再利用研究概述[J]. 中國(guó)瓜菜，2012（3）：40-43.

[3]衛(wèi)智濤，周國(guó)英，胡清秀. 食用菌菌渣利用研究現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)食用菌，2010，29（5）：3-6， 11.

[4]陳世通，李夢(mèng)杰，李榮春. 食用菌菌糠綜合利用的研究現(xiàn)狀[J]. 北方園藝，2011（19）：152-154.

[5]周 巍，盛萱宜，彭霞薇，等. 菌糠的綜合利用研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)，2011，21（2）：94-97.

[6]張麗影，汪寒寒，潘 婷，等. 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選及產(chǎn)酶條件優(yōu)化[J]. 纖維素科學(xué)與技術(shù)，2015，23（2）：1-7.

[7]李冠杰，劉瑩瑩，甄 靜，等. 一株降解纖維素細(xì)菌的分離、鑒定及酶學(xué)性質(zhì)分析[J]. 河南科學(xué)，2015，4：530-534.

[8]孫 盈，田永強(qiáng)，趙麗坤. 纖維素酶的CMC酶活測(cè)定條件的研究[J]. 食品工業(yè)科技，2013，34（2）：68-71.

[9]廖延雄. 《伯杰氏鑒定細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》與《伯杰氏分類細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，1992（4）：249.

[10]黃春凱，左小明，王紅蕾，等. 一株產(chǎn)纖維素酶菌株的分離，鑒定及產(chǎn)酶特性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2015，42（4）：646-653.

[11]Yuan L，Wang W，Pei Y Y，et al. Screening and identification of cellulase-producing strain of Fusarium oxysporum[J]. Procedia Environmental Sciences，2012，12：1213-1219.

[12]孫一博. 高效纖維素降解菌的篩選鑒定及特性研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

[13]張 歡，叢麗娜，侯英敏，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化海洋枯草芽孢桿菌HS-A38增殖發(fā)酵培養(yǎng)基[J]. 大連工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，31（1）：19-23.

[14]胡麗娟，薛高尚，盧向陽(yáng)，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌25-2產(chǎn)纖維素酶發(fā)酵條件[J]. 釀酒科技，2012（4）：21-26.

[15]張 瑤，李 嘯，潘冬瑞. Box-Benhnken設(shè)計(jì)優(yōu)化植物乳桿菌培養(yǎng)基[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，19（7）：1-5.

[16]趙延存，李鵬霞，黃開紅，等. 適于解淀粉芽孢桿菌BGP20菌體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基響應(yīng)面優(yōu)化[J]. 食品科學(xué)，2014，35（3）：157-162.

[17]Myers W R. Encycloedia of biopharmaceutical statistics[M]. New York：Marcel Dekker，2003：858-869.

[18]張麗美，王秀玲，韓梅琳，等. 枯草芽孢桿菌發(fā)酵菌糠制備飼料微生物添加劑的研究[J]. 飼料工業(yè)，2013，34（2）：49-53.

[19]劉伯實(shí). 纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選及其在菌糠開發(fā)中的利用[D]. 天津：天津大學(xué)，2008.

[20]庫(kù)米拉·馬吉提，王 偉，張曉燕，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)低溫淀粉酶的工藝條件[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（6）：478-483.

[21]王雪蓮，王 敏，駱健美，等. 枯草芽孢桿菌生防菌B579最佳培養(yǎng)基響應(yīng)面法優(yōu)化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2009，25（1）：212-215.

[22]陳 羽，馮 鎮(zhèn)，張宏偉，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化芽孢桿菌FC96培養(yǎng)基組分的研究[J]. 食品科技，2011（6）：30-34.