崔業(yè)波,馬曉靜,金鑫,馬彧,王丹彧
(四平市食品藥品檢驗(yàn)所,吉林四平 136000)
僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶4~5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌而致死的干燥體,始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,并列為中品,其后諸家本草均有記載[1-2];具有祛風(fēng)解痙,活血通絡(luò),化痰散結(jié)之功效,用于肝風(fēng)夾痰、驚癇抽搐、小兒急驚、破傷風(fēng)、風(fēng)熱頭痛、目赤咽痛、風(fēng)疹瘙癢等[3-6]。僵蠶療效確切,臨床用量及中成藥使用量較大,我國(guó)每年需求量約2 000 t。然而目前僵蠶市場(chǎng)較為混亂,偽品、摻偽品、增重品較多,如違法添加白色淀粉、碳酸鹽或碳酸氫鹽,此類樣品約占據(jù)市場(chǎng)流通量的一半[7]。由于《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版一部僵蠶藥材及飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)未將其表面的白僵菌分生孢子和氣生菌絲的特征列入正文,導(dǎo)致難以區(qū)分正品與非正品僵蠶。
現(xiàn)階段對(duì)僵蠶研究主要集中化學(xué)成分研究、炮制規(guī)范研究、臨床藥理藥效和檢驗(yàn)檢測(cè)研究等[8-14]。其中檢驗(yàn)檢測(cè)方面的研究主要集中在草酸銨成分的分析,而對(duì)核苷類成分的分析未見報(bào)道。核苷類成分是維持生命的重要物質(zhì),具有免疫調(diào)節(jié)作用、多種藥理和生理活性,在很多中藥中作為重要的質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)[15-16]。
筆者采用經(jīng)鑒定為正品的僵蠶,建立了高效液相色譜測(cè)定僵蠶中尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷含量的檢測(cè)方法,根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)僵蠶中尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷的含量(以核苷總量計(jì))正品僵蠶大于摻重正品和混偽品大于偽品的規(guī)律,其中正品僵蠶腺嘌呤含量明顯高于偽品、摻重偽品和混偽品。該方法操作簡(jiǎn)便高效,為僵蠶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和評(píng)價(jià)奠定基礎(chǔ)。
高效液相色譜儀:Agilent 1260 型,美國(guó)安捷倫科技有限公司。
電子天平:BP211D型,感量為0.1 mg,北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。
超聲波清洗器:SB25-12DTD/V型,寧波新芝生物科技股份有限公司。
高速離心機(jī):TG16-WS 型,湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。
甲醇:色譜純,美國(guó)默克公司。
尿苷對(duì)照品:批號(hào)為110887-202104,含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.6%,中國(guó)食品藥品鑒定研究院。
次黃嘌呤對(duì)照品:批號(hào)為140661-202005,含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.4%,中國(guó)食品藥品鑒定研究院。
腺嘌呤對(duì)照品:批號(hào)為110886-202203,含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.8%,中國(guó)食品藥品鑒定研究院。
腺苷對(duì)照品:批號(hào)為110879-202204,含量(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.4%,中國(guó)食品藥品鑒定研究院。
僵蠶樣品:包括2 批藥材分別來源于云南和大別山,4批僵蠶飲片(批號(hào)分別為20210202、201001、200901、J-010-20220108)來自轄區(qū)內(nèi)藥店及飲片企業(yè),經(jīng)馬曉靜副主任藥師鑒定,均為正品僵蠶。
實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
色譜柱:Polaris 5 C8柱(250 mm×4.6 mm,5 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司);柱溫:30 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng):260 nm;進(jìn)樣體積:10 μL;流動(dòng)相:A相為甲醇,B相為水,流量為1.0 mL/min;洗脫方式:梯度洗脫,洗脫程序見表1。
表1 梯度淋洗程序
1.3.1 樣品溶液制備
取僵蠶樣品粉末(過4#篩)約1.0 g,精密稱定,置于具塞三角瓶中,準(zhǔn)確加入25 mL 水,稱定質(zhì)量,超聲(50 kHz,600 W)處理30 min,放冷至室溫,用水補(bǔ)足減失質(zhì)量,以5 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清液,濾過,濾液作為樣品溶液。
1.3.2 混合對(duì)照品溶液配制
準(zhǔn)確稱取尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷對(duì)照品依次為10.22、11.74、9.94、10.40 mg,分別置于50 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至標(biāo)線,再準(zhǔn)確吸取1 mL,置于10 mL容量瓶中,用水稀釋至標(biāo)線,作為混合對(duì)照品溶液。
1.3.3 定量方法
取混合對(duì)照品溶液、樣品溶液,按照1.2 儀器工作條件測(cè)定,以色譜峰面積外標(biāo)法計(jì)算各組分的含量。
2.1.1 色譜柱
目前報(bào)道核苷類成分析方法較多,主要為高效液相色譜法,以C18為固定相的色譜柱居多。筆者發(fā)現(xiàn)采用C18難以將尿苷與相鄰成分有效的分離,可能與尿苷分子量較小有關(guān);改用C8色譜柱,可有效的將尿苷、次黃嘌呤與相鄰的色譜峰有效分離,且分離度均大于2.0,因此選擇C8色譜柱。經(jīng)過試驗(yàn)比較,發(fā)現(xiàn)Polaris 5 C8柱和BDS HypersilTM-C8柱優(yōu)于ⅠnerSustain C8柱,因此選擇Polaris 5 C8柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)作為色譜分析柱。
2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)
采用DAD檢測(cè)器,在200~600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷對(duì)照品溶液進(jìn)行掃描,尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷最大吸收波長(zhǎng)依次為262、250、260、260 nm,依據(jù)文獻(xiàn)[17-18],綜合考慮,選擇檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm;混合對(duì)照品溶液和樣品溶液進(jìn)行同條件波長(zhǎng)掃描,純度閾值設(shè)定為950,結(jié)果顯示樣品溶液中尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷的光譜圖與對(duì)照品一致,各組分純度指數(shù)與對(duì)照品相當(dāng),檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm滿足實(shí)驗(yàn)要求。
2.1.3 流動(dòng)相
用于核苷類成分分析的流動(dòng)相有乙腈-水、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀、甲醇-水等[19-24]。試驗(yàn)對(duì)比了上述流動(dòng)相,結(jié)果表明,偏酸性流動(dòng)相不適合分析腺嘌呤和次黃嘌呤成分,主要問題為腺嘌呤色譜峰不對(duì)稱和次黃嘌呤出現(xiàn)色譜峰包埋現(xiàn)象;而乙腈洗脫能力較強(qiáng),尿苷成分在色譜柱上保留值較小,樣品溶液中其它成分色譜峰對(duì)其干擾較大;而采用甲醇-水為流動(dòng)相,采用梯度洗脫的方式分析,目標(biāo)物分離度及色譜峰形均比較理想。
2.1.4 柱溫
選用Polaris 5 C8(250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱,分別考察柱溫25、30、40 ℃對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí),影響尿苷、次黃嘌呤與相鄰色譜峰的分離度,分離效果欠佳,因此選擇在30 ℃以下為好,如圖1所示。
圖1 混合對(duì)照品溶液色譜圖
由于核苷類成分易溶于水,故選擇水作為提取溶劑。對(duì)超聲提取與熱回流提取進(jìn)行了比較,當(dāng)采用熱回流提取1 h,放至室溫后,由于僵蠶粉末吸收水分而膨脹,呈渾濁狀,離心后,上清液可見懸浮顆粒,過0.45 μm 濾膜阻力較大。采用超聲提取30 min,放至室溫后,離心,上清液少有懸浮顆粒,且容易通過0.45 μm 濾膜,操作方便。超聲時(shí)間在10~30 min內(nèi),核苷成分提取率隨著時(shí)間增加而增加;當(dāng)大于30 min,溶液狀態(tài)同熱回流提取法,核苷類成分提取率基本與30 min 持平。采用該處理方法對(duì)僵蠶和僵蠶樣品加標(biāo)溶液進(jìn)行測(cè)定,加標(biāo)回收率均在在90%以上,僵蠶樣品和僵蠶樣品加標(biāo)色譜圖分別如圖2所示。
圖2 高效液相色譜圖
精密量取混合對(duì)照品溶液2、4、8、10、15 μL 注入液相色譜儀中,按照1.2色譜條件進(jìn)樣分析,記錄色譜圖,以各組分的質(zhì)量為橫坐標(biāo)(x),以色譜峰面積為縱坐標(biāo)(y),繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,得到尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷線性回歸方程分別為y=2.318x-0.419,y=3.662x-2.985,y=5.582x-13.128,y=3.188x-3.095,相關(guān)系數(shù)分別為0.999 9、0.999 9、0.999 9、0.999 6,試驗(yàn)結(jié)果表明,尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷質(zhì)量分別在0.041~0.305、0.047~0.350、0.040~0.298、0.041~0.310 μg范圍內(nèi)與色譜峰面積具有良好的線性關(guān)系。
取1#樣品,依法測(cè)定,樣品中尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為0.37、0.10、0.21、0.27 mg/g。然后準(zhǔn)確稱取1#樣品粉末1.025 4、1.054 1、1.016 4、1.114 0、1.037 0、1.054 g 6份,分別置于具塞三角瓶中,分別等量(約1∶1 比例)加入上述4 種組分。
精密量取1.3.2項(xiàng)尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤、腺苷對(duì)照溶液(質(zhì)量濃度依次為203.58、233.39、198.40、206.75 μg/mL)1.5、0.5、1.0、1.0 mL,其它按照1.3.1方法進(jìn)行操作,制備樣品加標(biāo)溶液,在1.2色譜條件下測(cè)定,試驗(yàn)結(jié)果見表2。
表2 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
由表2 可知,尿苷、次黃嘌呤、腺嘌呤和腺苷的平均回收率分別為97.9%、94.6%、95.8%、95.1%,測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.2%、2.1%、2.0%、1.9%,表明精密度和準(zhǔn)確度均滿足分析要求。
建立了僵蠶中尿苷等4種成分高效液相色譜法測(cè)定法,方法簡(jiǎn)便,準(zhǔn)確度高。該方法有助于僵蠶藥材及其飲片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高。