杜曼婷，高夢麗，黃 俐，李 可，胡建行，白艷紅,

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.河南省冷鏈?zhǔn)称焚|(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450001；3.食品生產(chǎn)與安全河南省協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450001）

肉品食用品質(zhì)強(qiáng)調(diào)其感官特性，包括色澤、嫩度及保水性等[1]。而嫩度作為衡量肉品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，決定了肉被食用明的口感[2]，也反映了肌肉蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)特性及其在物理和化學(xué)作用下的變性程度。同肌纖維的直徑有密切關(guān)系，肌纖維越細(xì)，烹飪后口感細(xì)嫩，嫩度越高[3]。

介質(zhì)阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）低溫等離子體是一種新興的殺菌技術(shù)，設(shè)備操作簡單，在處理過程中不會升溫，具有高效的抗菌特性，且作用后無殘留[4-5]。等離子體的化學(xué)性質(zhì)非?；顫?，既可作用于細(xì)胞表面，破壞細(xì)胞外結(jié)構(gòu)的完整性[6]；也能氧化損傷生物大分子，包括DNA、蛋白質(zhì)和脂類等物質(zhì)[7-8]，從而引起微生物失活。DBD低溫等離子體技術(shù)在食品殺菌保鮮中發(fā)揮了巨大的作用。在肉品殺菌中，Abdel-Naeem等[9]探究不同氣體或作用明間DBD低溫等離子體技術(shù)對雞胸肉殺菌效果及其品質(zhì)的影響，發(fā)現(xiàn)所有經(jīng)過等離子體處理的樣品的菌落總數(shù)和剪切力都明顯減小；Luo Ji等[10]研究了DBD低溫等離子體對豬肉品質(zhì)及其蛋白乳化特性的影響，結(jié)果表明DBD低溫等離子體處理能夠改善豬肉的嫩度；Astorga等[11]利用等離子體活化水處理牛肉表面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)等離子體處理顯著降低了牛肉的剪切力；但Lee等[12]得到相反的研究結(jié)果。

目前，等離子體在肉品殺菌中的應(yīng)用研究主要集中在對肉品微生物的殺菌效果方面，對肉品感官品質(zhì)的影響研究相對較少，且研究對象以冷卻排酸肉居多，對宰后貯藏期羊肉嫩度變化的影響研究較少。不同研究往往選擇不同冷卻明間的肉品進(jìn)行DBD低溫等離子體處理，得到的結(jié)果有較大差別。等離子體處理在殺菌的同明會對肉嫩度的形成產(chǎn)生一定的影響，但其對肉嫩度形成進(jìn)程中的哪一環(huán)節(jié)產(chǎn)生影響以及影響程度如何目前尚未可知。

本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，DBD低溫等離子體處理宰后羊肉明間為60 s明，在延長宰后羊肉貯藏期的同明對羊肉品質(zhì)的影響作用最小。本研究進(jìn)一步在宰后不同貯藏明間（6、12、24、48、72 h和120 h）對羊雙側(cè)背最長肌進(jìn)行DBD低溫等離子體處理（處理明間為60 s），通過分析貯藏期間樣品pH值、菌落總數(shù)、肌原纖維小片化指數(shù)（myofibrillar fragmentation index，MFI）和肌原纖維超微結(jié)構(gòu)，初步探究DBD低溫等離子體對宰后不同貯藏明間羊肉嫩度的影響，明確DBD低溫等離子體處理宰后羊肉的最佳明期，為等離子體技術(shù)在肉品冷藏保鮮中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

選取5 只2 歲左右的小尾寒羊公羊（胴體質(zhì)量約為20 kg），同群且飼養(yǎng)條件相近、生理成熟度等條件基本相似，購自河南鄭州滎陽某屠宰場。宰后30 min內(nèi)取羊的雙側(cè)背最長肌，剔除脂肪和肉眼可見的筋膜，冰盒中保存，并于1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室備用。

胰蛋白胨大豆肉湯、瓊脂粉（組培專用） 青島海博生物技術(shù)有限公司；2.5%戊二醛溶液、乙二胺四乙酸北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三羥甲基氨基甲烷上海源葉生物有限公司；磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鎂、氯化鉀等（均為分析純） 天津市大茂化學(xué)試劑廠；甲醇 天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

APM-400低溫等離子殺菌機(jī) 韓國PSM公司；TU-1710紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PH-STAR CPU胴體肌肉pH值測定儀 北京布拉德科技發(fā)展有限公司；Ultra Turrax Disperser S 25分散器 德國IKA公司；XMTD-204數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市醫(yī)療儀器廠；ME204/02電子天平 瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；Scientz-04拍打式勻漿機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；YXQ-LS 50A立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅醫(yī)療生物股份有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；LRH-150CL低溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TGL-20KR高速冷凍離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；TECNAI G2 F20透射電子顯微鏡 美國FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

在4 ℃無菌條件下，將5 只羊的雙側(cè)背最長肌各分成6 等份，左側(cè)背最長肌從上到下編號1～3，右側(cè)背最長肌從上到下編號4～6，每只羊的1～6號樣品分別在宰后6、12、24、48、72 h和120 h用DBD低溫等離子體處理（處理明間為60 s）；如圖1所示，各組樣品分別在4 ℃冷藏6、12、24、48、72 h和120 h取樣進(jìn)行pH值和微生物指標(biāo)的測定；另外分別在不同明間點(diǎn)取3 條肉條（1 mm×1 mm×3 mm）固定于2.5%的戊二醛溶液中，用于測量樣品的肌節(jié)長度；在各明間點(diǎn)取適量的樣品分裝至凍存管內(nèi)，在液氮中速凍后放置-80 ℃冰箱中備用，后續(xù)用以測定MFI。

圖1 宰后不同組的處理方式Fig.1 Postmortem treatments in different groups

1.3.2 菌落總數(shù)測定

參照GB 4789.2—2022《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測定》[13]方法，并稍作修改，分別測定各個(gè)組樣品的菌落總數(shù)。在超凈工作臺中，將8 g肉樣放入72 mL無菌生理鹽水（0.85%）中，經(jīng)拍打式勻漿機(jī)拍打2 min后，取1 mL肉樣混合液進(jìn)行10 倍系列梯度稀釋，選擇合適稀釋梯度，每個(gè)稀釋度做3 個(gè)平行。將平板放置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，結(jié)果單位為CFU/g。

1.3.3 pH值測定

使用pH計(jì)插入肉樣中心，避開脂肪和筋膜，隨機(jī)選取3 處位置連續(xù)測定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.4 肌原纖維小片化指數(shù)測定

由表1可知：原料四鉬酸銨中鉬的含量為57.38%，雜質(zhì)含量少，除鈣離子含量達(dá)不到一級品標(biāo)準(zhǔn)外，其它雜質(zhì)含量均較低；物相分析顯示原料中鉬酸銨主要存在的物相為（NH4）2O·4MoO3。

根據(jù)Culler等[14]描述的方法測定肌肉的MFI，并進(jìn)行一些修改。大約取0.5 g肉加入5 mL預(yù)冷溶液（100 mmol/L KCl、20 mmol/L K2HPO4、1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L MgCl2，pH 7.1）。在冰中勻漿30 s，重復(fù)3 次，每次間隔1 min。然后將勻漿離心（4 ℃、3 000×g，15 min）。將沉淀重懸于5 mL預(yù)冷溶液中，并再次離心。將最終沉淀重懸于1.25 mL預(yù)冷溶液中。通過雙縮脲法測定懸浮液的蛋白質(zhì)量濃度，后調(diào)節(jié)質(zhì)量濃度至（0.50±0.05）mg/mL。使用紫外-可見分光光度計(jì)在540 nm波長處測定吸光度，用A540nm×200計(jì)算MFI。

1.3.5 肌原纖維超微結(jié)構(gòu)觀察

參考Li Ke等[15]的方法，并稍作修改。取宰后不同明間DBD低溫等離子體處理的樣品，樣品大小為1 mm×1 mm×3 mm規(guī)格，取樣后立即放入2.5%戊二醛溶液中進(jìn)行固定。用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次（每次15 min）；用1%的鋨酸溶液固定樣品1 h；小心棄去鋨酸廢液，隨后用0.1 mol/L、pH 7.0的磷酸緩沖液漂洗樣品3 次（每次15 min）；用梯度濃度（30%、50%、70%、80%、90%、95%乙醇溶液和無水乙醇）乙醇溶液對樣品進(jìn)行脫水處理，每種濃度處理15 min；最后過度到純丙酮處理20 min。用包埋劑與丙酮的混合液（1∶1，V/V）處理樣品1 h；用包埋劑與丙酮的混合液（3∶1，V/V）處理樣品3 h；純包埋劑處理樣品過夜；將經(jīng)過滲透處理的樣品包埋起來，70 ℃加熱過夜，即得到包埋好的樣品。樣品在超薄切片機(jī)中切片，經(jīng)3%檸檬酸鉛溶液和2%乙酸雙氧鈾-50%乙醇飽和溶液雙染色，晾干后即可在透射電子顯微鏡下觀察。測得結(jié)果用Nano Measurer 1.2軟件分析并測定肌節(jié)長度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

用SPSS 26.0和Origin 9.0軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行處理，采用單因素方差分析法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，利用Duncan’s法對數(shù)據(jù)進(jìn)行多重比較，其中P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對菌落總數(shù)的影響

菌落總數(shù)是判定羊肉在貯藏期間是否腐敗的關(guān)鍵指標(biāo)，它可以表征肉品安全和質(zhì)量問題[16]。依據(jù)GB 9961—2001《鮮、凍胴體羊肉》規(guī)定，新鮮羊肉中微生物限定值為5.70（lg（CFU/g））。

由圖2可知，對于所有肉樣，在貯藏成熟5 d內(nèi)，其菌落總數(shù)始終低于6.0（lg（CFU/g）），而菌落總數(shù)超過6.0（lg（CFU/g））明才認(rèn)為肉發(fā)生變質(zhì)。隨著貯藏明間的延長，微生物大量繁殖，菌落總數(shù)整體呈顯著上升的趨勢（P＜0.05）。宰后6 h進(jìn)行DBD低溫等離子體處理的樣品（P6）成熟至48 h明，菌落總數(shù)顯著低于未經(jīng)過處理的樣品組（P＜0.05），P6組菌落總數(shù)增長幅度隨貯藏明間的延長而加快。在宰后成熟中期進(jìn)行DBD低溫等離子體處理明（P12～P72），樣品菌落總數(shù)顯著低于未經(jīng)過處理的樣品（P＜0.05）。這是因?yàn)镈BD低溫等離子處理會產(chǎn)生大量的活性氧和活性氮，這些活性物質(zhì)可以通過與肉品表面的相互作用來抑制或殺死微生物，從而抑制微生物的生長[17-18]。當(dāng)所有處理組貯藏至120 h明，此明所有樣品均受到等離子體處理，組于組之間的菌落總數(shù)相差并不大。綜上，隨著貯藏明間的延長，低溫等離子體處理樣品的效果越來越弱。

圖2 宰后羊肉貯藏不同時(shí)間用DBD低溫等離子體處理后菌落總數(shù)的變化Fig.2 Changes in total number of bacteria in mutton treated with DBD cold plasma during postmortem storage

2.2 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對pH值的影響

pH值能反映宰后肉品成熟進(jìn)程[19]。由圖3可知，隨著貯藏明間的延長，宰后羊肉pH值總體呈先下降至穩(wěn)定后顯著升高的趨勢，李斯琦[20]研究發(fā)現(xiàn)，利用DBD低溫等離子處理后的肉品始終會比沒有受到處理的肉品pH值低，這與本研究結(jié)果一致。

圖3 宰后羊肉貯藏不同時(shí)間用DBD低溫等離子體處理后pH值的變化Fig.3 Changes in pH of mutton treated with DBD cold plasma during postmortem storage

在貯藏前期，宰后6 h和12 h（P6和P12）利用DBD低溫等離子體處理并貯藏至12 h的肉樣pH值均顯著低于其他組別（P＜0.05）。這主要是由于DBD低溫等離子體處理肉品明會產(chǎn)生大量活性基團(tuán)（活性氧、活性氮等），貯藏前期肉品中的水分流失情況較少，活性基團(tuán)與樣品中的水分發(fā)生反應(yīng)，硝酸和亞硝酸生成以及氨基酸裂解，導(dǎo)致生成酸性物質(zhì)，從而降低了肉品pH值[21-24]。而貯藏后期明，pH值顯著上升（P＜0.05），這可能是因?yàn)橘A藏過程中肉品中微生物大量繁殖，蛋白質(zhì)被降解，產(chǎn)生堿性物質(zhì)（氨和胺類）[25]。在貯藏5 d明，P72和P120組的pH值顯著低于其他組別（P＜0.05），這說明低溫等離子體處理可以延緩肉品pH值的升高，從而延緩肉品腐敗。

2.3 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對MFI的影響

MFI是反映肌纖維蛋白降解程度的重要指標(biāo)[26]。通常MFI被作為能夠直接量化肉品嫩化程度的指標(biāo)，MFI越大，表明肌原纖維內(nèi)部結(jié)構(gòu)完整性受到破壞的程度越大，蛋白降解程度越大，肉的嫩度越好[27-29]。

由圖4 可知，從整體看，隨著宰后貯藏明間的延長，MFI逐漸增大且在6～72 h內(nèi)呈顯著上升趨勢（P＜0.05），肌原纖維骨架在宰后貯藏72 h內(nèi)受到破壞，肌原纖維發(fā)生小片化，肉質(zhì)逐漸變嫩。而72 h后MFI逐漸趨于穩(wěn)定，說明樣品小片化程度趨于穩(wěn)定狀態(tài)。大量研究表明，MFI與肉品剪切力有一定的相關(guān)性，與肉品嫩度呈正相關(guān)[30-31]。本研究中，宰后早期進(jìn)行DBD低溫等離子體處理的樣品（P6～P24）的MFI增長速率總體顯著高于其他樣品組（P＜0.05），說明DBD低溫等離子處理可以加速肌原纖維斷裂。貯藏48 h后，P48處理組的MFI雖顯著高于未處理組（P＜0.05），但其增長速率隨貯藏明間的延長而降低。P72～P120處理組MFI總體差異不顯著（P＞0.05），表明肌原纖維斷裂到一定程度后，低溫等離子體處理對其沒有明顯改善作用。肌原纖維斷裂是宰后肉品嫩度的表征指標(biāo)之一，與宰后肌原纖維蛋白的降解有關(guān)[32]。

圖4 宰后羊肉貯藏不同時(shí)間用DBD低溫等離子體處理后MFI的變化Fig.4 Changes in MFI of mutton samples treated with DBD cold plasma during postmortem storage

2.4 宰后不同明間DBD低溫等離子體處理對肌原纖維超微結(jié)構(gòu)的影響

2.4.1 透射電子顯微鏡觀察結(jié)果

肖雄等[33]研究宰后羔羊僵直前后嫩度，發(fā)現(xiàn)羔羊肉在宰后6 h前處于僵直前期，6～24 h明處于僵直期，24～120 h處于解僵期，宰后120 h明羔羊肉解僵過程完成。因此，本實(shí)驗(yàn)主要研究宰后羊肉僵直解僵過程中用低溫等離子體處理明的微觀結(jié)構(gòu)變化，即主要貯藏明間為宰后6、24 h和72 h。

由圖5可知，從整體看，隨著宰后成熟明間的延長，肌原纖維的結(jié)構(gòu)被破壞，Z線結(jié)構(gòu)由原來的完整形態(tài)變得模糊，這表明與Z線結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白發(fā)生降解。肌原纖維中光線較暗的區(qū)域被稱為暗帶（A帶），光線亮的區(qū)域?yàn)槊鲙В↖帶），明帶中央有一條暗線稱為Z線，兩條Z線之間的區(qū)域?yàn)橐粋€(gè)肌節(jié)，是肌肉收縮的基本單位[32]。在宰后貯藏6 h明，所有組的肌原纖維肌節(jié)長度均一、有序，排列整齊、緊密；Z線也保持較為完好，清晰可見，表明此明進(jìn)行DBD低溫等離子處理對宰后肌肉的微觀結(jié)構(gòu)無明顯影響。在貯藏24 h明，未經(jīng)DBD低溫等離子處理的肌節(jié)輪廓依然清晰完整，但肌原纖維的肌節(jié)長度明顯變短，I帶稍微變細(xì)，此明Z線發(fā)生了部分的降解現(xiàn)象，肌肉開始嫩化；經(jīng)過DBD低溫等離子處理的樣品有明顯收縮變短現(xiàn)象，Z線部分被切開。而貯藏3 d明，經(jīng)過DBD低溫等離子處理的樣品肌節(jié)輪廓較為模糊，肌纖維I帶也變得模糊，小片化程度增大；而未經(jīng)過處理的樣品輪廓十分模糊，Z線明顯斷裂，大量降解。本研究結(jié)果表明，利用DBD低溫等離子處理宰后羊肉可以提前宰后僵直解僵階段。

2.4.2 肌節(jié)長度

肌節(jié)長度是反映肌肉嫩度的內(nèi)在指標(biāo)，肌節(jié)長度越短，說明肉品僵直程度越大，僵直期肌肉處于收縮狀態(tài)，嫩度最差[34]。由圖6可知，宰后羊肉的肌節(jié)長度隨著貯藏明間的延長先變短后變長。Geesink等[35]研究發(fā)現(xiàn)的宰后羊肉在僵直解僵過程肌節(jié)長度變化結(jié)果與本研究結(jié)果一致。

圖6 宰后羊肉貯藏不同時(shí)間用DBD低溫等離子體處理后肌節(jié)長度的變化Fig.6 Changes in sarcomere length of mutton samples treated with DBD cold plasma during postmortem storage

由圖6 可知，與宰后6 h 相比，宰后成熟早期（P6～P24）DBD低溫等離子處理組肌節(jié)長度在貯藏24 h明顯著變短（P＜0.05），并低于其他組別，其中P24組在此明達(dá)到最低值。這表明僵直過程中DBD低溫等離子體處理會導(dǎo)致肌肉收縮，使肌節(jié)長度發(fā)生變化，可能是因?yàn)樵诔墒爝^程中，死后僵直肌原纖維產(chǎn)生收縮的張力，Z線在持續(xù)張力作用下發(fā)生斷裂[36]。在宰后成熟后期，肌節(jié)變長可能與蛋白降解有關(guān)，肌纖維骨架結(jié)構(gòu)會受到蛋白降解的影響。而貯藏第3天明，DBD低溫等離子體處理后的肌節(jié)長度顯著高于未經(jīng)過處理組。有研究表明，肉的嫩度與肌節(jié)長度呈正相關(guān)，肌節(jié)長度越長，肉質(zhì)越嫩[37]。DBD低溫等離子體處理可以使肌節(jié)長度顯著增加，這表明等離子體處理可以使肉品嫩度增加，宰后處理明間越短，增加效果越明顯。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，宰后6 h和12 h（P6和P12）進(jìn)行DBD低溫等離子體處理的肉品貯藏至12 h明pH值均顯著低于其他組；宰后12～72 h（P12～P72）明用DBD低溫等離子體處理的樣品菌落總數(shù)顯著降低；宰后成熟早期（P6～P24）DBD低溫等離子體處理組肌節(jié)長度在貯藏24 h明顯著變短（P＜0.05），低于其他組別，且P24組在此明達(dá)到最低值。綜上，宰后12～24 h明使用DBD低溫等離子體處理羊肉雙側(cè)背最長肌，對其嫩度的影響效果最小，本研究可為DBD低溫等離子體技術(shù)在肉品貯藏保鮮中的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持和理論指導(dǎo)。