郎伍營，張佳怡，趙永平

（1.商洛學院 生物醫(yī)藥與食品工程學院，陜西商洛 726000；2.商洛學院 電子信息與電氣工程學院，陜西商洛 726000）

紫蘇（Perilla frutescns L.）分布廣泛，尤其在中國、日本、韓國等東亞國家[1]，作為一種常用于魚和螃蟹烹飪的香料，在中國已有2 000多年的解毒歷史[2]。紫蘇被列入我國首批“藥食同源”植物，在日常生活和社會生產等方面應用潛力巨大。紫蘇葉在中醫(yī)治療感冒、咳嗽、惡心、嘔吐、腹痛、便秘、哮喘和食物中毒等方面也有重要作用[3]。近年來，人們對紫蘇提取物的抗炎[4]、抗氧化[5]、抗菌[6]等生物功能活性的研究備受關注。多糖是紫蘇葉主要的生物活性成分之一，且具有免疫調節(jié)、抗病毒及抗癌、降血糖、抗氧化等許多方面的生物活性，但是國內外對紫蘇葉多糖提取工藝及其理化特性的研究還有待深入[7]。目前紫蘇葉多糖提取的方法有微波提取法、超聲波提取法等[8-9]，但超聲波輔助提取法的缺點是：對容器的要求較高，要能承受住超聲波的震動；產生的噪音很大，且無法避免；一般不需要加熱，但由于其本身存在較強的熱效應，所以必須對溫度進行控制。微波輔助提取法的缺點是：所選用的原料必須具備熱穩(wěn)定性，如果不具備熱穩(wěn)定性，在微波加熱過程中生物活性物質容易失活或者變性；原料還要具備良好的吸水性，反之在微波加熱過程中不能獲得足夠的微波來擊破自身組織，無法提取到組織內生物活性物質。此外，由于在提取過程中需要用到高溫，會使細胞破裂，將一些雜質溶于所提溶劑中，降低提取效率。目前以雙酶法提取紫蘇葉多糖的工藝未見報道。鑒于此，本研究對紫蘇葉采用雙酶法提取多糖，通過正交試驗法對紫蘇葉多糖的提取進行工藝優(yōu)化，并研究紫蘇葉多糖的抗氧化活性，為紫蘇葉產品的深加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮紫蘇葉來源于陜西金亨祥食品科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 紫蘇葉多糖的提取

將紫蘇葉放于烘箱中80℃烘至恒重，用中藥粉碎機打碎，過80目篩得到紫蘇葉粉末。準確稱取紫蘇葉粉末5.000 g，放入燒杯中，以粉末和液體比1：15加水，然后加入一定量的纖維素酶和果膠酶，在pH 5.0條件下進行酶水解，在50℃的水浴鍋中提取120 min，再將水浴鍋升溫至90℃保持30 min滅酶，冷卻后以4 000 r/min離心15 min，取上清液并記錄體積，將上清液通過旋轉蒸發(fā)儀在60℃進行濃縮，濃縮至原溶液體積的1/4時，即可得到濃縮液，再加入4倍體積的無水乙醇，放置于4℃下過夜，然后以4 000 r/min離心30 min，取沉淀，用丙酮和無水乙醇反復將其洗滌多次，真空干燥即可得到紫蘇葉粗多糖。

1.2.2 單因素試驗

分別設置1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的纖維素酶添加量；0.1%，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的果膠酶添加量；60，80，100，120，140 min 的酶解時間；40，45，50，55，60 ℃的酶解溫度，進行單因素試驗。

1.2.3 紫蘇葉多糖含量的測定

根據張學新等[10]的方法稍作修改，得到葡萄糖濃度-吸光度標準曲線y=0.014 6x+0.006 9，R2=0.999 8。紫蘇葉多糖提取率的計算公式：

式(1)中，c1為紫蘇多糖濃度（μg/mL），V 為 100 mL，m1為測定吸光度時所用粗多糖質量（g），m2為粗多糖總質量（g）。

1.2.4 正交試驗設計

以單因素試驗結果為依據，影響因素選擇纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時間和酶解溫度，考察指標是紫蘇葉多糖提取率，進行L9(34)正交試驗，探究各因素對紫蘇葉多糖提取率的影響。正交試驗因素水平設計表見表1。

表1 正交試驗因素水平設計

1.2.5 紫蘇葉多糖體外抗氧化活性的測定

1）DPPH清除率的測定

將1.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液和3.0 mL待測紫蘇葉多糖樣品溶液，混合均勻，室溫避光靜置30 min，在波長517 nm處測定吸光度，每組設置3次重復?？箟难釣閷φ战M，計算待測樣品對DPPH自由基的清除率：

式(2)中，A0為蒸餾水3.0 mL和DPPH 1.0 mL混合液的吸光度值，A1為DPPH 1.0 mL和樣品溶液3.0 mL的吸光度值，A2為無水乙醇1.0 mL和樣品溶液3.0 mL的吸光度值。

2）羥基自由基清除率的測定

取濃度相同的FeSO4溶液和水楊酸-乙醇溶液（9 mmol/L）各 0.5 mL，添加到含有 1.0 mL待測紫蘇葉多糖溶液的試管中混勻，然后再加入8.8 mmol/L H2O20.5 mL，37 ℃放置 30 min，期間每隔10 min晃動數次，使其反應完全，在波長510 nm處測定吸光度，每組設置3次重復，抗壞血酸為對照組，計算羥基自由基清除率：

式(3)中，A1為二價鐵離子、水楊酸-乙醇、過氧化氫和待測紫蘇葉多糖混合液的吸光度值，A2為蒸餾水、水楊酸-乙醇、過氧化氫和待測紫蘇葉多糖混合液的吸光度值，A3為二價鐵離子、水楊酸-乙醇、過氧化氫和蒸餾水混合液的吸光度值。

1.2.6 數據處理

采用GraphPad Prism 8軟件繪圖，IBM SPSS Statistics 26軟件處理數據。

2 結果與分析

2.1 纖維素酶添加量對紫蘇葉多糖提取率的影響

當果膠酶添加量為0.5%，酶解時間為120 min，酶解溫度為50℃時，研究紫蘇葉多糖提取率與纖維素酶添加量之間的關系，結果見圖1。由圖1可知，紫蘇葉多糖的提取率隨著纖維素酶添加量的增加呈現先降低后升高再降低的趨勢，當纖維素酶添加量為紫蘇葉質量的2.5%時，紫蘇葉多糖提取率最高。當纖維素酶添加量超過2.5%時，紫蘇葉多糖提取率降低，可能是因為過多的酶量使底物被完全反應，多余未參加反應的酶不能再催化底物進行反應。

圖1 纖維素酶添加量對紫蘇葉多糖提取率的影響

2.2 果膠酶添加量對紫蘇葉多糖提取率的影響

當纖維素酶添加量為2.5%，酶解時間為120 min，酶解溫度為50℃時，研究紫蘇葉多糖提取率和果膠酶添加量之間的關系，結果見圖2。由圖2可知，紫蘇葉多糖提取率隨著果膠酶添加量的增加呈現先升高后降低的趨勢，當果膠酶添加量為紫蘇葉質量的0.5%時，紫蘇葉多糖提取率最高。當果膠酶添加量超過0.5%后紫蘇葉多糖提取率降低，其原因可能與纖維素酶添加量結果一致。

圖2 果膠酶添加量對紫蘇葉多糖提取率的影響

2.3 酶解時間對紫蘇葉多糖提取率的影響

當纖維素酶添加量為2.5%，果膠酶添加量為0.5%，酶解溫度為50℃時，研究紫蘇葉多糖提取率與酶解時間之間的關系，結果見圖3。由圖3可知，當酶解時間為120 min時紫蘇葉多糖提取率最高。當提取時間超過120 min后，可能是由于反應時間過長，導致酶失活，不能再催化底物進行反應，降低了紫蘇葉多糖提取率。

圖3 酶解時間對紫蘇葉多糖提取率的影響

2.4 酶解溫度對紫蘇葉多糖提取率的影響

當纖維素酶添加量為2.5%，果膠酶添加量為0.5%，酶解時間為120 min時，研究紫蘇葉多糖提取率和酶解溫度之間的關系，結果見圖4。由圖4可知，紫蘇葉多糖提取率在酶解溫度為50℃時達到最大值。當溫度高于50℃時，紫蘇葉多糖提取率逐漸降低，原因可能是溫度超過50℃之后，使得部分纖維素酶和果膠酶失去生物活性，不能再與底物進行充分反應。

圖4 酶解溫度對紫蘇葉多糖提取率的影響

2.5 紫蘇葉多糖提取的正交試驗結果分析

按照表1的正交因素水平設計L9(34)正交試驗，紫蘇葉多糖提取的正交試驗結果見表2，紫蘇葉多糖提取的正交結果的極差分析見表3，紫蘇葉多糖提取的正交結果的方差分析見表4。

表2 紫蘇葉多糖提取的正交試驗結果

表3 紫蘇葉多糖提取的正交結果的極差分析

表4 紫蘇葉多糖提取的正交結果的方差分析

由表3可知，影響紫蘇葉多糖提取率的因素從大到小依次為酶解時間（C）、果膠酶添加量（B）、纖維素酶添加量（A）、酶解溫度（D）。由表4可知，酶解時間、果膠酶添加量、纖維素酶添加量3個因素對紫蘇葉多糖提取率的影響均顯著，結合極差分析結果，確定紫蘇葉多糖最優(yōu)提取工藝為A3B3C1D2，即纖維素酶添加量為2.5%、果膠酶添加量為2.5%、酶解時間為60 min、酶解溫度為50℃，在此條件下，紫蘇葉多糖提取率最大，為3.01%。

2.6 驗證性試驗

為了驗證正交試驗結果是否準確和可行，按紫蘇葉多糖最佳提取工藝條件進行3次重復試驗。3次重復試驗所得結果基本一致，結果如表5所示，紫蘇葉多糖的平均提取率為3.01%。表明本研究篩選的提取工藝合理可行，穩(wěn)定性好。

表5 紫蘇葉多糖提取的正交結果的驗證

2.7 紫蘇葉多糖的抗氧化活性

2.7.1 紫蘇葉多糖清除DPPH自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液對DPPH自由基的清除能力，如圖5所示。由圖5可知，紫蘇葉多糖質量濃度為0～0.1 mg/mL時，紫蘇葉多糖對DPPH的清除率隨著紫蘇葉多糖質量濃度的增加而逐漸增大。當紫蘇葉多糖質量濃度為0.1 mg/mL時，其自由基清除率為91.7%。當紫蘇葉多糖質量濃度高于0.1 mg/mL時，紫蘇葉多糖對DPPH自由基清除率趨于穩(wěn)定。

圖5 紫蘇葉多糖清除DPPH自由基的能力

2.7.2 紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力

紫蘇葉多糖溶液對羥基自由基的清除能力如圖6所示。由圖6可知，當濃度為0.1～0.2 mg/mL時，紫蘇葉多糖對羥基自由基的清除能力隨著濃度的增加逐漸增強。當超過0.2 mg/mL時，紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力逐漸趨于恒定，整體結果表明，紫蘇葉多糖溶液對羥基自由基的清除能力高于同質量濃度下抗壞血酸的清除能力。

圖6 紫蘇葉多糖清除羥基自由基的能力

3 討論與結論

本研究采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)化了雙酶法提取紫蘇葉多糖的工藝條件。在纖維素酶添加量為2.5%、果膠酶添加量為2.5%、酶解時間為60 min、酶解溫度為50℃時，紫蘇葉多糖提取的工藝條件最優(yōu)，所得紫蘇葉多糖提取率最大，可達到3.01%。紫蘇葉多糖提取工藝的研究較多，但提取工藝條件各不相同。李沖偉等[11]采用微波輔助法提取紫蘇葉多糖，當料液比為 1：25（g：mL），微波提取功率為480 W、微波輔助提取時間為3 min時，紫蘇葉多糖的提取率為9.06%。丁素蕓等[7]采用熱提法提取紫蘇葉多糖，最佳提取工藝條件是料液比為 1：30（g：mL）、提取時間為4 h、醇沉濃度為60%時，紫蘇葉多糖得率達到（5.22±0.17）%。梁樂欣等[9]運用超聲波協(xié)同纖維素酶法提取紫蘇葉多糖，當酶解時間為40 min、酶解溫度為20.4℃、加酶量為2 000 U/g、超聲時間為60 min時，紫蘇葉多糖的提取率最高為4.54%。張麗紅等[8]采用微波技術輔助提取紫蘇葉多糖，當裝載量為10 mL、微波時間為30 s、微波功率為800 W時，紫蘇葉多糖提取率為3.99%。文獻[7-9，11]的研究結果均高于本研究結果，其原因可能與紫蘇葉多糖提取方法及紫蘇的產地有關，還需深入探討。

本研究還發(fā)現，紫蘇葉多糖對DPPH有一定的清除能力，當紫蘇葉多糖質量濃度為0.1 mg/mL時，其自由基清除率為91.7%，紫蘇葉多糖對羥基自由基的清除能力高于同質量濃度下抗壞血酸清除羥基自由基的能力，表明所提取的紫蘇葉多糖具有一定的抗氧化活性。牛新茹等[12]采用水提醇沉法提取紫蘇葉多糖，并對所提取的紫蘇葉多糖進行抗氧化活性檢測，結果顯示，當紫蘇葉多糖濃度小于1.00 mg/mL時，紫蘇葉多糖對DPPH清除能力隨著紫蘇葉多糖濃度的增加而增加，直到當紫蘇葉多糖濃度為0.25 mg/mL時清除率達到84.69%，與抗壞血酸清除能力相當。梁樂欣等[9]采用超聲波協(xié)同纖維素酶提取紫蘇葉多糖，并研究所提紫蘇葉多糖的抗氧化活性，當紫蘇葉多糖質量濃度為0～0.1 mg/mL時，紫蘇葉多糖對DPPH清除能力呈線性增長。當紫蘇葉多糖質量濃度為0.1 mg/mL時，其清除率達到94.17%。紫蘇葉多糖對羥基自由基的清除能力隨著紫蘇葉多糖質量濃度的增加而增強，并且當紫蘇葉多糖質量濃度大于0.2 mg/mL時，紫蘇葉多糖對DPPH和羥基自由基的清除能力都略高于同質量濃度下抗壞血酸的清除能力。文獻[12]采用水提醇沉法提取紫蘇葉多糖，同質量濃度下紫蘇葉多糖的抗氧化活性低于本研究結果，而文獻[9]通過超聲波協(xié)同纖維素酶提取紫蘇葉多糖，同質量濃度下紫蘇葉多糖的抗氧化活性與本研究結果基本一致。其可能原因是提取工藝中有酶的參與，利用酶的高效選擇性，促進紫蘇葉中多糖溶液的浸出，獲得的多糖產物性質穩(wěn)定，活性高。