許飛利，王丹鳳，劉志博

（1.商洛學(xué)院健康管理學(xué)院/陜西“四主體一聯(lián)合”秦嶺健康食品配料及核桃產(chǎn)業(yè)技術(shù)校企聯(lián)合研究中心，陜西商洛 726000；2.商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西商洛 726000）

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murray）是茄科，枸杞屬，多棘刺灌木[1]，多分枝，枝條堅(jiān)硬，常呈之字形彎曲。果實(shí)為球形，皮薄，成熟后為黑紫色，味甜多汁[2]。它屬于西北干旱地區(qū)多年生的灌木野生植物，國(guó)內(nèi)主要生長(zhǎng)于青海、甘肅、寧夏、西藏、內(nèi)蒙古等西北省區(qū)[3]，在國(guó)外主要分布于歐洲南部及地中海沿岸等地區(qū)[4]。黑果枸杞味甘、性平和，富含蛋白質(zhì)、枸杞多糖、氨基酸、維生素、黃酮類(lèi)化合物、甜菜堿，還有多種微量元素如Zn、K、Ca、Mn、Na等，以及豐富的天然水溶性的原花青素，被譽(yù)名為野生的“藍(lán)色妖姬”[5]。黑果枸杞花青素含量超過(guò)藍(lán)莓，是至今為止發(fā)現(xiàn)的花青素含量最高的天然野生植物。黑果枸杞作為經(jīng)典藏藥，具有極高的藥用價(jià)值，常用于治療心熱、婦科病、尿道結(jié)石、皮膚病、牙齦出血等病癥[6]。在民間人們喜生食、榨汁做成飲料和制成藥酒使用[7]，具有多種功能，如明目降壓、保護(hù)肝臟、健身補(bǔ)腎、美白肌膚、延年益壽等。黑果枸杞中富含枸杞多糖，總糖量可高達(dá)39.55%[8]，是黑果枸杞多種活性成分中最重要的一種物質(zhì)。枸杞多糖作為一種天然活性物質(zhì)，還具有綠色健康、無(wú)污染、無(wú)藥性依賴(lài)等優(yōu)點(diǎn)。它具有很多功能如抗癌抗腫瘤作用[9-10]、抗氧化和防衰老作用[11]、免疫調(diào)節(jié)作用[12]、降血糖、降血脂作用、神經(jīng)保護(hù)作用[13-14]，另外，它能有效促進(jìn)糖尿病患者免疫應(yīng)答反應(yīng)，對(duì)糖尿病患者的虛弱無(wú)力也有著一定的緩解作用[15-16]。目前枸杞多糖提取方法有水浸提取法、超聲波輔助提取法、酶解提取法、微波輔助提取法等[17]。水浸提取法在生活中應(yīng)用普遍，雖然操作簡(jiǎn)易，但提取率與提取純度相對(duì)偏低。在此方法中，溫度是關(guān)鍵影響因素，增加溫度會(huì)升高枸杞多糖的提取率，但溫度不宜過(guò)高，否則會(huì)使多糖水解而破壞其化學(xué)結(jié)構(gòu)，所以此方法要控制好提取溫度[18]。超聲波輔助提取法是比較常見(jiàn)且工藝運(yùn)行成本最低的提取多糖方法之一。與常規(guī)水提法相比，具有操作簡(jiǎn)易、提取時(shí)間短、提取溫度低、提取率高、適應(yīng)性廣及提取物質(zhì)雜質(zhì)少且穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[19]。酶解提取法是廣泛應(yīng)用于植物多糖提取的一項(xiàng)生物工程技術(shù)，該方法具有條件溫和、雜質(zhì)易除、快速、高效的特點(diǎn)，但是提取成本相對(duì)較大[20]。相對(duì)而言，微波輔助提取法枸杞多糖提取率大于超聲輔助提取法，考慮到試驗(yàn)過(guò)程節(jié)約能源，故在試驗(yàn)室中，微波提取法作為首選[21]。枸杞多糖因具有多種生理活性，已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)課題[22]。然而目前枸杞多糖相關(guān)產(chǎn)業(yè)仍存在提取效率較低、結(jié)構(gòu)表征鑒定技術(shù)不全面、純化方法不系統(tǒng)等制約因素[23]。為了提高黑果枸杞多糖的提取效率，本研究采用微波提取法對(duì)黑果枸杞多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳提取工藝條件。

1 材料與方法

1.1 材料

黑果枸杞來(lái)源于青海省西寧市。

1.2 方法

1.2.1 黑果枸杞多糖的提取

稱(chēng)取黑果枸杞粉末2.00 g，倒入干燥的錐形瓶中，再加入適量的蒸餾水?dāng)嚢杈鶆颉㈠F形瓶放在微波爐上，功率為300 W，微波10 min后取出錐形瓶降溫30 min。將黑果枸杞多糖溶液倒入離心管中，以3 000 r/min離心20 min后，將離心管中的上清液加入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，蒸發(fā)濃縮至原來(lái)的1/4，再加入2倍乙醇，4℃下乙醇提取提4 h。再將黑果枸杞多糖溶液以3 000 r/min，離心20 min。然后取沉淀用乙醇洗滌，再放入真空干燥箱，40℃條件下干燥12 h，即得黑果枸杞粗多糖[24]。

1.2.2 黑果枸杞多糖含量的測(cè)定

采用硫酸-苯酚法測(cè)定黑果枸杞中多糖的含量[25]。葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=14.523x+0.030 4，R2=0.989 9，黑果枸杞多糖提取率計(jì)算公式：

式(1)中，W為黑果枸杞多糖提取率（%），m1為黑枸杞多糖測(cè)定液中含糖量（mg），V1為黑果枸杞多糖定容體積（mL），m2為黑果枸杞粉末質(zhì)量（g），V2為待測(cè)樣品液體的體積（mL），f（葡萄糖換算多糖轉(zhuǎn)換因素）為3.17。

1.2.3 單因素試驗(yàn)

分別設(shè)置料液比 1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30（g：mL），微波功率 100，300，500，700，900 W，微波時(shí)間5，10，15，20，25 min，提取次數(shù) 1，2，3，4，5 次，測(cè)定黑果枸杞多糖提取率。

1.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置四因素三水平正交試驗(yàn)，測(cè)定黑果枸杞多糖提取率，見(jiàn)表1。

表1 正交試驗(yàn)水平因素設(shè)計(jì)

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2016和SPSS 25.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 料液比對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

如圖1所示，隨著料液比的增大，黑果枸杞多糖提取率呈現(xiàn)出近似直線形上升的趨勢(shì)，當(dāng)料液比為 1∶25（g：mL）時(shí)，黑果枸杞多糖提取率最大為4.27%，之后黑果枸杞多糖提取率開(kāi)始下降。當(dāng)料液比為 1∶10（g：mL）時(shí)，黑果枸杞多糖提取率最低為1.33%?？梢?jiàn)黑果枸杞多糖提取率的最佳料液比為 1∶25（g：mL）。

圖1 料液比對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

2.2 微波功率對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

如圖2所示，黑果枸杞多糖提取率的微波功率在100～500 W一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，這是由于隨著微波功率的增加，黑果枸杞細(xì)胞破碎得更加徹底，從而將更多的多糖從黑果枸杞原液中溶出，但當(dāng)微波功率超過(guò)500 W后，黑果枸杞多糖提取率出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，這可能是由于微波功率過(guò)高使黑果枸杞細(xì)胞中的其他溶質(zhì)析出，從而導(dǎo)致黑果枸杞多糖提取率下降。黑果枸杞提取率最低為3.65%，此時(shí)的微波功率為100 W。黑果枸杞提取率最高為5.12%，此時(shí)的微波功率為500 W。

圖2 微波功率對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

2.3 微波時(shí)間對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

如圖3所示，當(dāng)微波時(shí)間為5～20 min時(shí)，隨著微波時(shí)間不斷增加，黑果枸杞多糖提取率也不斷提高，當(dāng)微波時(shí)間為20 min時(shí)，黑果枸杞多糖提取率到達(dá)頂峰，提取率為5.83%。之后黑果枸杞多糖提取率又開(kāi)始下降，這可能是因?yàn)槲⒉〞r(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致黑果枸杞多糖的結(jié)構(gòu)遭到一些破壞。因此選擇20 min為最佳提取時(shí)間。

圖3 微波時(shí)間對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

2.4 提取次數(shù)對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

如圖4所示，當(dāng)黑果枸杞提取次數(shù)為1～2次時(shí)，黑果枸杞多糖提取率有所提高，這是因?yàn)槎啻翁崛〕浞值厝芙饬撕诠坭街械亩嗵?，黑果枸杞提?～4次時(shí)黑果枸杞多糖提取率雖然一直在上升，但是上升的幅度很小。這應(yīng)該是黑果枸杞中的枸杞多糖已經(jīng)被提取完全?？紤]到工業(yè)化生產(chǎn)的需求，多次提取在生產(chǎn)過(guò)程中使用并不現(xiàn)實(shí)，這樣水耗、能耗太大，成本太高。因此選擇最佳提取次數(shù)為2次。

圖4 提取次數(shù)對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響

2.5 黑果枸杞多糖提取率的正交試驗(yàn)

黑果枸杞多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果的極差分析見(jiàn)表3，黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果方差分析見(jiàn)表4。

表2 黑果枸杞多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)果

表3 黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果的極差分析

表4 黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果的方差分析

由表2可知，試驗(yàn)組中黑果枸杞多糖提取率最優(yōu)組合為A2B3C1D2，即當(dāng)微波功率為500 W，提取次數(shù)為 3 次，料液比為 1：20（g：mL），微波時(shí)間為20 min時(shí)，黑果枸杞多糖提取率最高為5.30%。

由表3的黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果的極差分析可知，微波功率（A）、微波時(shí)間（D）、料液比（C）、提取次數(shù)（B）四種因素中對(duì)黑果枸杞多糖提取率影響最大的因素是微波功率（A），對(duì)黑果枸杞多糖提取率影響最小的因素是提取次數(shù)（B），即 A＞D＞C＞B。同時(shí)可以得到，黑果枸杞多糖提取率優(yōu)化工藝的最佳組合為A3B2C1D2，即最佳微波功率為700 W，提取次數(shù)為 2 次，料液比為 1：20（g：mL），微波時(shí)間為20 min。

由表4的黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果的方差分析可知，偏差平方和、均方及F比大小排列均為A＞D＞C＞B，偏差平方和代表試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)的離散程度，均方值為偏差平方和與自由度之比，F(xiàn)值表示各處理之間效果的差異性，該值越大則差異越明顯。自由度代表數(shù)據(jù)中可以自由變動(dòng)的部分，均為2。因此，四個(gè)因素對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響順序?yàn)槲⒉üβ剩ˋ）＞微波時(shí)間（D）＞料液比（C）＞提取次數(shù)（B），與黑果枸杞多糖提取率的極差分析的結(jié)果一致。

2.6 黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果的驗(yàn)證

稱(chēng)取黑果枸杞粉末2.00 g，倒入燒杯，加入40 mL蒸餾水，在最佳提取條件（A3B2C1D2）下提取2次，重復(fù)試驗(yàn)3次取平均值為測(cè)定結(jié)果（允許相對(duì)偏差為5%），驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果如表 5。

由表5可知，按黑果枸杞多糖最佳提取工藝條件下進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次黑果枸杞多糖提取率的平均值為6.52%，高于組合A2B3C1D2的提取率5.30%，相較而言顯著提高，因此在微波輔助提取工藝時(shí)這一組參數(shù)A3B2C1D2為最佳方案。

表5 黑果枸杞多糖提取的正交結(jié)果的驗(yàn)證

3 討論與結(jié)論

本研究采用微波法提取黑果枸杞多糖，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，再利用正交試驗(yàn)法對(duì)黑果枸杞多糖提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究發(fā)現(xiàn)，料液比、微波功率、微波時(shí)間對(duì)黑果枸杞多糖提取率均有較大的影響，提取次數(shù)對(duì)黑果枸杞多糖提取率的影響不大。最終獲得的最佳提取條件為：料液比 1∶20（g：mL），微波功率 700 W，微波時(shí)間20 min，提取次數(shù)2次。進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，3次黑果枸杞多糖的平均提取率為6.52%，效果理想。唐靜等[26]研究發(fā)現(xiàn)，黑枸杞多糖提取確定最佳提取工藝為料液比 1∶20（g：mL）、超聲時(shí)間40 min、超聲溫度60℃、超聲功率180 W時(shí)，黑果枸杞多糖提取率為9.19%。梅麗等[27]研究發(fā)現(xiàn)，果膠酶輔助提取黑枸杞多糖的最佳提取條件為料液比 1：35（g：mL）、加酶量 0.02 g、酶解時(shí)間 60 min、酶解溫度30℃時(shí)，黑枸杞多糖提取率達(dá)到最大值26.60%。許英瑞等[28]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波提取黑枸杞多糖的最佳工藝參數(shù)為液料比41.50 mL/g，超聲波功率418 W，提取時(shí)間16 min時(shí)，黑枸杞多糖的最佳條件下提取率可達(dá)（14.13±0.74）%。賈文聰?shù)萚29]研究發(fā)現(xiàn)，超聲波提取黑果枸杞多糖的最佳條件為料液比 1∶10（g：mL）、超聲時(shí)間 30 min、超聲功率70 W時(shí)，黑果枸杞多糖的最佳條件下提取率為7.01%。文獻(xiàn)[26-28]的研究結(jié)果均比本研究的黑果枸杞多糖提取率高，主要原因可能是黑果枸杞產(chǎn)地不同、提取的方法不同，黑果枸杞多糖提取率則有明顯差異。文獻(xiàn)[29]的研究結(jié)果與本研究的研究結(jié)果較接近。因而，合理利用黑果枸杞多糖提取方法，有助于未來(lái)黑果枸杞的開(kāi)發(fā)利用，甚至能為其多糖產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)做出貢獻(xiàn)，為今后植物多糖領(lǐng)域新思路的拓展提供理論依據(jù)與技術(shù)支持。