喬丹丹，李斯琦，格日勒圖，滿都呼，吳金迪，莎日娜*

（1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院 呼和浩特010018 2 呼和浩特市綠碧電子科技有限公司 呼和浩特 010010）

水溶液的結晶由兩個變化過程組成：首先是晶核的形成過程，其次是晶體的生長過程。冰晶的成核過程主要是由熱力學條件決定，而冰晶的生長過程主要由動力學條件決定。肉中溶液的冷凍并不是瞬時完成的，溶液熱量的轉移與形態(tài)改變需要有過程，主要分為3 個階段：液態(tài)降溫階段、相變階段和固態(tài)降溫階段。其中，每個階段都伴隨著熱量的傳遞與溫度的改變，并引起冷凍介質相的轉變[1-4]。常規(guī)冷凍對于食品的影響主要在于食品冷凍時冰晶的形成過程，然而，結晶的過程是隨機的，細胞內(nèi)、外溶液濃度不同，結晶所需的過冷度不同，使胞內(nèi)結晶難以生成，胞外結晶大量生長，破壞細胞結構[5-6]。冰晶的形成對冷凍肉類的質量起著至關重要的作用，冰晶體積過大可能會對組織造成不可逆的損傷，導致解凍時汁液損失增加[7-10]。

等離子電場（靜電場）技術主要是通過設備營造低溫等離子體環(huán)境，當設備通電時，等離子體體系中粒子之間發(fā)生非彈性碰撞，為化學反應提供激發(fā)能量，產(chǎn)生高反應性的活性粒子，主要包括活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）、激發(fā)態(tài)粒子、OH 自由基等[11-13]。低溫等離子體被稱為氣、液、固三態(tài)之外的第4 態(tài)物質，主要存在于自然界中，也可以通過人工方式獲得[14-15]。

等離子電場技術主要作用于過冷階段和初始凍結的發(fā)生，等離子電場的引入可以改變過冷階段的吉布斯自由能（△G0），從而影響冰核的形成[16]。在晶體形成過程中，生成的晶核越多，晶核與水分接觸的總面積越大，結晶的時間越短，生成晶體的體積越小[17]。當引入電場時，結晶過程更加可控，水分子的極化和重新排列使冰晶的形成更加均勻和細小，同時與常規(guī)冷凍技術相比，電場輔助冷凍所需的能量更低[18-19]。

羊肉因具有肉質細嫩、味美多汁、易消化吸收等特點，備受廣大消費者的青睞。然而，由于我國地域廣大、幅員遼闊，因此受地理環(huán)境和經(jīng)濟條件的限制，常規(guī)冷凍貯藏（-18～-20 ℃）羊肉成為主要的貯藏和流通方式，在冷凍貯藏過程中如何更好地保障肉品質是關鍵問題[20-21]。等離子電場技術作為一項節(jié)能型新技術，具有環(huán)保、無污染等特點[22-23]，滿足現(xiàn)代食品工業(yè)向綠色食品生產(chǎn)方式轉變的發(fā)展趨勢，更是目前食品生產(chǎn)中所提倡的。

本研究以羊背最長肌為試驗材料，通過施加等離子電場輔助肉品冷凍貯藏，探究等離子電場在肉品保藏中的作用，為等離子電場技術的實際應用提供一定的理論基礎和試驗參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮羊背最長肌：呼和浩特東瓦窯菜市場；O.C.T.冷凍切片包埋劑，美國SAKURA 公司；蘇木精伊紅染液，白鯊生物科技有限公司；中性樹膠，上海華靈康復器械廠。

1.2 儀器與設備

京制00000246 號電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；KT300 探針溫度計，北京利爾金福科技有限公司；DM4000B 顯微鏡，德國LEICA 公司；等離子電場設備，呼和浩特市綠碧電子科技有限公司；MEV 冷凍切片機，德國SLEE 公司；BC/BD-100HEGW 海爾電冰柜，青島海爾特種電冰柜有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 等離子電場輔助冷凍曲線的繪制 將新鮮的羊背最長肌切成50 g 的方形塊，選取12 塊肉樣隨機分為4 組，以自然冷凍（未施加電場）的肉樣為對照組，等離子電場（冰箱內(nèi)裝有等離子電場設備）環(huán)境下冷凍的肉樣為試驗組。將試驗組羊肉分別置于1，3 kV/m 和5 kV/m 的場強下，用聚乙烯自封袋包裝后分別置于-20 ℃和-35 ℃冰箱中冷凍。溫度測定均采用探針式溫度計，每隔10 min記錄1 次數(shù)據(jù)。

1.3.2 肌肉組織形態(tài)及冰晶觀察 參考劉曉蘭等[24]的方法，將肉樣切成約3 mm×3 mm×5 mm 的長方體肉柱，置自封袋內(nèi)，于-20 ℃和-35 ℃冰箱中冷凍，備用。冷凍48 h 后取出，迅速投入固定液中固定，然后切片、HE 常規(guī)染色、封片。切片觀察使用DM4000B 顯微鏡4 倍物鏡（帶有DFC450 攝像頭及圖像分析軟件LAS V4.4）并拍攝組織圖像。對肉樣形成的冰晶進行計算和分析。

1.3.2.1 冷凍羊肉冰晶面積的測定 冰晶面積測定采用圖像分析軟件LAS V4.4 和Image J。

1.3.2.2 冷凍羊肉冰晶粒徑（相當直徑）的計算粒徑定義為與研究對象具有相等面積的直徑（d），計算公式：

式中，A——冰晶面積（由圖像分析軟件進行面積抓?。?，μm2。

1.3.2.3 冷凍羊肉冰晶圓度的計算 圓度（R）計算公式：

式中，p——周長（由圖像分析軟件進行面積抓?。?，μm。R 值介于0 和1 之間，其值越大，對象越圓。

1.3.3 熱力學變化 將肉樣解凍后的汁液在415 nm 處測定吸光值。此處為氧合肌紅蛋白特征吸收峰，代表系統(tǒng)的分子微觀運動狀態(tài)數(shù)，計算體系的熵（S），公式：

式中，k——玻爾茲曼常數(shù)；Ω——系統(tǒng)分子的微觀狀態(tài)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上試驗數(shù)據(jù)均為3 次重復試驗的平均值，用Excel 2016 和SPSS 26.0 等統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 等離子電場輔助對羊肉凍結和解凍速率的影響

肉樣凍結溫度分別為-20 ℃和-35 ℃。為研究等離子電場對羊肉凍結過程的影響，對不同電場強度處理肉樣的中心溫度變化進行比較。

由圖1 可知，幾組羊肉樣品在-20 ℃的凍結冷凍曲線趨勢大體一致，溫度降低過程都經(jīng)過冷凍前期急劇、最大冰晶生成期平緩和冷凍后期快速3 個階段。其中，對照組總凍結時長為710 min，通過最大冰晶生成帶的時間為130 min；1 kV/m 等離子電場環(huán)境下冷凍的總凍結時長為580 min，通過最大冰晶生成帶的時間為120 min；3 kV/m 等離子電場環(huán)境下冷凍的總凍結時長為470 min，通過最大冰晶生成帶的時間為80 min；而5 kV/m 等離子電場環(huán)境下冷凍肉樣僅用時340 min 達到凍結溫度，通過最大冰晶生成帶的時間為70 min，與對照組相比差異顯著（P<0.05）。試驗結果顯示，經(jīng)輔助不同等離子場強處理的肉樣在冷凍過程中都不同程度地縮短了通過最大冰晶生成帶所需時間，說明輔助等離子電場影響肉樣凍結過程中水的相變過程，且輔助電場強度越大，凍結速率越快，凍結時間越短。

圖1 羊肉樣品-20 ℃凍結過程中心溫度變化曲線圖Fig.1 The curve of the change of central temperature of mutton samples during freezing at -20 ℃

由圖2 可知，-35 ℃環(huán)境下肉樣凍結速率更快，相比于-20 ℃凍結時下降趨勢也更為陡峭。其中，對照組總凍結時長為350 min，通過最大冰晶生成帶的時間為110 min；1 kV/m 等離子電場環(huán)境下冷凍的總凍結時長為250 min，通過最大冰晶生成帶的時間為100 min；3 kV/m 等離子電場環(huán)境下冷凍的總凍結時長為210 min，通過最大冰晶生成帶的時間為80 min；而5 kV/m 等離子電場環(huán)境下冷凍的肉樣僅用時160 min 達到凍結溫度，通過最大冰晶生成帶的時間為40 min，與對照組相比差異顯著（P<0.05），說明等離子電場環(huán)境下-35℃冷凍可以有效加快肉品的凍結速率和通過最大冰晶生成帶的時間，且對冰晶的生成也有較好的影響。

圖2 羊肉樣品-35 ℃凍結過程中心溫度變化曲線Fig.2 The curve of the change of central temperature of mutton samples during freezing at -35 ℃

肉類冷凍過程關鍵是通過最大冰晶生成帶所需時間越短冷凍效果越好。綜合以上不同條件冷凍試驗結果可知，深冷凍即-35 ℃條件下肉中水分通過最大冰晶區(qū)所需時間為110 min；而輔助3 kV/m 和5 kV/m 等離子電場后常規(guī)冷凍即-20 ℃條件下冷凍肉中水分通過最大冰晶生成帶所需時間分別為80 min 和70 min，少于無輔助電場深冷凍（-35 ℃）時間，說明輔助適當?shù)牡入x子電場后常規(guī)冷凍溫度即可達到深冷凍效果且縮短冷凍時間，從而節(jié)約能源。

2.2 等離子電場輔助對羊肉冷凍后微觀結構的影響

羊肉在不同條件下（無電場及1，3 kV/m 和5 kV/m 等離子電場）冷凍（-20 ℃和-35 ℃）后的冰晶形態(tài)如圖3 和圖4 所示：新鮮羊肉的肌纖維組織分布均勻且密集，肌纖維之間空隙很小。肌肉在凍結過程中組織內(nèi)水分結晶，體積膨脹，冰晶的生長過程導致肌肉組織受到破壞。

圖3 -20 ℃冷凍羊肉肌肉纖維和冰晶顯微圖Fig.3 Micrograph of muscle fiber and ice crystal of -20 ℃frozen mutton

圖4 -35 ℃冷凍羊肉肌肉纖維和冰晶顯微圖Fig.4 Micrograph of muscle fiber and ice crystal of -35 ℃frozen mutton

由圖3 可見，-20 ℃無電場條件下冷凍羊肉形成的冰晶粒徑大，在組織內(nèi)分布混亂，肌纖維被冰晶擠壓出現(xiàn)明顯斷裂，機械損傷嚴重，視野可見冰晶面積大。經(jīng)輔助等離子電場處理后，1 kV/m 等離子電場與對照組區(qū)別較?。? kV/m 等離子電場環(huán)境下凍結的肉樣肌纖維排列開始變得有序，受冰晶擠壓變形現(xiàn)象得到改善，冰晶粒徑明顯變小，視野可見冰晶面積明顯縮小；5 kV/m 等離子電場環(huán)境下凍結的效果更好，并達到傳統(tǒng)速凍條件下肉樣的凍結效果，甚至比傳統(tǒng)速凍效果更好。這是由于等離子電場輔助凍結可使肉樣凍結速率加快，形成的冰晶有序粒徑小、分布均勻，對肌纖維細胞造成的擠壓損傷輕微。

如圖4 所示，在-35 ℃凍結條件下，肉樣中的冰晶粒徑基本比較小，對細胞組織構成壓迫損傷也小，肌細胞相對完整，總體優(yōu)于-20 ℃冷凍，并且肉樣中冰晶的狀態(tài)隨電場強度的增加變得越來越好。

綜合分析圖3 與圖4 結果可知，-35 ℃（快速冷凍）與-20 ℃（常規(guī)冷凍）相比，肉樣凍結速率更快，形成的冰晶更小，從而使肌纖維受到的破壞更小。輔助等離子電場冷凍后，-20 ℃輔助5 kV/m 等離子電場冷凍其冰晶形成狀態(tài)及冷凍后肌肉細胞排列狀態(tài)完全可以達到快速冷凍效果（-35 ℃），說明輔助等離子電場后可以提高冷凍效率，在常規(guī)冷凍溫度下達到深冷凍效果。Jin 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，施加靜電場凍結的生理鹽水凍結速率更快，形成的冰晶粒徑小且分布均勻。Xanthakis 等[26]研究發(fā)現(xiàn)12 kV 高壓靜電場下凍結的豬肉肌纖維微觀結構更接近于新鮮肉樣，可以抑制豬肉凍結時冰晶的成長，與本研究結果類似。本研究僅用5 kV/m電壓，更加節(jié)能。

2.3 等離子電場輔助對羊肉冷凍后冰晶結構的影響

采用LAS V4.4 和Image J 圖像分析軟件和相應計算公式對冰晶粒徑（相當直徑）、圓度、面積進行測定，結果見表1，表2 及圖5。

表1 -20 ℃冷凍方式處理肉樣的冰晶分析Table 1 Ice crystal analysis of meat samples treated by freezing at -20 ℃

表2 -35 ℃冷凍處理肉樣的冰晶分析Table 2 Ice crystal analysis of meat samples treated by freezing at -35 ℃

圖5 不同冷凍處理條件下冰晶面積占比Fig.5 Proportion of ice crystal area under different freezing treatment conditions

由表1 可得，在溫度-20 ℃下輔助不同等離子電場凍結后羊肉中冰晶面積、冰晶粒徑（相當直徑）、冰晶圓度都有不同的變化。隨著輔助電場強度的增加，冰晶面積和冰晶粒徑明顯減少，其中輔助5 kV/m 電壓的冰晶面積、冰晶粒徑（相當直徑）均為最小，與未輔助電場的對照組均有顯著差異（P<0.05）。冰晶圓度越接近1 形成的冰晶越圓，對周邊肌纖維細胞的擠壓破壞越小。本試驗結果中冰晶圓度值在0.63～0.88 之間，其中輔助5 kV/m電壓的冰晶圓度值最大，與對照組相比有顯著差異（P<0.05）。試驗結果表明，輔助等離子電場冷凍后形成的冰晶面積小，冰晶粒徑（相當直徑）小，圓度值大，對周邊羊肉肌纖維細胞造成的機械損傷小，且輔助等離子電場場強越大效果越顯著。

由表2 可得，在-35 ℃輔助不同等離子電場凍結后羊肉中冰晶面積、冰晶粒徑、冰晶圓度的變化規(guī)律與趨勢與表1 中-20 ℃溫度下輔助不同等離子電場凍結結果基本相似，而不同的是-35 ℃各組的數(shù)據(jù)更優(yōu)。冰晶面積和冰晶粒徑小，冰晶圓度值均在0.80 以上，3 個輔助電場試驗組間沒有顯著差異（P>0.05）。-20 ℃輔助5 kV/m 電壓組的冰晶面積、冰晶粒徑（相當直徑）和冰晶圓度值均優(yōu)于-35 ℃對照組和-35 ℃輔助1 kV/m 電壓組，特別是-20 ℃輔助5 kV/m 電壓組冰晶圓度值是所有試驗組中最大的。

圖5 所示，在相同的冷凍溫度下，隨著輔助等離子電場強度的增加，冰晶面積比例均有明顯下降趨勢。輔助5 kV/m 等離子電場-20 ℃凍結的冰晶面積比例僅為3.79%，顯著低于-20 ℃無電場冷凍的冰晶面積比例49.89%（P<0.05），并且低于-35℃速凍的冰晶面積比例5.97%。因此，輔助5 kV/m等離子電場-20 ℃冷凍羊肉的方式可以代替-35℃速凍方式。

綜合以上試驗結果，輔助等離子電場冷凍可有效改善冷凍速率，冰晶形成狀態(tài)，冰晶粒徑（相當直徑）、冰晶圓度，減少冷凍過程中肌纖維細胞損傷，保持肌纖維組織的完整性。結合本次試驗與實際應用，從節(jié)約能源等綜合考量，確認20 ℃輔助5 kV/m 電壓冷凍羊肉條件是最理想的冷凍條件。

2.4 熱力學角度分析等離子電場輔助對羊肉冷凍效果的影響

肉是一種膠體體系，在冷凍過程中會發(fā)生部分玻璃化轉變，經(jīng)等離子電場處理，可以加速肉中冰晶凍結，以形成數(shù)量更少，體積更小的冰晶，減少對肉的傷害，增加肉的玻璃化程度。與此同時，體系的穩(wěn)定性增加[27]，熵隨之減少。S=klnΩ 是統(tǒng)計學中心概念，系統(tǒng)某一宏觀態(tài)對應的微觀態(tài)數(shù)愈多，即它的混亂度愈大，則該狀態(tài)的熵也愈大[28]。肉樣的玻璃化程度會影響肌纖維的完整度，玻璃化程度越高，肌原纖維越完整，解凍后肉汁中肌紅蛋白含量越少，肌紅蛋白在紫外-可見區(qū)域具有特征吸收，在410 nm 波長附近的強吸收峰稱為Soret帶（B 帶），在空氣中轉化為氧合肌紅蛋白時Soret會發(fā)生藍移，在415 nm 左右[29-30]，因此，可使用樣品解凍后肉汁在415 nm 處的吸光值來表示系統(tǒng)的微觀狀態(tài)數(shù)Ω，并以此計算不同樣品的熵。

由表3 可知，在-20 ℃冷凍條件下，隨著電場強度的增大，所對應的吸光值減小，且具有顯著性差異（P<0.05），表明在凍結過程中施加電場可顯著降低熵值。

表3 -20 ℃冷凍處理肉樣和鮮肉在415 nm 處的吸光值Table 3 Absorbance at 415 nm of meat sample frozen at -20 ℃

由表4 可知，在-35 ℃冷凍條件下，隨著電場強度的增大，所對應的吸光值減小，且具有顯著性差異（P<0.05）。在5 kV/m 等離子電場下處理肉樣的吸光值與鮮肉最為接近。

表4 -35 ℃冷凍處理肉樣和鮮肉在415 nm 處的吸光值Table 4 Absorbance at 415 nm of meat sample frozen at -35 ℃

綜上所述，在-35 ℃輔助5 kV/m 電壓下冷凍效果最好，解凍后與鮮肉最為接近。-20 ℃輔助5 kV/m 電壓冷凍優(yōu)于-35 ℃無電場冷凍?？紤]到實際生產(chǎn)中常規(guī)速凍即可達到日常使用要求，以及從節(jié)約能源的角度考量，選用-20 ℃下5 kV/m 凍結最為適合。

3 結論

1）輔助不同場強等離子電場時肉樣凍結速率均優(yōu)于對照組（無輔助電場），在-20 ℃和-35 ℃冷凍條件下，均是輔助5 kV/m 等離子電場組最大冰晶生期時間最短，與對照組（相同溫度無電場）相比均有差異顯著（P<0.05）。

2）組織切片顯示輔助不同場強（1，3，5 kV/m）等離子電場凍結肉樣冰晶的形態(tài)也優(yōu)于對照組。-35 ℃輔助5 kV/m 凍結冰晶面積和平均粒徑最小，肌纖維細胞斷裂破壞程度更?。?20 ℃輔助5 kV/m 凍結肉樣的冰晶圓度最大。上述兩個試驗組和對照組（相同溫度無電場）相比均有顯著性差異（P<0.05）。

3）運用玻爾茲曼公式間接分析肉樣的熵值，在-20 ℃和-35 ℃冷凍條件下，輔助5 kV/m 等離子電場凍結時的熵值最小，與對照組相比均具有顯著性差異（P<0.05）。

4）綜合試驗結果和日常生產(chǎn)，以及從節(jié)約能源的考量，-20 ℃輔助5 kV/m 等離子電電場冷凍可作為一種新型冷凍方式應用于生產(chǎn)。