鮑正好， 王阿琴， 許月新， 劉菲菲， 余 鈞， 何紅鵬*

（1.天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457；2.杭州佰倍優(yōu)生物科技有限公司，浙江 杭州 310020；3.北京市門頭溝區(qū)醫(yī)院，北京 102300）

牛血是肉制品行業(yè)中一類重要的副產(chǎn)品，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)和多種生物活性物質(zhì)，具有較好的開發(fā)利用前景。 牛血除了含有較高的蛋白質(zhì)外，還含有鐵、鈉、鉀、鈣、鎂等礦物質(zhì)[1-2]。 目前的畜產(chǎn)品加工現(xiàn)狀是畜血總體利用率不到總產(chǎn)量的30% ，其中牛血液由于血腥味較重、消化性和適口性差、色澤感觀不佳且原料血液在常溫下難以長(zhǎng)期保存等因素，利用率更低[3]。 據(jù)報(bào)道，我國(guó)年產(chǎn)牛血可達(dá)到57.25 萬t，因此，對(duì)牛血的有效利用，可以減少牛制品加工過程中產(chǎn)生的浪費(fèi)，充分發(fā)揮牛制品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

鐵是人體所必需的微量元素之一，參與線粒體中呼吸鏈電子傳遞、血紅蛋白和肌紅蛋白合成等生命活動(dòng)，對(duì)于人體功能特別是骨髓造血功能至關(guān)重要[4]。 持續(xù)的鐵攝入量不足或慢性失血會(huì)導(dǎo)致機(jī)體缺鐵，骨髓內(nèi)的紅細(xì)胞生成減少，血紅蛋白合成障礙，進(jìn)而出現(xiàn)IDA（iron-deficiency anemia，IDA）的狀態(tài)，表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血[5-6]。 IDA 目前仍然是全球面臨的主要公共衛(wèi)生問題，2010 年全球性調(diào)查顯示，貧血影響了世界上三分之一的人口，而其中一半的病例是由于缺鐵所導(dǎo)致的[7]。 世界衛(wèi)生組織綜合195 個(gè)國(guó)家的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2016 年全球大約有12.4 億人口患有IDA[8]。由于兒童、青少年和婦女生理上對(duì)鐵需求增加而鐵攝入量減少或病理性吸收缺陷或慢性失血等因素， 使得兒童與婦女的IDA 發(fā)病率更高[9-11]。

目前治療IDA 廣泛推薦的方法是補(bǔ)鐵，主要采用口服與注射方式進(jìn)行。 口服補(bǔ)鐵劑常見的有硫酸亞鐵片、 生血寧片和蛋白琥珀酸鐵口服溶液等，大多為非血紅素鐵。 為避免對(duì)胃腸道產(chǎn)生副作用，上述補(bǔ)鐵劑通常做成緩釋劑型，但鐵的緩慢釋放容易導(dǎo)致鐵的吸收率降低[12]。 另一種補(bǔ)鐵方式是靜脈注射，這種方式可有效避免一些患者對(duì)于口服補(bǔ)鐵劑的不耐受以及口服補(bǔ)鐵效果緩慢的缺點(diǎn)。 常用的靜脈補(bǔ)鐵劑有右旋糖酐鐵、羧基麥芽糖鐵及異麥芽糖酐鐵等[13-14]。 靜脈補(bǔ)鐵需要在醫(yī)護(hù)人員的專業(yè)操作下進(jìn)行，相比之下，口服補(bǔ)鐵更加方便。

本研究旨在通過建立IDA 大鼠模型，評(píng)價(jià)口服含鐵牛血肽對(duì)IDA 的治療功效和胃腸道副作用，探索一種安全有效的新型口服補(bǔ)鐵劑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

含鐵牛血肽粉：多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù)90.06%，鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5 g/kg， 由杭州佰倍優(yōu)生物科技有限公司提供；生血寧片：武漢聯(lián)合藥業(yè)有限責(zé)任公司；低鐵飼料（鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.873 mg/kg）、正常飼料（鐵質(zhì)量分?jǐn)?shù)51.9 mg/kg）：南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)

3 周齡斷奶SPF 級(jí)雌性SD 大鼠， 由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供， 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2017-0005，喂養(yǎng)于不銹鋼鼠籠。 在籠底放置不銹鋼架子將大鼠架起以便將大鼠與糞便隔離。 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房溫度（23±3） ℃，濕度（50±10）%及光照12 h/12 h 光/暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)大鼠。 實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)為SYXK（津）2018-0001。

1.3 主要儀器與試劑

BC-5100 血液分析儀：邁瑞生物醫(yī)療電子股份（深圳）有限公司；UVmini-1240 可見光分光光度計(jì)：島津企業(yè)管理（中國(guó)）有限公司；SpectraMax190 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀：美谷分子儀器（上海）有限公司；血清鐵測(cè)定試劑盒：南京建成生物工程研究所；大鼠鐵蛋白酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 IDA 大鼠模型的建立購(gòu)買 （50±10） g SPF級(jí)3 周齡初斷奶雌性SD 大鼠，隨機(jī)選取12 只大鼠作為對(duì)照飼料組，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中飼喂正常飼料和去離子水，其余大鼠則以低鐵飼料及去離子水喂養(yǎng)3 周，至血紅蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為60 g/L 左右。

1.4.2 大鼠恢復(fù)實(shí)驗(yàn)造模成功后，按每組6 只隨機(jī)分為對(duì)照組、血肽低劑量組（0.8 g/（kg·d））、血肽中劑量組（2.4 g/（kg·d））、血肽高劑量組（6.4 g/（kg·d））和生血寧組（0.11 片/d）。 對(duì)照飼料組繼續(xù)以正常飼料和去離子水喂養(yǎng)，其他各組繼續(xù)以低鐵飼料及去離子水進(jìn)行喂養(yǎng)。 各治療組每日上午9 時(shí)灌胃給藥，共5 周，對(duì)照飼料組與空白對(duì)照組則給予等量去離子水。 大鼠末次灌胃后禁食12 h，根據(jù)體質(zhì)量腹腔注射3 g/dL 的戊巴比妥鈉， 劑量為0.2 mL/hg，大鼠麻醉后取腹主動(dòng)脈血，然后取胃組織，最后大鼠尸體作為特殊垃圾進(jìn)行無害化處理。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)

1.5.1 大鼠的一般情況給藥前后每周測(cè)一次體質(zhì)量。

1.5.2 大鼠血液各項(xiàng)指標(biāo)的檢測(cè)取大鼠腹主動(dòng)脈血后，加抗凝劑的全血采用全自動(dòng)血液分析儀檢測(cè) 白 細(xì) 胞 （white blood cell，WBC）、 血 紅 蛋 白（hemoglobin，HGB）、紅細(xì)胞（red blood cell，RBC）和紅細(xì)胞壓積（hematocrit，HCT）。 腹主動(dòng)脈血分離得到血清，采用試劑盒檢測(cè)血清鐵（serum iron，SI）及血清鐵蛋白（serum ferritin，SF）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

使用GraphPad Prism 8.0.2 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，各組數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示， 各組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛血肽對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響

消瘦是IDA 的典型癥狀之一，與人IDA 癥狀一致，實(shí)驗(yàn)中IDA 大鼠的體質(zhì)量明顯低于對(duì)照飼料組大鼠，見表1。為了評(píng)價(jià)含鐵牛血肽對(duì)貧血大鼠體質(zhì)量的影響，每周對(duì)大鼠體質(zhì)量進(jìn)行測(cè)量，觀察大鼠體質(zhì)量變化。

表1 牛血肽對(duì)大鼠體質(zhì)量的影響Table 1 Effect of bovine blood peptide on body weight of rats

對(duì)照飼料組大鼠體質(zhì)量平均增長(zhǎng)99.57 g，而空白對(duì)照組大鼠體質(zhì)量平均增長(zhǎng)僅46.87 g，與對(duì)照飼料組差異顯著（P＜0.05）； 各血肽組和生血寧組大鼠體 質(zhì) 量 平 均 增 長(zhǎng) 分 別 為78.38、111.40、104.20、106.37 g，都明顯高于空白對(duì)照組（P＜0.05），與對(duì)照飼料組相比均無顯著差異（P＞0.05），說明血肽可以有效改善IDA 對(duì)于大鼠體質(zhì)量增加的影響。 進(jìn)一步比較低劑量和中高劑量組，可見隨著血肽劑量的增加，大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)幅度呈加大趨勢(shì)， 但是中高劑量組差別不大，說明中劑量組效果達(dá)到峰值，是最優(yōu)劑量。

2.2 牛血肽對(duì)大鼠白細(xì)胞數(shù)量的影響

文獻(xiàn)報(bào)道，IDA 會(huì)導(dǎo)致大鼠白細(xì)胞數(shù)量上升，這可能與貧血導(dǎo)致的缺氧有關(guān)[15]。當(dāng)機(jī)體缺氧時(shí)，會(huì)引起炎性反應(yīng)性變化，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的分化、成熟及存活。 為了觀察血肽的抗貧血作用，檢測(cè)了大鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量。

血常規(guī)結(jié)果顯示，IDA 大鼠的外周血白細(xì)胞數(shù)量約為正常對(duì)照大鼠的2 倍，而血肽與生血寧均可顯著性改IDA 導(dǎo)致的白細(xì)胞增多（P＜0.01）。 治療后白細(xì)胞水平與正常對(duì)照組相比無明顯差異 （P＞0.05）。血肽高中低劑量組白細(xì)胞數(shù)量均接近或略低于正常對(duì)照組，見表2。

表2 牛血肽對(duì)大鼠白細(xì)胞的影響Table 2 Effects of bovine blood peptide on rat leukocytes

2.3 牛血肽對(duì)大鼠血紅蛋白水平和紅細(xì)胞數(shù)量的影響

血紅蛋白由珠蛋白與血紅素組成，其中血紅素是鐵與卟啉形成的金屬卟啉配合物[16]，因此鐵是合成血紅蛋白的重要原料， 而血紅蛋白含量是評(píng)價(jià)IDA 療效的一項(xiàng)重要指標(biāo)。 缺鐵導(dǎo)致的血紅蛋白降低會(huì)引起紅細(xì)胞生成減少，因此，反映紅細(xì)胞數(shù)量的2 個(gè)參數(shù)，即紅細(xì)胞計(jì)數(shù)與紅細(xì)胞壓積也是檢驗(yàn)IDA 療效的主要指標(biāo)[17]。 牛血肽由牛血細(xì)胞經(jīng)蛋白酶水解制成，其中富含的鐵元素主要以血紅素鐵的形式存在。為了評(píng)價(jià)含血紅素鐵牛血肽對(duì)IDA 大鼠血紅蛋白水平和紅細(xì)胞數(shù)量的影響，檢測(cè)了治療后各組大鼠HGB、RBC 和HCT 水平。

由表3 可知， 經(jīng)過血肽和生血寧治療后，HGB水平上升，與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05）。隨著血肽劑量增加，HGB 水平呈上升趨勢(shì)， 說明血肽有效改善貧血并呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)。 實(shí)驗(yàn)終止時(shí)各治療組HGB 水平仍低于對(duì)照飼料組， 其原因可能是治療時(shí)間短，貧血尚未完全糾正。

表3 牛血肽對(duì)大鼠紅細(xì)胞的影響Table 3 Effects of bovine blood peptide on red blood cell in rats

IDA 模型組大鼠RBC 和HCT 明顯低于對(duì)照飼料組。 經(jīng)治療，血肽組與生血寧組RBC 及HCT 水平上升，與空白對(duì)照組相比有顯著差異（P＜0.05），說明血肽與生血寧均可有效改善IDA 大鼠RBC 以及HCT 的下降。 血肽中、高劑量組RBC 數(shù)量接近，且明顯高于生血寧組，提示中高劑量牛血肽促進(jìn)RBC生成效果強(qiáng)于生血寧。在改善HCT 指標(biāo)上，血肽中、高劑量組也比生血寧組的效果更好。 以上結(jié)果表明含鐵牛血肽促進(jìn)紅細(xì)胞生成，且中劑量牛血肽效果最好。

2.4 牛血肽對(duì)大鼠血清鐵代謝的影響

食物中的鐵在十二指腸被吸收后進(jìn)入血液循環(huán)，稱為血清鐵，再通過與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合被運(yùn)輸?shù)焦撬栌糜谠煅?血清鐵蛋白是體內(nèi)儲(chǔ)藏鐵的主要載體，可釋放鐵離子來保障骨髓造血等鐵元素參與的生命活動(dòng)過程[18]。SI 和SF 是反映鐵代謝的常用生化指標(biāo)， 對(duì)于IDA 的診斷和治療效果評(píng)價(jià)具有重要價(jià)值[19-21]。

治療后大鼠SI 與SF 檢測(cè)結(jié)果顯示，SI 和SF均得到了改善，見表4。 血肽中、高劑量組的SI 與SF水平與對(duì)照飼料組相比均無顯著差異（P＞0.05），且與空白對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），說明含鐵牛血肽可改善IDA 大鼠的低鐵狀態(tài)， 增加體內(nèi)鐵存儲(chǔ)。 與空白對(duì)照組相比，血肽低劑量組與生血寧組SI 和SF 有所增加，但是無顯著差異（P＞0.05）。 因此，中、高劑量含鐵牛血肽改善大鼠SI 和SF 的效果更好。

表4 牛血肽對(duì)大鼠血清鐵代謝的影響Table 4 Effect of bovine blood peptide on serum iron metabolism in rats

2.5 牛血肽對(duì)大鼠胃的影響

貧血會(huì)導(dǎo)致皮膚黏膜蒼白，而常見的口服鐵劑對(duì)胃腸道黏膜有一定的刺激，容易引起消化不良等副作用[22]。 在評(píng)價(jià)藥物對(duì)IDA 治療效果時(shí)，對(duì)于胃的觀察必不可少。 治療結(jié)束后，取大鼠胃部，沿胃大彎縱向切開，觀察胃黏膜變化。

如圖1 所示， 與對(duì)照飼料組大鼠胃黏膜相比，空白對(duì)照組大鼠胃黏膜顏色蒼白， 符合貧血特征。血肽組與生血寧組大鼠的胃黏膜表面紅潤(rùn)且沒有出現(xiàn)充血、水腫、潰瘍等損傷，說明在治療過程中，含鐵牛血肽與生血寧不但未對(duì)大鼠胃黏膜造成明顯損害而且顯著改善了胃黏膜色澤。

圖1 不同組大鼠胃解剖圖Fig.1 Gastric anatomy of rats in different groups

3 結(jié) 語

牛血作為原料被用于生產(chǎn)血球蛋白粉、血漿蛋白粉等動(dòng)物性蛋白飼料，在飼料工業(yè)中得到了廣泛應(yīng)用并且取得了較好效益[23]。 從牛血中還可提取血紅素來制備氯化血紅素[24]，用于預(yù)防和治療IDA[25]。 開發(fā)利用牛血肽是加工牛血的一條新途徑，將提高牛血的利用率和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，具有很好的市場(chǎng)前景。

目前臨床上常用的口服補(bǔ)鐵劑如硫酸亞鐵等屬于無機(jī)鐵，容易刺激胃腸道，在服用過程中可能出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹瀉等不良反應(yīng)[26]。 而本研究采用的牛血肽所含鐵為血紅素鐵，對(duì)胃腸道刺激小。 血紅素鐵以卟啉鐵的形式存在，比無機(jī)鐵更容易被十二指腸上皮細(xì)胞吸收[27]，生物利用率也更高[28-29]。 有文獻(xiàn)報(bào)道血紅素鐵治療IDA 的效果比非血紅素鐵更優(yōu)[30]。

本研究用的陽性對(duì)照藥物生血寧是一種治療貧血的中藥，在治療IDA 方面具有較好的臨床效果和安全性[31-32]。 生血寧主要成分為蠶沙提取物，含有鐵葉綠酸鈉和葉綠素衍生物，是一種有機(jī)卟啉鐵[33]，因此在本研究中被用作陽性對(duì)照。 本研究中大鼠的生血寧給藥劑量是按照藥品說明書規(guī)定的成人用藥量換算得到。

紅細(xì)胞生成的調(diào)節(jié)機(jī)制是促紅細(xì)胞生成素與促紅細(xì)胞生成素受體結(jié)合并激活下游信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)紅細(xì)胞增殖與成熟[34]。根據(jù)這一機(jī)制，有研究人員設(shè)計(jì)合成出多種不同促紅細(xì)胞生成素模擬肽，都顯著提升了RBC 數(shù)量與HGB 含量[35-36]。 在本研究中， 中高劑量牛血肽組在改善RBC 與HGB 水平上效果優(yōu)于低劑量組和生血寧組，這提示除了補(bǔ)鐵作用，含鐵牛血肽的某些肽類物質(zhì)可能促進(jìn)了紅細(xì)胞增殖與血紅蛋白的合成，具體是由哪種氨基酸序列的多肽起到關(guān)鍵性作用則需進(jìn)一步研究。

采用灌胃方法給予IDA 大鼠含鐵牛血肽治療，有效緩解了因貧血導(dǎo)致的低體質(zhì)量和黏膜蒼白癥狀，恢復(fù)了血常規(guī)、血清鐵等血液指標(biāo)，并且未見損傷大鼠的消化道黏膜。含鐵牛血肽對(duì)大鼠IDA 治療是有效的，開發(fā)富含血紅素鐵的牛血肽治療IDA，值得應(yīng)用與推廣。