董玢 張弛 劉涓 柴立民

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

補(bǔ)腎生血解毒方對(duì)再生障礙性貧血小鼠白細(xì)胞生成的影響

董玢1張弛2劉涓1柴立民1

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)教育部和北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100700；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029）

目的：探討補(bǔ)腎生血解毒方對(duì)理化因素致骨髓抑制造成再生障礙性貧血（AA）模型小鼠白細(xì)胞生成的影響。方法：BALB/C小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和補(bǔ)腎生血解毒方小、中、大劑量組，除空白組以外其余各組小鼠以60Co-γ射線復(fù)合環(huán)磷酰胺致小鼠骨髓造血抑制，補(bǔ)腎生血解毒方小、中、大劑量組分別給予不同劑量中藥灌胃，其余2組予等量生理鹽水灌胃。血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)小鼠外周血中白細(xì)胞（WBC）的改變，酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)外周血血清中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）含量的差異，real-time PCR檢測(cè)骨髓細(xì)胞中GM-CSF受體α、β基因表達(dá)的改變。結(jié)果：與模型組比較，補(bǔ)腎生血解毒方可以明顯提高AA模型小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量（小劑量作用14d），顯著增加外周血血清中GM-CSF含量和骨髓細(xì)胞中GM-CSF受體基因的表達(dá)。結(jié)論：補(bǔ)腎生血解毒方治療AA發(fā)揮療效作用，可能與提高GM-CSF活性和誘導(dǎo)造血細(xì)胞分化為成熟的白細(xì)胞，并促進(jìn)其增殖、發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用有關(guān)。

再生障礙性貧血 補(bǔ)腎生血解毒方 白細(xì)胞 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞 骨髓細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)研究

再生障礙性貧血（aplastic anermia，AA）是由于化學(xué)、物理、生物因素及不明原因引起的骨髓造血功能衰竭，紅骨髓總?cè)萘繙p少，代以脂肪髓，骨髓中無(wú)惡性腫瘤浸潤(rùn)，以全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)的一組綜合征，臨床上常表現(xiàn)為較為嚴(yán)重的貧血、出血和感染[1]。我們以當(dāng)歸補(bǔ)血湯和龜鹿二仙膠化裁創(chuàng)立補(bǔ)腎生血解毒方，用于臨床治療急慢性AA，取得了良好的治療效果。為進(jìn)一步研究補(bǔ)腎生血解毒方治療AA的作用機(jī)制，我們以理化因素致骨髓抑制造成AA小鼠模型，予補(bǔ)腎生血解毒方干預(yù)，觀察該方對(duì)AA小鼠外周血白細(xì)胞（White blood cell，WBC）生成的影響，以及血清中粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocytemacrophage colony stimulating factor，GM-CSF）含量和GMCSF受體（GM-CSF receptor，GM-CSF1R）α、β基因表達(dá)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/C近交系小鼠50只，雄性，體重（20±2）g，8～12周齡，動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)：0269024，飼養(yǎng)于東直門(mén)醫(yī)院屏障級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物與試劑環(huán)磷酰胺購(gòu)自山西普德藥業(yè)股份有限公司；補(bǔ)腎生血解毒方，處方：龜版膠、鹿角膠、人參、枸杞子、黃芪、當(dāng)歸、黃連（1∶2∶3∶4∶6∶1∶1），由北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院藥劑科提供；GM-CSF酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）kit購(gòu)自武漢博士德生物有限責(zé)任公司，SYBR Green PCR Master Mix購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組、造模及藥物干預(yù)將小鼠隨機(jī)分為5組，分別為空白組、模型組和補(bǔ)腎生血解毒方小、中、大劑量組，每組10只。除空白組以外，其余各組小鼠一次全身2.5Gy60Co-γ射線照射（劑量率1.1053Gy/min，距離240cm，時(shí)間135s），空白組小鼠假照射（鉛磚屏蔽）。分別于照射后第4、5、6天腹腔注射環(huán)磷酰胺40mg/kg[2]，空白組小鼠注射等容量生理鹽水。造模結(jié)束后第1天開(kāi)始藥物干預(yù)，補(bǔ)腎生血解毒方小、中、大劑量組按成人劑量的5、10、20倍計(jì)算，分別灌胃給予補(bǔ)腎生血解毒方6.14、12.29、24.57g/（kg·d），模型組和空白組分別給予等量的生理鹽水，連續(xù)灌胃13d。

2.2 外周血WBC數(shù)量檢測(cè)分別于造模結(jié)束后0、7、14d，小鼠尾靜脈取血，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)外周血中WBC數(shù)量。

2.3 外周血血清及骨髓細(xì)胞樣品制備藥物干預(yù)結(jié)束后，小鼠摘眼球取血，室溫放置1h后，2500r/min離心15min，分離血清，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)銭LISA檢測(cè)。分離小鼠股骨，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）沖洗骨髓細(xì)胞至平皿中，離心收集細(xì)胞，PBS重懸成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度為1×107/mL，備real-time PCR檢測(cè)。

2.4 EILSA檢測(cè)血清中GM-CSF的含量取小鼠外周血血清，嚴(yán)格按照ELISA kit說(shuō)明操作，檢測(cè)小鼠外周血血清中GM-CSF的含量。

2.5 Real-time PCR檢測(cè)骨髓細(xì)胞中GM-CSF1Rα、β基因的表達(dá)Trizol一步法提取骨髓細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計(jì)看家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和GM-CSFRα、β特異性PCR引物，real-timePCR檢測(cè)小鼠骨髓細(xì)胞中GMCSFRα、β基因表達(dá)的改變。取一樣品cDNA作為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品，倍比稀釋?zhuān)訥APDH為擴(kuò)增引物，與目的基因在同一程序中擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)熒光檢測(cè)閾值讀取目的基因的相對(duì)拷貝數(shù)，計(jì)算其與GAPDH基因拷貝數(shù)的比值，以消除實(shí)驗(yàn)誤差。PCR引物序列——GAPDH：sense，5'-CAGCAAG GACACTGAGCAAGA；antisense，5'-GCCCCTCCTGTTATTATG GGG。GM-CSFRα：sense，5'-TGAAGCGATGCTGATAGACG；antisense，5'-TCCAGGGTGATTGACAGGAT。GM-CSFRβ：sense，5'-AAAGTGCCAAAATGGACCAG；antisense，5'-AGCTGCAGA TGATGTGGTTG。由北京諾賽基因組研究中心有限公司合成。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果采用（±s）表示，通過(guò)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)做正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)比較采用LSD法或Tamhane法。P＜0.05為差異有顯著性，P＜0.01為差異有極顯著性。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎生血解毒方對(duì)AA小鼠外周血中白細(xì)胞數(shù)量的影響見(jiàn)表1。與空白組比較，其余各組小鼠在造模完成后外周血中WBC（即粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）數(shù)量均明顯下降（P＜0.01）。予中藥或生理鹽水灌胃7d后，模型組和補(bǔ)腎生血解毒方各劑量組小鼠WBC無(wú)明顯上升趨勢(shì)；14d后，與模型組比較，補(bǔ)腎生血解毒方各劑量組外周血WBC均呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，其中補(bǔ)腎生血解毒方小劑量組WBC升高較為明顯（P＜0.05）。

表1 補(bǔ)腎生血解毒方對(duì)AA小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，g/L）

表1 補(bǔ)腎生血解毒方對(duì)AA小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)量的影響（±s，g/L）

注：△△與空白組比較，P＜0.01；*與模型組比較，P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)造模后天數(shù)14d 0.59±0.20△△0.48±0.23△△補(bǔ)腎生血解毒方小劑量組100.46±0.19△△0.50±0.24△△3.32±0.32△△*補(bǔ)腎生血解毒方中劑量組100.46±0.27△△0.36±0.23△△2.60±0.38△△補(bǔ)腎生血解毒方大劑量組100.48±0.17△△0.68±0.32△△2.64±0.57△△0d7d空白組104.74±1.243.95±1.065.09±0.88模型組102.41±0.93△△

3.2 補(bǔ)腎生血解毒方對(duì)AA小鼠外周血血清中GM-CSF和骨髓細(xì)胞GM-CSF受體基因表達(dá)的影響見(jiàn)表2。與模型組和空白組相比，補(bǔ)腎生血解毒方各劑量組小鼠血清中GMCSF顯著升高（P＜0.01），模型組與空白組相比GM-CSF含量無(wú)顯著性差異；與模型組比較，補(bǔ)腎生血解毒方各劑量組骨髓細(xì)胞中GM-CSFRα基因表達(dá)明顯升高（P＜0.01）；而GMCSFRβ基因表達(dá)僅補(bǔ)腎生血解毒方大劑量組與模型組和空白組相比有極顯著性差異（P＜0.01）。

表2 各組小鼠血清中GM-CSF含量和骨髓細(xì)胞中GM-CSFRα、β基因表達(dá)的差異（±s）

表2 各組小鼠血清中GM-CSF含量和骨髓細(xì)胞中GM-CSFRα、β基因表達(dá)的差異（±s）

注：**與模型組比較，P＜0.01；△△與空白組比較，P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)GM-CSF含量（pg/mL）GM-CSFRα/GAPDH基因表達(dá)相對(duì)拷貝數(shù)比值GM-CSFRβ/GAPDH基因表達(dá)相對(duì)拷貝數(shù)比值空白組1079.717±10.8010.875±0.5121.096±0.489模型組1072.841±11.1990.318±0.2420.530±0.302中藥小劑量組10129.120±32.211**△△0.930±0.292**0.720±0.399中藥中劑量組10152.559±25.236**△△0.966±0.379**1.302±0.793中藥大劑量組10150.476±24.892**△△1.134±0.540**2.795±1.063**△△

4 討論

根據(jù)AA的中醫(yī)證候特點(diǎn)，外邪和內(nèi)傷等多種致病因素導(dǎo)致氣血虧虛，傷及肝脾腎諸臟，氣血不足，髓脈空虛，內(nèi)生毒邪留滯彌散，耗損髓脈，精不化血，出現(xiàn)血虛的證候。氣血精津虧損，毒邪內(nèi)生，髓脈受損，血脈空虛，氣血凝滯，內(nèi)毒進(jìn)一步損傷血脈，形成循環(huán)往復(fù)的病理?yè)p傷。AA病位在肝脾腎，髓脈損傷之本虛為主，內(nèi)毒侵蝕之標(biāo)實(shí)為輔。在治療上應(yīng)以填補(bǔ)腎精為主，輔以益氣生血解毒。龜鹿二仙膠具有填補(bǔ)精血、益氣壯陽(yáng)的功效，用于本方取其補(bǔ)腎填精；當(dāng)歸補(bǔ)血湯是金元時(shí)期李東垣創(chuàng)制的“補(bǔ)氣生血”經(jīng)典名方，配以黃連，奏“補(bǔ)氣生血解毒”之功。諸藥協(xié)同，補(bǔ)腎填精、生血解毒，達(dá)到治療AA的目的。

GM-CSF是一種調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增殖和分化的細(xì)胞因子，是分子量為22kD的糖蛋白。GM-CSF與GM-CSFR結(jié)合后促進(jìn)多種造血細(xì)胞的存活、增殖、分化，并通過(guò)提高中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞等的數(shù)量發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[3]。體外實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，隨著GM-CSF濃度的增加，首先單核巨噬細(xì)胞增殖，隨后是中性粒細(xì)胞，最后是嗜酸性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。此外GM-CSF還能刺激多能干細(xì)胞和早期紅細(xì)胞的增殖和分化[4-6]。GM-CSFR由α、β兩個(gè)受體組成，都屬于I型細(xì)胞因子超家族成員。α受體可與GM-CSF發(fā)生特異性結(jié)合，但親和力較低；單獨(dú)β受體不能與GM-CSF結(jié)合，但與α受體結(jié)合可形成高親和力的聚合體。GM-CSF與受體結(jié)合后引起αβ受體二聚化和四聚化，活化絡(luò)氨酸激酶，受體本身磷酸化，動(dòng)員SH2和PTR結(jié)構(gòu)域的蛋白到受體，傳遞刺激信號(hào)，誘發(fā)促進(jìn)造血干細(xì)胞向WBC轉(zhuǎn)化，促進(jìn)WBC增殖[7]。

AA是因多重因素所致的骨髓造血功能衰竭，是以造血干細(xì)胞數(shù)量減少或質(zhì)的缺陷為主導(dǎo)致的造血障礙，臨床上以全血細(xì)胞減少為主要表現(xiàn)。重型AA成熟的治療措施是免疫抑制治療和造血干細(xì)胞移植。當(dāng)缺乏組織相容性同源供體、患者年齡或無(wú)法負(fù)擔(dān)高額的干細(xì)胞移植成本等情況出現(xiàn)時(shí)，免疫抑制治療就成為首選的AA治療措施[8]。中醫(yī)藥治療的多層次、多靶點(diǎn)的整體治療模式，是造血干細(xì)胞移植和免疫抑制治療的有效補(bǔ)充治療模式。我們的前期實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，補(bǔ)腎生血解毒方通過(guò)刺激干細(xì)胞因子的表達(dá)，誘導(dǎo)造血干細(xì)胞的增殖[9]。為進(jìn)一步探討補(bǔ)腎生血解毒方治療AA的作用靶點(diǎn)，我們對(duì)該方促進(jìn)外周血白細(xì)胞生成的機(jī)制進(jìn)行了深入研究。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：補(bǔ)腎生血解毒方可以明顯升高AA小鼠外周血中WBC的數(shù)量；ELISA檢測(cè)顯示，該方可以明顯增加AA小鼠外周血中GM-CSF的含量，對(duì)GM-CSFR基因的表達(dá)亦有顯著的刺激作用。由此我們認(rèn)為，補(bǔ)腎生血解毒方可以通過(guò)GM-CSF/GM-CSFR信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)造血細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn)外周血中白細(xì)胞的生成，恢復(fù)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)的穩(wěn)態(tài)，來(lái)達(dá)到治療的目的。這可能是補(bǔ)腎生血解毒方治療再生障礙性貧血的關(guān)鍵作用機(jī)制之一。

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R556.505

A

1672-397X（2014）01-0077-03

董玢（1963-），女，大專(zhuān)學(xué)歷，主管技師，主要從事免疫學(xué)基礎(chǔ)與臨床檢測(cè)。

柴立民，liminchai@hotmail.com

2013-07-20

編輯：吳寧

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81373583）