江宇航， 周寰宇， 辛維崗， 徐美余，何 秀， 張棋麟， 林連兵*

（1.昆明理工大學 生命科學與技術學院， 云南 昆明 650500；2.云南省高校飼用抗生素替代技術工程研究中心，云南 昆明 650500）

金黃色葡萄球菌（Staphylococc aureus）屬于革蘭氏陽性球菌，是葡萄球菌屬中的典型食源性致病菌代表，約有20%～30%的人群攜帶此種病原菌[1-2]。金黃色葡萄球菌污染食物后可通過食物處理者或食物表面感染人體或動物進而傳播到整個食物鏈中，誘發(fā)皮炎、肺炎、骨髓炎和敗血癥等疾病發(fā)生，嚴重者可導致肌肉痙攣甚至休克[2]。 同時，金黃色葡萄球菌能夠耐高溫、耐高滲，對磺胺類藥物具有很強的耐藥性，這使得很難對金黃色葡萄球菌進行防控[3-4]。 金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的主要毒素為腸毒素，其對大多數(shù)處理方法例如高溫和低pH 等具有相對較高的耐受性，進一步增加了食物中毒風險[1，5]。 此外，據(jù)歐洲食品安全局（EFSA）統(tǒng)計，歐洲2017 年由金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病事件有27 起，造成了352 人患病。 我國2011—2016 年食源性疾病監(jiān)測數(shù)據(jù)分析表明，金黃色葡萄球菌引起的食源性疾病暴發(fā)總次數(shù)為314 次，疾病總數(shù)為5 196 例，占細菌性食物中毒事件的20%以上，僅次于副溶血性 弧 菌 （Vibrio parahaemolyticus） 和 沙 門 氏 菌（Salmonella）[6]。因此，找到有效方法減緩金黃色葡萄球菌污染造成的食品安全問題是十分重要的。

生物被膜是指細菌為了適應生存環(huán)境黏附于有生命或無生命戊糖的表面，產(chǎn)生多糖基質(zhì)等胞外聚合物將其自身包圍形成的大量細菌聚集膜樣結構化群落，具有耐熱和耐干燥等特性[7-8]。 細菌生物被膜形成的高密度結構使其在酸性和抗生素作用條件下也能很好生存，這嚴重阻礙了抗菌劑對細菌的抑制和殺傷[8-9]。 當食品微生物形成生物被膜時，由于難以清洗和徹底去除，會出現(xiàn)餐廚設備表面破壞、傳熱效率低、能耗高等問題，這造成了極大的浪費[9-10]。 因此，如何有效清除生物被膜是食品工業(yè)面臨的嚴峻考驗[11]。目前解決食源性致病菌形成生物被膜的相關研究主要集中在其形成能力和對環(huán)境耐受抗性等方面， 關于借助微生物代謝產(chǎn)物抑制金黃色葡萄球菌等食源性致病菌形成的生物被膜研究較少。

布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）是乳酸菌屬中的一種， 在食品發(fā)酵時具有增加有氧穩(wěn)定性、提升發(fā)酵香味及抑制其他病原菌生長的效果[12-13]。同時，乳酸菌屬的部分細菌在生長過程中能夠代謝生成抑菌活性物質(zhì)，可有效抑制或殺滅多種致病性細菌，具有高效、無耐藥性、無毒、無殘留等優(yōu)點[14]。目前對乳酸桿菌細菌素作用于以金黃色葡萄球菌為代表的食源性致病菌及其對生物被膜形成的影響研究較少，這嚴重限制了乳酸桿菌細菌素在食品領域的應用范圍[14-15]。 因此，作者在觀測布氏乳桿菌生長及其抑制金黃色葡萄球菌活性的基礎上，利用?KTA 純化系統(tǒng)串聯(lián)Superdex 30 Increase 及MALDI-TOFMS，得到純化后的布氏乳桿菌細菌素。進一步考察酶敏感性，對熱、酸堿穩(wěn)定性以及最小抑菌質(zhì)量濃度等特性，并借助熒光倒置顯微鏡進一步評估了布氏乳桿菌細菌素對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響，旨在為金黃色葡萄球菌及其生物被膜的清除提供一種高效的抑菌活性物。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

布氏乳桿菌分離自發(fā)酵豆粕，金黃色葡萄球菌分離自肉類加工制品，均由昆明理工大學生命科學與技術學院噬菌體與腸道微生物研究室保存。

1.2 主要試劑

MRS 培養(yǎng)基、LB 培養(yǎng)基：北京陸橋技術有限責任公司；磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4）：國藥（上海）化學試劑有限公司；0.22 μm 濾膜：上海生工生物工程股份有限公司；胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶、過氧化氫酶：美國Sigma 公司；BCA 試劑盒、ABP 試劑盒：上海貝博生物科技有限公司。

1.3 儀器與設備

Power Wave XS 微孔板掃描分光光度計： 美國BIO-TEK 有限公司；UV-900 AKTA 蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)：瑞典GE 公司；CHA-S 恒溫振蕩器：國華電器有限公司；CF16RXII 低溫離心機、ES-2030 型冷凍干燥儀：日立（Hitachi）有限公司；PHSJ-3FpH 計：上海儀電科學儀器股份有限公司； 熒光倒置顯微鏡：上海萬衡精密儀器有限公司。

1.4 布氏乳桿菌的生長與抑制金黃色葡萄球菌活性曲線

將活化后的布氏乳桿菌以體積分數(shù)3%接種于500 mL 的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)，每2 h（0～36 h）取發(fā)酵液5 mL，以MRS 培養(yǎng)基作空白對照，測定OD600和pH 值。 同時，取發(fā)酵液2 mL 于8 000 r/min 離心10 min， 收集上清液， 經(jīng)0.22 μm濾膜過濾去除菌體細胞[16]。最后，以金黃色葡萄球菌為指示菌（107CFU/mL），采用牛津杯雙層平板法檢測不同時間點的布氏乳桿菌細菌素 （以下簡稱BSX01）抑菌活性，每組設3 個重復。

1.5 細菌素的提取與純化

將布氏乳桿菌以體積分數(shù)3%接種于500 mL的MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h， 于4 ℃、8 000 r/min 離心10 min， 收集上清液。 用0.22 μm濾膜過濾去除菌體，將具有活性的無細胞上清液通過AKTA pure 純化系統(tǒng)，使用Superdex 30 Increase層析柱，平衡2 個柱體積，在pH 6.2 條件下洗脫，洗脫體積為1.5 倍柱體積，280 nm 處檢測細菌素含量，流量為0.3 mL/min，每0.5 mL 為一管進行收集，通過牛津杯雙層平板法測定其抑菌活性。 將多次初步純化得到的具有抑菌活性的收集液混合后，通過Superdex 30 Increase 進行二次純化， 檢測其抑菌活性[6，16]。 最后，將經(jīng)過2 次純化得到的具有抑菌活性的收集液進行冷凍干燥，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

BSX01 的相對分子質(zhì)量大小及蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定分別采用MALDI-TOF MS 和BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒進行。 細菌素相對分子質(zhì)量大小測定：方法及流程參照文獻[16]，具體交由北京百派克生物科技有限公司進行； 蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度的測定：稱取1.0 mg 干粉溶于1 mL ddH2O 中，按照BCA 蛋白質(zhì)檢測試劑盒[6，17]說明繪制標準溶液曲線（y=1.062X+0.016 3，R2=0.992 3），計算每毫升溶液中的蛋白質(zhì)質(zhì)量，每個試樣設置3 組重復。

1.6 細菌素的酶敏感性

將上述純化樣品pH 調(diào)至7.0，加入過氧化氫酶和不同蛋白酶溶液（胃蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K）使其終質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL，37 ℃水浴2 h， 然后于80 ℃水浴10 min 使蛋白酶活性喪失[18]。 以金黃色葡萄球菌為指示菌，利用牛津杯雙層平板法檢測不同酶溶液處理后的細菌素抑菌活性變化，記錄抑菌圈直徑。 以未加酶溶液處理的BSX01 作為對照，每個試樣設置3 組重復。

1.7 細菌素的熱及酸堿穩(wěn)定性測定

取上述純化樣品，分別按以下處理進行細菌的熱及酸堿穩(wěn)定性測定。 37、60、80、100、121 ℃處理30 min 后， 自然冷卻至室溫； 以1 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 至2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0，分別置于37 ℃保溫2 h，調(diào)至pH 6.5[18-19]。 采用牛津杯雙層平板法檢測經(jīng)不同處理后的細菌素溶液對金黃色葡萄球菌的抑制能力，以未經(jīng)處理的BSX01為對照，每個樣品設置3 組重復。

1.8 MIC 測定

BSX01 對金黃色葡萄球菌的MIC 值參照文獻[6,20]的方法測定。 將BSX01（1.0 mg/mL）在無菌PBS（pH 7.2）中連續(xù)稀釋，并將10 μL 稀釋液與90 μL 含金黃色葡萄球菌（107CFU/mL）的LB 培養(yǎng)基混合[21]。 37 ℃孵育24 h，在600 nm 處測定吸光度，每組重復3 次。 MIC 定義為：BSX01 在37 ℃培養(yǎng)24 h 后未觀察到指示菌菌株生長的最低質(zhì)量濃度[22]。 每個樣品設置3 組重復。

1.9 細菌素對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響

為觀察細菌素對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響， 首先用終質(zhì)量濃度分別為0、1/2 MIC、1 MIC、2 MIC 的BSX01 與100 μL 金黃色葡萄球菌（107CFU/mL）添加到24 孔微量滴定板中，在37 ℃下恒溫孵育30 h 后形成生物被膜。棄上清液以去除未附著的金黃色葡萄球菌，用PBS 緩沖液（pH 7.4）洗滌微量滴定板上的多余殘留，得到金黃色葡萄球菌生物被膜。將金黃色葡萄球菌生物膜按照ABP 試劑盒熒光成像檢測的操作說明進行，加入1.0 μL 的Nuc View Green 染料后在室溫下對生物被膜染色15 min，棄染色液，用PBS 緩沖液（pH 7.4）洗滌2 次以上，去除游離的染色液，置于熒光顯微鏡下觀察金黃色葡萄球菌生物被膜形成情況[7，23]。 最后，加入100 μL PBS 緩沖液（pH 7.4）與各處理的金黃色葡萄球菌生物被膜混合后，測OD595，每個樣品設置3組重復。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有測得的數(shù)據(jù)均包含3 次生物學重復，以平均值±標準差（SD）表示。 利用Microsoft Excel 2010和IBM SPSS 22.0 統(tǒng)計軟件分別對數(shù)據(jù)進行整理分析。 數(shù)據(jù)對間顯著性檢驗利用t 檢驗 （Student’s t Test）進行；采用One-Way ANOVA 進行單因素方差分析和最小顯著差異法 （Least -Significant Difference，LSD）測驗差異顯著性[19]，顯著性水平閾值P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 布氏乳桿菌生長與BSX01 抑制金黃色葡萄球菌活性曲線

將布氏乳桿菌于37 ℃培養(yǎng)36 h， 分階段測定其在600 nm 下的吸光值度、pH 值及對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，結果見圖1。 布氏乳桿菌培養(yǎng)2 h后進入對數(shù)生長期，在20 h 達到峰值，然后菌體數(shù)量逐漸平穩(wěn)，達到穩(wěn)定期；對金黃色葡萄球菌的抑菌效果從4 h 就開始出現(xiàn)， 到26 h 時達到峰值，抑菌圈直徑穩(wěn)定在（26.36±0.86） mm；pH 隨著時間的推移逐漸下降，在28 h 達到3.5±0.3，并持續(xù)保持平穩(wěn)。 表明布氏乳桿菌在生長初期就開始產(chǎn)生酸類物質(zhì)，隨著pH 值的下降菌體量逐漸上升，說明有機酸是布氏乳桿菌在生長過程中產(chǎn)生的一種必要代謝產(chǎn)物。 此外，BSX01 對金黃色葡萄球菌的抑菌作用隨著菌體量的增加逐漸增加，特別是在布氏乳桿菌進入穩(wěn)定期前后， 其抑菌圈直徑大幅增大， 說明BSX01 可能是布氏乳桿菌在生長后期產(chǎn)生的一種重要次級代謝產(chǎn)物。

圖1 布氏乳桿菌的生長與BSX01 拮抗活性曲線Fig.1 Curves of Lactobacillus buchneri growth and BSX01 antagonistic activity

2.2 BSX01 的提取及純化

將具有抑菌活性的布氏乳桿菌上清液經(jīng)Superdex 30 Increase 分離純化后，得到A1～A7 多個洗脫峰，見圖2。 經(jīng)過牛津杯雙層法檢測后，A3、A4洗脫峰對應的收集液具有明顯的抑菌活性，再將其進一步純化上樣后得洗脫峰B1、B2，檢測后發(fā)現(xiàn)B2洗脫峰的抑菌圈直徑明顯優(yōu)于B1 洗脫峰， 因此收集B2 洗脫峰對應的洗脫液進行后續(xù)實驗。將B2 洗脫液經(jīng)冷凍干燥處理，通過MALDI-TOF MS 分析發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌代謝產(chǎn)生的主要抑菌活性物質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小為773.56，這與馬國涵等[24]和Li等[6]在大菱鲆和肉雞腸道中發(fā)現(xiàn)的乳桿菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)的相對分子質(zhì)量大小相似， 推測同為I類細菌素。 因此，布氏乳桿菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)可能是一類具有高抑菌活性的小分子多肽或小分子蛋白質(zhì)。

圖2 BSX01 的純化與質(zhì)譜圖Fig.2 Purification and mass spectrum of BSX01

2.3 BSX01 的酶敏感性

為進一步確定布氏乳桿菌產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)是一種蛋白質(zhì)類細菌素，作者首先用過氧化氫酶對BSX01 進行處理，發(fā)現(xiàn)其抑菌圈直徑與對照相比未發(fā)生顯著下降（P ＞0.05），初步說明過氧化氫不是主要的抑菌活性物質(zhì)。利用蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶分別對BSX01 進行處理， 結果發(fā)現(xiàn)BSX01經(jīng)蛋白酶K、胰蛋白酶和胃蛋白酶處理后，抑菌圈直徑與對照相比發(fā)生了顯著下降（P ＜0.05），尤其是經(jīng)蛋白酶K 處理后， 抑菌圈直徑下降最為明顯，僅為（9.83±0.32） mm，見圖3。 結果說明布氏乳桿菌產(chǎn)生的BSX01 對蛋白酶敏感，存在著類蛋白質(zhì)性質(zhì)[18，25]，進一步證實了布氏乳桿菌細菌素BSX01 為Ⅰ類細菌素。

圖3 BSX01 的酶敏感性Fig.3 Enzyme sensitivity of BSX01

2.4 BSX01 的熱及酸堿穩(wěn)定性

細菌素抑菌活性的高低僅代表該細菌素有較好的抑菌效果，然而實際應用中細菌素的穩(wěn)定性也是影響工業(yè)化生產(chǎn)的重要因素。對BSX01 進行酸堿耐受與熱穩(wěn)定性測試，結果發(fā)現(xiàn)在過酸（pH 2.0）和過堿（pH 10.0）處理后，BSX01 仍保持一定的抑菌活性。隨著pH 值的上升，對金黃色葡萄球菌的抑菌活性逐漸下降， 在pH 10.0 時抑菌圈直徑最低，為（19.07±0.64） mm。 但在pH 10 時，BSX01 仍保持77.5%的抑菌活性，較同類研究[16，18]中經(jīng)過相同處理后的抑菌活性更高，這說明BSX01 在耐堿方面具有良好的耐受能力。 同時，BSX01 在37～121 ℃處理30 min 后， 隨著溫度的升高抑菌圈活性逐漸下降，且在高溫區(qū)段（80、100、121 ℃）中抑菌活性損失較大，在80 ℃時僅保留76.0%的抑菌活性。 但121 ℃加熱30 min 后， 抑菌活性也僅損失了不到40%，說明雖然BSX01 在高溫處理后抑菌活性會有所損失，但仍然能夠保留較高的抑菌活性，顯示出較寬的溫度應用范圍[19]，見圖4。

圖4 BSX01 的熱穩(wěn)定性與酸堿耐受性Fig.4 Thermal stability and acid-base tolerance of BSX01

圖5 不同MIC 的BSX01 抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成Fig.5 Inhibition effect of BSX01 with different MIC on the formation of Staphylococcus aureus biofilm

2.5 BSX01 的MIC 及對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的抑制作用

最小抑菌濃度對于細菌素實際應用具有重要的意義。通過將不同質(zhì)量濃度純化后的BSX01 作用于金黃色葡萄球菌，確定得到最小抑菌質(zhì)量濃度僅為12.50 μg/mL， 這與目前部分研究中抑制金黃色葡萄球菌的最小抑菌質(zhì)量濃度一致[6，21]。 分別用0、1/2MIC、1MIC、2MIC 的BSX01 處理金黃色葡萄球菌， 在37 ℃培養(yǎng)30 h 后通過熒光倒置顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)隨著細菌素質(zhì)量濃度的增加，生物被膜形成的密度逐漸下降，在1/2MIC 的BSX01 處理后，其生物被膜形成的密度較對照發(fā)生了較大幅度下降；當以1MIC 的布氏乳桿菌細菌素處理后，生物被膜形成的密度較對照相比僅有稀疏的金黃色葡萄球菌菌體出現(xiàn)；以2MIC 的BSX01 處理后，幾乎無肉眼可見的生物被膜形成，這說明BSX01 質(zhì)量濃度的提高能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，且僅需要較低質(zhì)量濃度的BSX01。此外，600 nm下的吸光度分別為1.23±0.14、0.66±0.18、0.38±0.29和0.23±0.06， 進一步證明了獲得的BSX01 以低濃度就能夠有效抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成[23]。

3 結 語

本研究證實了前期篩選得到的布氏乳桿菌在生長過程中產(chǎn)生了一種細菌素類代謝產(chǎn)物，其能夠?qū)瘘S色葡萄球菌起到明顯抑制作用。 該細菌素（BSX01）的相對分子質(zhì)量為773.56，對蛋白酶敏感，具有類蛋白質(zhì)性質(zhì)，推測為I 類細菌素，并對溫度和pH 表現(xiàn)出較高的耐受性， 最低抑菌質(zhì)量濃度僅為12.50 μg/mL。 同時，該細菌素在不同MIC 的抑菌質(zhì)量濃度下均能明顯抑制金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，在減緩金黃色葡萄球菌生物被膜形成方面效果顯著。 研究結果證實，布氏乳桿菌產(chǎn)生的細菌素類抑菌物質(zhì)具有良好抑菌特性，具有高效的抑制金黃色葡萄球菌生物被膜形成能力，為將該細菌素應用于食品工業(yè)中防治以金黃色葡萄球菌為代表的食源性致病菌及其生物被膜引發(fā)的相關問題提供理論基礎。