范曉靜，魏雅嵐，葉洲杰，朱麗萍，王心睿,3

0 引言

驅(qū)動(dòng)蛋白14家族成員C1（Kinesin family member C1, KIFC1, NP_002254）是一種從微管正極端向負(fù)極端運(yùn)動(dòng)的驅(qū)動(dòng)蛋白，KIFC1可以促進(jìn)微管間的交聯(lián)、滑動(dòng)和捆綁，在有絲分裂過(guò)程中參與紡錘體極體的聚集和組裝，并在含有多個(gè)中心體的癌細(xì)胞中參與中心體的聚集。關(guān)于KIFC1的重要性尚存在爭(zhēng)議，但在癌細(xì)胞中，KIFC1的過(guò)量表達(dá)是維持多個(gè)中心體腫瘤細(xì)胞正常分裂所必需的[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)KIFC1在乳腺癌[3]、卵巢癌[4]、肝癌[5-6]、胃癌[7]、前列腺癌[8]、胰腺癌[9]等惡性腫瘤中特異性過(guò)表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[4]。KIFC1通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路調(diào)控子宮內(nèi)膜癌進(jìn)程，其表達(dá)量與子宮內(nèi)膜癌的臨床分期、病理類型及預(yù)后顯著相關(guān)[10]。此外，KIFC1已被確定為三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良的生物標(biāo)志物之一[11]。KIFC1也可誘導(dǎo)多西他賽耐藥，并與前列腺癌患者的不良預(yù)后有關(guān)[12]。敲低KIFC1可以抑制肝癌細(xì)胞增殖和侵襲，增加其對(duì)紫杉醇的敏感度[13]。因此，KIFC1作為腫瘤選擇性治療的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步探討。然而，關(guān)于KIFC1在宮頸癌發(fā)病機(jī)制中的作用研究較少，具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是目前最主流的基因編輯系統(tǒng)，具有效率高、成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛運(yùn)用于基因敲除、基因敲入和多重基因編輯。本研究運(yùn)用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在人宮頸癌HeLa細(xì)胞中構(gòu)建KIFC1基因敲除細(xì)胞系，探討KIFC1表達(dá)缺失對(duì)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、周期與凋亡的影響，為進(jìn)一步研究KIFC1蛋白在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供細(xì)胞模型。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa（來(lái)源于ATCC細(xì)胞庫(kù)CCL-2編號(hào)的細(xì)胞系）、CRISPR/Cas9系統(tǒng)質(zhì)粒pSpCas9（BB）-2A-GFP（簡(jiǎn)稱PX458）源于本實(shí)驗(yàn)室保存，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，兔抗人KIFC1和鼠抗beta-actin單克隆抗體均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，TurboFect轉(zhuǎn)染試劑（R0531）、T4 DNA連接酶（EL0016）和BbsⅠ酶（ER1011）均購(gòu)自美國(guó)Thermo Scientific公司，感受態(tài)細(xì)胞DH5α（C502-03）、染料法qPCR預(yù)混液（Q711-02）、TA克隆試劑盒（C601-01）和Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒（A211-02）均購(gòu)自南京諾唯贊公司，ExTaq酶（RR001Q）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR047A）均購(gòu)自日本TaKaRa公司，PMSF（A610425）、RIPA緩沖液（C500005）、EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒（E607204）和吖啶橙染色試劑盒（E607307）均購(gòu)自上海生工公司，細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè)試劑盒（C1052）購(gòu)自上海碧云天公司，細(xì)胞基因組DNA提取試劑盒（DP304）、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒（DP118）、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒（DP219）、細(xì)胞總RNA提取試劑盒（DP451）均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，引物合成和DNA測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靶向人KIFC1基因sgRNA的設(shè)計(jì)及表達(dá)載體的構(gòu)建

在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心官網(wǎng)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索Homo sapiensKIFC1基因序列（NM_002263.4），將序列輸入到在線sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http://chopchop.cbu.uib.no/），根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果設(shè)計(jì)兩對(duì)sgRNA序列（見(jiàn)表1）和測(cè)序引物hKIFC1 target（見(jiàn)表2）。sgRNA與BbsⅠ酶切后的PX458質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌，篩選陽(yáng)性克隆，提取質(zhì)粒鑒定。

表1 sgRNA寡核苷酸序列Table 1 sgRNA oligonucleotide sequences

表2 測(cè)序及qPCR相關(guān)引物Table 2 Primers for sequencing and qPCR

1.2.2 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

HeLa細(xì)胞在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書分組轉(zhuǎn)染，其中實(shí)驗(yàn)組為PX458-sgRNA1+PX458-sgRNA2，陰性對(duì)照組為PX458質(zhì)粒，空白對(duì)照組為脂質(zhì)體試劑。轉(zhuǎn)染48和72 h后，使用倒置熒光顯微鏡（Nikon, Ts2R-FL）觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況以確定轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3KIFC1敲除單克隆HeLa細(xì)胞株的篩選及鑒定

轉(zhuǎn)染72 h后的HeLa細(xì)胞經(jīng)胰酶消化吹打成單細(xì)胞懸液，流式細(xì)胞術(shù)分選收集綠色熒光蛋白表達(dá)陽(yáng)性的細(xì)胞懸液。采用有限稀釋法將單個(gè)細(xì)胞接種至96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待單孔細(xì)胞增殖至50%融合度時(shí)，傳代并擴(kuò)大培養(yǎng)獲得單克隆細(xì)胞株。

提取細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為：PCR程序?yàn)椋?5℃ 3 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，33個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min，4℃保溫。膠回收PCR產(chǎn)物并進(jìn)行TA克隆，挑選單克隆菌落進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證及測(cè)序分析。最終以KIFC1敲除細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)組，野生型HeLa細(xì)胞為對(duì)照組進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)操作。

1.2.4 Western blot檢測(cè)KIFC1蛋白表達(dá)情況

使用含1%PMSF的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。制備好的蛋白樣品進(jìn)行SDSPAGE，電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，HRP標(biāo)記二抗孵育1 h，TBST洗滌3次，在膜上滴加顯影液，放入顯影系統(tǒng)（Bio-Rad，ChemiDoc MP）中成像。

1.2.5 RT-qPCR檢測(cè)KIFC1基因轉(zhuǎn)錄水平

提取細(xì)胞RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以cDNA為模板，采用SYBR Green染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。qPCR反應(yīng)體系為：2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 μl，ddH2O上下游引物各1 μl，模板cDNA 1 μl，補(bǔ)ddH2O至20 μl。qPCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃ 30 s, 95℃ 10 s, 60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；融解曲線95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s。

1.2.6 免疫熒光法檢測(cè)敲除KIFC1對(duì)細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

將細(xì)胞接種于含12 mm爬片的24孔板中，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗1次后，4%多聚甲醛固定20 min，PBS浸洗3次。0.25%Triton X-100/PBS透化10 min，PBS浸洗3次，用含3%BSA/PBST的封閉液室溫孵育1 h，加入一抗4℃孵育過(guò)夜，二抗室溫避光孵育1 h，兩步分別用PBS浸洗3次去除多余抗體，DAPI與抗熒光淬滅劑等體積混勻封片，激光掃描共聚焦顯微鏡（Leica SP8）成像。

1.2.7 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制及EdU染色

細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制：各組細(xì)胞用胰酶消化成單細(xì)胞懸液并進(jìn)行計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×104/ml，接種至24孔板中正常培養(yǎng)。24 h后開(kāi)始計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)8 d，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

EdU染色：細(xì)胞爬片過(guò)夜培養(yǎng)后，按EdU染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，共聚焦顯微鏡（Leica SP8）獲取圖像，檢測(cè)細(xì)胞增殖。

1.2.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期

收集各組細(xì)胞，使用預(yù)冷的PBS洗滌和重懸，緩慢加入預(yù)冷的75%乙醇，4℃固定過(guò)夜。次日，PBS洗滌，加入碘化丙啶（PI）37℃避光染色30 min，上流式細(xì)胞儀（BD LSRFortessa）檢測(cè)，記錄激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處的紅色熒光。

1.2.9 流式細(xì)胞術(shù)及吖啶橙染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)：細(xì)胞接種至6孔板中培養(yǎng)48 h后，胰酶消化收集細(xì)胞，按Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書操作，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀（BD LSRFortessa）檢測(cè)。

吖啶橙（AO）染色法：細(xì)胞消化后，PBS洗滌兩次，按吖啶橙染色試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行染色，熒光顯微鏡觀察成像。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用GraphPad Prism 7.0和Microsoft Excels軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 KIFC1在HeLa細(xì)胞中的時(shí)空表達(dá)定位分析

為評(píng)估KIFC1在HeLa細(xì)胞分裂中的功能，我們對(duì)KIFC1在細(xì)胞間期與分裂期的表達(dá)情況及亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，利用免疫熒光技術(shù)對(duì)HeLa細(xì)胞的細(xì)胞核、微管及KIFC1蛋白進(jìn)行熒光標(biāo)記，測(cè)量熒光強(qiáng)度和相對(duì)細(xì)胞位置，見(jiàn)圖1A。結(jié)果顯示，在細(xì)胞間期，KIFC1分散定位在細(xì)胞質(zhì)中或大量轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞核，見(jiàn)圖1B。分裂期，尤其是在有絲分裂后期，KIFC1大量定位在中央紡錘體與星極紡錘體區(qū)，參與牽拉染色體的分離，見(jiàn)圖1C。

圖1 KIFC1在HeLa細(xì)胞間期與分裂期的表達(dá)定位Figure 1 Location of KIFC1 in HeLa cells during interphase and mitosis

2.2 構(gòu)建sgRNA-Cas9重組載體

利用BbsⅠ酶對(duì)PX458質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理，將合成的sgRNA序列與線性化PX458質(zhì)粒連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化、涂板、測(cè)序驗(yàn)證，構(gòu)建sgRNA-Cas9重組載體，見(jiàn)圖2。該載體含有人U6啟動(dòng)子，帶有Cas9和EGFP標(biāo)簽，并具有氨芐青霉素抗性。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，酶切成功的質(zhì)粒在相應(yīng)位置出現(xiàn)明顯條帶，見(jiàn)圖3A。

圖2 sgRNA-Cas9重組載體構(gòu)建模式圖Figure 2 Schematic diagram of sgRNA-Cas9 recombinant vector construction

圖3 轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后EGFP陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)F i g u r e 3 E G F P p o s i t i v e c e l l morphology after plasmid transfection

2.3 sgRNA-Cas9重組載體成功轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞

將PX458-sgRNA1和PX458-sgRNA2質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞中，使用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果，轉(zhuǎn)染48 h后可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞成功表達(dá)EGFP信號(hào)，72 h后大量EGFP陽(yáng)性細(xì)胞表現(xiàn)出巨核或多細(xì)胞核的表型，見(jiàn)圖3B。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)分選EGFP陽(yáng)性細(xì)胞

通過(guò)熒光流式細(xì)胞分選技術(shù)，收集EGFP強(qiáng)信號(hào)的細(xì)胞群，檢測(cè)其轉(zhuǎn)染效率為28.6%，見(jiàn)圖4A，收集該部分細(xì)胞群。經(jīng)過(guò)熒光顯微鏡鏡檢，可以觀察到所有分選后的細(xì)胞都攜帶綠色熒光，見(jiàn)圖4B。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)分選EGFP陽(yáng)性HeLa細(xì)胞群Figure 4 Flow cytometry sorting of EGFP-positive HeLa cells

2.5 成功構(gòu)建KIFC1敲除單克隆HeLa細(xì)胞株

靶序列測(cè)序分析顯示，KIFC1敲除細(xì)胞在386 bp和563 bp位點(diǎn)各缺失1個(gè)鳥(niǎo)嘌呤（G），在564 bp位點(diǎn)缺失1個(gè)胸腺嘧啶（T），見(jiàn)圖5A，這些堿基缺失可以造成KIFC1蛋白截?cái)喾g。與對(duì)照HeLa細(xì)胞相比，敲除細(xì)胞株中KIFC1蛋白表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，見(jiàn)圖5B～D，與預(yù)期結(jié)果一致，證明HeLa細(xì)胞KIFC1基因敲除成功。

圖5 敲除細(xì)胞KIFC1轉(zhuǎn)錄與蛋白表達(dá)水平驗(yàn)證Figure 5 Verification of KIFC1 transcription and protein expression levels in knock-out cells

2.6 KIFC1基因缺失影響HeLa細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)維持

在KIFC1敲除株中，大量細(xì)胞核表現(xiàn)出多核、微核、染色質(zhì)異常包裝和微管骨架裝配錯(cuò)誤，見(jiàn)圖6。細(xì)胞骨架異常延伸并過(guò)度組裝，但細(xì)胞的貼壁能力明顯變?nèi)?，?xì)胞的增殖能力降低，部分細(xì)胞在生長(zhǎng)過(guò)程中表現(xiàn)出明顯的凋亡或死亡，見(jiàn)圖7A。

圖6 KIFC1敲除細(xì)胞微管骨架形態(tài)分析Figure 6 Morphological analysis of microtubule cytoskeleton in KIFC1 knockout cells

圖7 KIFC1缺失對(duì)HeLa細(xì)胞形態(tài)、增殖及周期的影響Figure 7 Effects of KIFC1 deletion on morphology,proliferation and cell cycle of HeLa cells

2.7 敲除KIFC1抑制HeLa細(xì)胞增殖并影響細(xì)胞周期調(diào)控

EdU染色結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，KIFC1敲除組中EdU標(biāo)記的細(xì)胞明顯減少，且DNA復(fù)制強(qiáng)陽(yáng)性信號(hào)的細(xì)胞數(shù)量較少, 見(jiàn)圖7A。通過(guò)分析細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，KIFC1敲除組細(xì)胞生長(zhǎng)速率顯著低于對(duì)照組，見(jiàn)圖7B。以上結(jié)果均表明KIFC1敲除可使HeLa細(xì)胞增殖能力下降。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布結(jié)果顯示，細(xì)胞周期調(diào)控發(fā)生顯著的變化。其中，KIFC1敲除組G0/G1期和G2/M期細(xì)胞比例均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而S期細(xì)胞比例則明顯低于對(duì)照組，提示細(xì)胞DNA合成受到抑制，見(jiàn)圖7C～G，進(jìn)一步印證了KIFC1敲除導(dǎo)致HeLa細(xì)胞的增殖水平降低。

2.8 敲除KIFC1可促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡

KIFC1敲除組細(xì)胞經(jīng)吖啶橙染色后，通過(guò)熒光顯微鏡可觀察到不同程度的細(xì)胞凋亡情況，凋亡細(xì)胞核呈致密濃染的黃綠色，而對(duì)照組細(xì)胞的細(xì)胞核表現(xiàn)為均勻的綠色熒光，見(jiàn)圖8A。

圖8 KIFC1缺失對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響Figure 8 Effects of KIFC1 deletion on HeLa cell apoptosis

通過(guò)Annexin/FITC共標(biāo)的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敲除KIFC1后正常細(xì)胞比例減少（P<0.01; HeLa, 95.60±0.29%;KIFC1-/-Clone,93.23±0.12%），見(jiàn)圖8B～D，早期凋亡細(xì)胞比例有所增加，見(jiàn)圖8E，晚期凋亡細(xì)胞比例顯著增加（P<0.05；HeLa，1.05±0.23%；KIFC1-/-Clone，2.67±0.28%），見(jiàn)圖8F。綜上結(jié)果表明，敲除KIFC1可促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡。

3 討論

驅(qū)動(dòng)蛋白是一類沿著微管運(yùn)輸分子的馬達(dá)蛋白，在細(xì)胞器運(yùn)輸、細(xì)胞分裂、組織器官發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。驅(qū)動(dòng)蛋白的異常表達(dá)影響染色體的正確分布，引起有絲分裂過(guò)程中遺傳物質(zhì)變化和異常紡錘體形成，促進(jìn)癌癥的發(fā)生發(fā)展。近年來(lái)，驅(qū)動(dòng)蛋白已經(jīng)成為癌癥藥物開(kāi)發(fā)的潛在靶點(diǎn)[15-18]。其中KIFC1是多種癌癥診斷、治療和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物。KIFC1蛋白通過(guò)聚集中心體在癌細(xì)胞有絲分裂中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]。研究表明，KIFC1蛋白可直接結(jié)合CEP215，促進(jìn)中心體與紡錘體極的連接，從而提高中心體聚集[20]。KIFC1還可能參與染色體排列、細(xì)胞周期中細(xì)胞器的運(yùn)輸，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期G2-M期的進(jìn)程。KIFC1的過(guò)表達(dá)驅(qū)動(dòng)了控制有絲分裂檢查點(diǎn)基因的過(guò)量表達(dá)，從而產(chǎn)生非整倍體，加速癌癥發(fā)展的進(jìn)程[21]。KIFC1蛋白參與多條腫瘤形成相關(guān)的信號(hào)通路。在子宮內(nèi)膜癌中，KIFC1通過(guò)結(jié)合HMGA1促進(jìn)c-myc的表達(dá)，從而加快c-myc介導(dǎo)的下游糖酵解基因的表達(dá)[22]。在肝癌中，KIFC1通過(guò)激活gankyrin/AKT/TWIST1通路，促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和癌癥轉(zhuǎn)移[23]。KIFC1還可以通過(guò)Akt/GSK3β信號(hào)通路加速膀胱癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[24]。在多種類型癌組織中，KIFC1的表達(dá)隨著腫瘤發(fā)展級(jí)別的增加而增加，且KIFC1高表達(dá)易引起耐藥性，與癌癥患者的不良預(yù)后相關(guān)[25-28]。近期研究表明，DNA修復(fù)途徑的ATM和ATR激酶誘導(dǎo)KIFC1-Ser26磷酸化，促進(jìn)中心體聚集，導(dǎo)致耐藥性和腫瘤復(fù)發(fā)[29]。這些研究揭示了KIFC1可能多方面參與癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。

目前KIFC1蛋白相關(guān)的研究通常使用基于RNAi機(jī)制的敲低細(xì)胞模型，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)在宮頸癌HeLa細(xì)胞中成功構(gòu)建KIFC1敲除模型，可以更好地闡述KIFC1在宮頸癌中的作用機(jī)制。免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在細(xì)胞間期，KIFC1大量定位在細(xì)胞核中，這與KIFC1尾部結(jié)構(gòu)域的核定位序列（NLS）有關(guān)，KIFC1可與入核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白復(fù)合體中的Importin β結(jié)合，入核參與細(xì)胞周期的調(diào)控，并且其與核孔復(fù)合物NUP62相互作用可能介導(dǎo)核孔的重組[30]。在有絲分裂中后期，KIFC1與紡錘體共定位，表明KIFC1主要作用于紡錘體。在細(xì)胞分裂過(guò)程中，KIFC1參與微管交聯(lián)、紡錘體兩級(jí)形成、紡錘體組裝和染色體分離等生命活動(dòng)過(guò)程。之前的研究發(fā)現(xiàn)，KIFC1敲低可延長(zhǎng)細(xì)胞的前中期，延緩細(xì)胞周期蛋白A的降解，進(jìn)而破壞染色體凝集和排列，導(dǎo)致染色體錯(cuò)位、核型異常及微核的形成[31]。本研究觀察到類似的結(jié)果，KIFC1基因的敲除可使細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯的改變，出現(xiàn)多核、微核等異常核結(jié)構(gòu)，誘發(fā)微管骨架紊亂，還可以阻滯細(xì)胞周期，抑制DNA合成并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制HeLa細(xì)胞的增殖。這一結(jié)果提示作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)，KIFC1具有廣闊的發(fā)展前景。

綜上所述，本研究以宮頸癌HeLa細(xì)胞系為研究模型，通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除KIFC1基因，成功抑制KIFC1蛋白的表達(dá)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KIFC1敲除可導(dǎo)致細(xì)胞骨架的異常裝配，誘導(dǎo)細(xì)胞阻滯在G0/G1期、G2/M期，誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡，從而減少細(xì)胞的增殖。未來(lái)，在KIFC1敲除細(xì)胞模型基礎(chǔ)上可以結(jié)合臨床實(shí)際問(wèn)題如腫瘤治療耐藥性，深入研究KIFC1在宮頸癌中的潛在功能機(jī)制，為宮頸癌篩查、診斷和治療提供新的思路。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。