張玲瓏，漆小龍，寇珍，熱那古力·阿不來提，聶玉玲，木合拜爾·阿布都爾，翟順生，安利，毛敏，李燕

0 引言

彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma, DLBCL）是最常見非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin's lymphoma, NHL），占所有NHL病例數(shù)的40%左右[1]。DLBCL是一種異質(zhì)性疾病，二代測(cè)序（next-generation sequencing, NGS）技術(shù)從突變的角度揭示了DLBCL的這種異質(zhì)性[2]。作為一種高度異質(zhì)性的淋巴系統(tǒng)惡性腫瘤，DLBCL具有基因表達(dá)譜和基因改變的差異，導(dǎo)致臨床病程和治療反應(yīng)的顯著差異[3]。當(dāng)前許多研究應(yīng)用高通量測(cè)序（NGS）檢測(cè)DLBCL的分子基因水平的異常，對(duì)DLBCL進(jìn)行精確診斷、分類及預(yù)后判斷以及指導(dǎo)精準(zhǔn)治療[4]。隨著全基因組測(cè)序技術(shù)的日臻成熟以及成本的不斷降低，對(duì)較多數(shù)量基因座位和較多數(shù)目品種等位基因序列變異同時(shí)檢測(cè)成為可能[5]。越來越多的研究證實(shí)遺傳因素在DLBCL預(yù)后中起重要作用，但大多數(shù)突變基因的變異等位基因頻率（variant allele frequency, VAF）與臨床相關(guān)性尚不清楚[6]。本研究旨在應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)DLBCL患者ITPKB突變的VAF值，分析其與臨床特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象資料收集

本研究納入了2014年6月—2020年12月新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院根據(jù)《中國(guó)彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤診斷與治療指南（2013年版）》[7]初次診斷的155例彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤患者，獲取患者完整的臨床資料及石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本。患者臨床特征資料主要包括年齡、性別、民族、LDH、COO分型、Ann Arbor臨床分期、IPI預(yù)后評(píng)分、ECOG體能狀態(tài)評(píng)分、大包塊、結(jié)外受累的數(shù)量、疾病進(jìn)展和生存等。數(shù)據(jù)分析中排除了入組前接受放、化療，合并有其他血液系統(tǒng)腫瘤及惡性消耗性疾病患者。本研究經(jīng)過新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意后開展，鑒于研究性質(zhì)屬于回顧性研究，故患者無需簽署知情同意書。

1.2 NGS檢測(cè)

全部患者的石蠟包埋腫瘤組織標(biāo)本中提取基因組DNA，由南京世和基因生物技術(shù)股份有限公司采用安捷倫SureSelect Human All Exon Kit（美國(guó)Santa Clara公司產(chǎn)品）的靶向捕獲方法進(jìn)行測(cè)序，基因PANEL包括ITPKB在內(nèi)的熱點(diǎn)基因。在Illumina HiSeq平臺(tái)對(duì)富集片段進(jìn)行大規(guī)模并行測(cè)序，20×靶區(qū)覆蓋率＞90%，使用SNV/small indel完成檢測(cè)、注釋及統(tǒng)計(jì)，突變型VAF定義為變異讀數(shù)除以總讀數(shù)，以百分比形式報(bào)告。已知的單核苷酸多態(tài)性（SNPs）、拷貝數(shù)變異（CNV）突變均被排除在外。

1.3 VAF截?cái)嘀?/h3>

VAF是在基因位點(diǎn)突變的等位基因?qū)?yīng)的讀數(shù)的覆蓋深度占這個(gè)位點(diǎn)總讀數(shù)覆蓋深度的比例。通過使用基于R語言的在線網(wǎng)頁工具Cut off Finder（http://molpath.charite.de/cutoff/）來確定每個(gè)基于OS和PFS分層的個(gè)體基因的VAF最優(yōu)突變截?cái)帱c(diǎn)：通過Log rank檢驗(yàn)比較每個(gè)截?cái)帱c(diǎn)（高VAFvs.低VAF+野生型）分離的兩組OS和PFS，并根據(jù)最低P值[8]選擇最優(yōu)VAF截?cái)帱c(diǎn)。

1.4 隨訪

通過查閱電子病歷資料及電話隨訪獲取患者病情進(jìn)展。隨訪截止日期為2023年12月31日。至截止日已死亡患者可視為完整數(shù)據(jù)。總生存期（OS）定義為從入組開始至因?yàn)槿魏卧蛞鸬乃劳鰰r(shí)間或隨訪截止時(shí)間；無進(jìn)展生存期（PFS）定義為從入組開始至疾病進(jìn)展、復(fù)發(fā)、死亡或末次隨訪時(shí)間。生存期以月為單位。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)數(shù)資料用百分率（%）表示，正態(tài)分布使用t檢驗(yàn)。通過基于R語言的網(wǎng)頁工具Cut-off Finder（http://molpath.charite.de/cut-off/）探尋可以區(qū)分患者預(yù)后的最佳VAF截?cái)嘀?，?duì)列的患者依據(jù)不同的VAF值分成對(duì)應(yīng)的兩組（高VAF組/低VAF+野生型組），R包生存期的函數(shù)survfit對(duì)依據(jù)不同VAF值分成的兩組患者采用Log rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存比較，Log rank檢驗(yàn)P值最低時(shí)所對(duì)應(yīng)的VAF值則為該基因的最佳VAF截?cái)嘀礫8]。Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，兩組間生存差異顯著性檢驗(yàn)使用Log rank法比較。單因素和多因素Cox回歸分析法分析ITPKB突變狀態(tài)和突變VAF與PFS之間的關(guān)系。所有分析均使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行，雙側(cè)P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 155例DLBCL患者ITPKB突變VAF與臨床特征的關(guān)系

155例患者共檢測(cè)到475種基因突變，其中ITPKB突變的患者有29例（29/155, 18.71%）。通過對(duì)本研究入組的155例初診DLBCL患者中ITPKB突變患者的VAF值分析發(fā)現(xiàn)，ITPKB突變患者VAF值為10.65%～55.81%，VAF值分布為正態(tài)分布（P=0.067），平均數(shù)為26.00%。t檢驗(yàn)分析不同分組情況下VAF分布情況，結(jié)果顯示ITPKB突變患者VAF值在大包塊及結(jié)外受累數(shù)目的分組中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.049,P=0.005），見表1。

表1 155例DLBCL患者的ITPKB突變VAF與臨床特征的關(guān)系 (n=155)Table 1 Relationship between ITPKB mutation VAF and clinical characteristics of 155 DLBCL patients (n=155)

2.2 DLBCL患者ITPKB突變VAF值與預(yù)后的關(guān)系

2.2.1 基于PFS和OS分層的ITPKB VAF臨界值對(duì)預(yù)后的影響 通過基于R語言的網(wǎng)頁工具探尋可以區(qū)分患者預(yù)后的最佳VAF截?cái)嘀担?duì)列的患者依據(jù)不同的VAF值分成對(duì)應(yīng)的兩組（高VAF組vs.低VAF+野生型組），研究結(jié)果顯示，ITPKB為27.48%（HR=3.48, 95%CI: 1.70～7.13,P<0.001）。見圖1A。借助基于R語言的網(wǎng)頁工具Cut off Finder[8]（http://molpath.charite.de/cutoff/），ITPKB突變沒有可用的最佳VAF臨界值（HR=2.06, 95%CI:0.88～4.85,P=0.09），見圖1B。

圖1 通過基于R語言的網(wǎng)絡(luò)應(yīng)用Cut-off Finder確定ITPKB突變的最佳VAF臨界值對(duì)PFS(A)和OS(B)進(jìn)行分層Figure 1 Determination of the optimal VAF threshold for ITPKB mutations by the R-language based web application Cut-off Finder, by which the optimal threshold is clearly stratified for PFS(A) and OS(B)

2.2.2 ITPKB與PFS之間的關(guān)系 ITPKB突變患者的PFS與未突變患者的PFS相比明顯縮短（37.00個(gè)月vs.108.00個(gè)月；HR=1.643, 95%CI: 0.920～2.934,P=0.090），見圖2A，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步將ITPKB基因狀態(tài)分為VAF≥28%、VAF<28%和野生型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，ITPKB VAF<28%患者中位PFS與ITPKB野生型患者相比有延長(zhǎng)趨勢(shì)（未達(dá)到vs.108.00個(gè)月；HR=0.919, 95%CI: 0.393～2.147,P=0.850），見圖2B。ITPKB VAF≥28%患者PFS比ITPKB野生型患者明顯縮短（13.00月vs.108.00月；HR=3.551, 95%CI: 1.724～7.314,P<0.001），見圖2C。ITPKB VAF≥28%患者PFS比ITPKB VAF<28%縮短（13.00個(gè)月vs.未達(dá)到；HR=2.997,95%CI: 1.041～8.624,P=0.036），見圖2D?；谏鲜龇纸M，進(jìn)一步結(jié)合年齡、性別、COO分型、IPI、LDH等臨床指標(biāo)分別進(jìn)行單因素、多因素Cox分析發(fā)現(xiàn)，在ITPKB突變與未突變組，ITPKB突變狀態(tài)本身與PFS無關(guān)，non-GCB亞型是PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（HR=1.716, 95%CI: 1.042～2.826,P=0.034），見圖3；當(dāng)ITPKB基因狀態(tài)在28%VAF臨界值對(duì)PFS分層時(shí)，高ITPKB VAF（≥28%），是預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

圖2 無進(jìn)展生存期(PFS)與ITPKB突變狀態(tài)或變異等位基因頻率(VAF)的關(guān)系Figure 2 Relationship between progression-free survival (PFS) and ITPKB mutation status or variant allele frequency (VAF)

圖3 ITPKB突變狀態(tài)和突變VAF與PFS之間單因素和多因素Cox回歸分析Figure 3 Univariate and multivariate Cox hazards analyses for PFS and ITPKB mutation status or mutation VAF

3 討論

DLBCL傳統(tǒng)的最重要的預(yù)后指標(biāo)是基于臨床指標(biāo)的IPI評(píng)分，然而在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，即使某些DLBCL患者的傳統(tǒng)預(yù)后指標(biāo)相同，但他們的預(yù)后仍然存在較大的差異，這些差異可歸因于腫瘤的分子學(xué)異質(zhì)性。以往的研究發(fā)現(xiàn)很多預(yù)后相關(guān)基因，每種基因之間的不同表達(dá)可能影響患者的臨床特征[9]。已有很多研究探索了基因突變狀態(tài)及突變類型與DLBCL預(yù)后的關(guān)系。此外，國(guó)內(nèi)外對(duì)于VAF與血液系統(tǒng)惡性腫瘤預(yù)后相關(guān)的研究越來越多，但有關(guān)VAF在DLBCL中的預(yù)后價(jià)值相關(guān)研究鮮有報(bào)道，本研究對(duì)相關(guān)問題進(jìn)行探索性研究發(fā)現(xiàn)，DLBCL患者中ITPKB基因突變的高VAF與患者較短的PFS之間存在獨(dú)立的關(guān)聯(lián)，提示ITPKB突變的高VAF是DLBCL患者的一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

ITPKB作為體細(xì)胞突變靶向的新基因在原發(fā)縱隔B細(xì)胞淋巴瘤（PMBL）中首次被發(fā)現(xiàn)[10]。有研究報(bào)道ITPKB可以影響B(tài)細(xì)胞的存活和功能，ITPKB缺乏使B細(xì)胞存活存在缺陷，導(dǎo)致B細(xì)胞譜系的特異性和內(nèi)在發(fā)育改變以及對(duì)體內(nèi)抗原無反應(yīng)，其可以通過Rasa3-Erk信號(hào)通路介導(dǎo)B細(xì)胞的存活，控制促凋亡基因Bim的表達(dá)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)ITPKB是急性髓系白血?。ˋML）的預(yù)后因素，而且首次報(bào)告ITPKB突變是AML患者總生存和無病生存的獨(dú)立因素[12]。在一項(xiàng)關(guān)于原發(fā)性乳腺淋巴瘤（PBL）的研究中發(fā)現(xiàn)ITPKB作為一種高突變基因，有縮短總生存期（OS）和無進(jìn)展生存期（PFS）的趨勢(shì)，可能與預(yù)后不良相關(guān)[13]。近年來越來越多的機(jī)制相關(guān)研究表明ITPKB值得在DLBCL中進(jìn)一步研究，如有研究發(fā)現(xiàn)ITPKB是順鉑耐藥性癌癥治療干預(yù)重要的靶標(biāo)，它的產(chǎn)物肌醇1,3,4,5-四基磷酸酯（IP4）在順鉑暴露后的氧化還原穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用，通過抑制ROS產(chǎn)生的酶NADPH氧化酶4（NOX4）降低了順鉑誘導(dǎo)的ROS，可促進(jìn)順鉑耐藥性腫瘤的生長(zhǎng)[14]。

我們?cè)诋?dāng)前研究中發(fā)現(xiàn)VAF水平較高的ITPKB突變的患者PFS較野生型ITPKB患者短，而VAF水平較低的患者則沒有表現(xiàn)出縮短的趨勢(shì)，與之相反的是，VAF水平較低的ITPKB突變的患者較野生型ITPKB患者PFS有延長(zhǎng)，但二者的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步比較VAF水平較高的ITPKB突變患者與VAF水平較低的ITPKB突變患者的PFS，發(fā)現(xiàn)前者的PFS明顯縮短，多因素分析表明ITPKB高VAF是預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。目前的我們的研究進(jìn)一步證實(shí)了以往的研究，同時(shí)也突出了ITPKBVAF在DLBCL的預(yù)后價(jià)值。

本研究表明，ITPKB的突變與DLBCL的生存之間的關(guān)系可能受到突變VAF的影響。這些發(fā)現(xiàn)使我們認(rèn)識(shí)到基因突變的VAF值在DLBCL預(yù)后預(yù)測(cè)中的潛在價(jià)值。然而某些基因的VAF高突變與疾病之間關(guān)系更詳細(xì)的機(jī)制目前還尚不清楚。因?yàn)槲覀兊难芯繕颖玖可?、缺乏外部?yàn)證等，所以具有一定的局限性，除了突變狀態(tài)和突變VAF以外，其他突變特征如突變位點(diǎn)、突變類型（單核苷酸多態(tài)性、拷貝數(shù)變異等）也可能是影響DLBCL臨床和預(yù)后的重要因素，我們需要結(jié)合它們之間的潛在聯(lián)系，在此基礎(chǔ)上擴(kuò)大樣本量，通過進(jìn)一步的研究證實(shí)我們當(dāng)前的發(fā)現(xiàn)，并探索各種突變特征在DLBCL中的意義。

總之，本研究表明ITPKB突變對(duì)DLBCL患者PFS的影響高度依賴其突變VAF，ITPKB基因突變高VAF是DLBCL患者PFS的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ITPKB突變的VAF在DLBCL患者中具有預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。