吳慧，孫麗娜，潘璋馳，施純玫2,

0 引言

肝細(xì)胞肝癌是全世界常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤之一，2020年全球有905 677人被診斷患有肝癌，有830 180人因罹患肝癌死亡，癌癥死亡原因全球排名第三[1]，2015年中國(guó)肝癌發(fā)病人數(shù)37萬(wàn)，死亡人數(shù)32.6萬(wàn)[2]。免疫療法在肝細(xì)胞癌、晚期黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）等腫瘤患者中有一定的治療效果[3]，其中以PD-1/PD-L1抑制劑為代表，使抗PD-1治療成為最有前景的免疫療法之一[4]。靶向PD-1/PD-L1的藥物可以重新激活機(jī)體的抗腫瘤免疫，并實(shí)現(xiàn)對(duì)多種腫瘤的長(zhǎng)期控制。然而，如何預(yù)測(cè)患者對(duì)免疫治療的敏感度，提高腫瘤人群抗PD-1治療的應(yīng)答率仍不清楚，同時(shí)免疫療法可能有嚴(yán)重的不良反應(yīng)，生物標(biāo)志物可以篩選出最有可能受益的人群。腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞可作為各種癌癥的較理想的預(yù)后指標(biāo)[5]，某些情況下，PD-L1在腫瘤中的表達(dá)也與T細(xì)胞反應(yīng)相關(guān)[6]；一些研究表明，腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden, TMB）高的NSCLC患者更有可能受益于抗PD-1單克隆抗體免疫治療[7]。然而，這些生物標(biāo)志物的分析依賴于腫瘤組織樣本，腫瘤組織活檢是有創(chuàng)檢測(cè)，存在一定的腫瘤異質(zhì)性，不能反映整體情況，且無(wú)法連續(xù)檢測(cè)。其他免疫治療標(biāo)志物包括循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）[8]、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）上的TMB檢測(cè)和PD-L1[9]的表達(dá)，對(duì)免疫治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)價(jià)值也在積極探索中。本研究中，我們檢測(cè)記錄了肝細(xì)胞癌（HCC）患者免疫治療之前或期間的血液學(xué)指標(biāo)，以反映患者的免疫狀態(tài)，并進(jìn)一步探討了這些免疫參數(shù)對(duì)肝細(xì)胞癌患者抗PD-1免疫治療效果的預(yù)測(cè)價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2019年10月—2020年10月福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院經(jīng)組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)確診為肝細(xì)胞癌并使用抗PD-1治療的85例患者。入組人群中16例曾接受外科手術(shù)治療，45例曾接受介入治療，其中72例為接受規(guī)律抗病毒治療的乙肝病毒感染患者。

簽署患者知情同意書(shū)、充分告知后采集空腹外周血。使用人體組織樣本的實(shí)驗(yàn)獲得了福建醫(yī)科大學(xué)附屬協(xié)和醫(yī)院臨床研究倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

研究對(duì)象納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)病理、影像學(xué)等檢查確診為肝細(xì)胞癌，滿足接受PD-1單抗治療入組標(biāo)準(zhǔn)（甲狀腺功能、皮質(zhì)醇、心肌酶檢測(cè)正常，無(wú)間質(zhì)性肺病影像學(xué)表現(xiàn)，無(wú)感染，未正在接受抗感染治療，無(wú)風(fēng)濕免疫相關(guān)疾病，無(wú)1型糖尿病，無(wú)嚴(yán)重心血管疾病等），予抗PD-1免疫治療3周期以上的患者；前期未接受過(guò)任何免疫治療的患者；有影像學(xué)可觀察的靶病灶，用于免疫治療臨床療效的客觀評(píng)價(jià)。排除標(biāo)準(zhǔn)：病理診斷不明確的患者；近期接受其他可能影響檢測(cè)結(jié)果的免疫治療；自身免疫性疾病患者；沒(méi)有可測(cè)量的靶病灶。

1.2 治療方法

入組患者均接受抗PD-1免疫治療，治療前及用藥3周期后予影像學(xué)檢查評(píng)估療效。具體用藥方案如下：帕博利珠單抗200 mg，每3周一次。每3周期進(jìn)行一次療效評(píng)價(jià)?；颊咴诮邮苊庖咚幬镏委煹耐瑫r(shí)可聯(lián)合或不聯(lián)合其他靶向治療方案，直至疾病進(jìn)展或出現(xiàn)不可耐受的不良反應(yīng)。

1.3 免疫治療評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

免疫相關(guān)反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)（immune-related response criteria, irRC）：（間隔至少4周的兩次連續(xù)觀察點(diǎn)）完全緩解（CR），所有靶病灶消失；部分緩解（PR），總腫瘤負(fù)荷較基線負(fù)荷下降50%及以上；病變進(jìn)展（PD），總腫瘤負(fù)荷較基線至少增加25%；病變穩(wěn)定（SD），總腫瘤負(fù)荷較基線下降不足50%，或增加不足25%。新發(fā)現(xiàn)可測(cè)量病灶需要納入總腫瘤負(fù)荷評(píng)價(jià)是否進(jìn)展，新發(fā)現(xiàn)不可測(cè)量病灶不定義是否進(jìn)展。

入組腫瘤患者在接受抗PD-1免疫治療前，均有基線檢查結(jié)果，其中包括血常規(guī)、血生化、腫瘤標(biāo)志物等結(jié)果，頭顱、胸部、腹部、肝臟MR或CT及PET-CT等臨床檢查結(jié)果，用于全面綜合評(píng)估腫瘤病情。用藥每3周期再進(jìn)行上述相關(guān)的臨床檢驗(yàn)和檢查，用于評(píng)價(jià)免疫治療臨床療效。根據(jù)實(shí)體瘤療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，患者至少存在一個(gè)可測(cè)量靶病灶，通過(guò)上述影像學(xué)方法，測(cè)量并記錄各靶病灶最大垂直徑。85例肝細(xì)胞癌患者均經(jīng)電話隨訪、微信隨訪、門診復(fù)查、住院檢查隨訪等，隨訪截至2022年6月。本研究采用美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）和國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟（UICC）開(kāi)發(fā)的肝癌TNM分期系統(tǒng)（2017年AJCC第8版）。

目前影像學(xué)評(píng)估仍為接受免疫治療患者療效評(píng)估的最重要手段。腫瘤負(fù)荷（tumor burden,TB）：可測(cè)量的總腫瘤負(fù)荷定義為治療前影像學(xué)報(bào)告中所有可測(cè)量各靶病灶兩最大垂直徑乘積，病灶總數(shù)不超過(guò) 5個(gè)（每個(gè)器官不超過(guò)2個(gè)）。

1.4 主要儀器

流式抗體購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司，臺(tái)式多功能高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

使用臺(tái)式多功能高速冷凍離心機(jī)將外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）進(jìn)行分離，細(xì)胞表面及胞內(nèi)抗體孵育及細(xì)胞染色，將細(xì)胞重新放置在鞘液中上流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS24.0，GraphPad Prism 8.0和X-tile version 3.6.1軟件統(tǒng)計(jì)分析。T細(xì)胞活化與腫瘤負(fù)荷比與臨床病理的關(guān)系通過(guò)卡方檢驗(yàn)計(jì)算。X-tile對(duì)生存分析相關(guān)外周血生物指標(biāo)取截?cái)嘀?，Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，多因素Cox回歸評(píng)估預(yù)后影響因素。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

本實(shí)驗(yàn)共納入85例肝細(xì)胞癌患者，其中女37例、男48例?；颊吣挲g最大95周歲，最小27周歲，平均年齡55歲。經(jīng)過(guò)三周期免疫治療，15例被評(píng)估為疾病進(jìn)展（PD），為治療無(wú)應(yīng)答組；51例被評(píng)估為疾病穩(wěn)定（SD），13例為疾病緩解（PR），6例為完全緩解（CR），這70例為應(yīng)答組。85例HCC患者從免疫治療開(kāi)始計(jì)算生存時(shí)間，截至2022年6月，隨訪時(shí)間12～36個(gè)月，平均24個(gè)月。隨訪期內(nèi)死亡21例（24.7%）。結(jié)果顯示：患者生存時(shí)間與年齡、有無(wú)轉(zhuǎn)移、ECOG（PS）評(píng)分有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

表1 85例肝細(xì)胞癌患者T細(xì)胞活化與腫瘤負(fù)荷比與臨床病理特征的關(guān)系Table 1 Relationship between T-cell invigoration to tumour burden ratio and clinicopathological features in 85 cases of HCC

2.2 免疫參數(shù)分析

單因素及多因素分析提示Ki-67+/PD-1+CD8+（%）、Ki-67+/PD-1+CTLA-4+CD4+（%）、Ki-67+/PD-1+CTLA-4+CD8+（%）可能與無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）獨(dú)立相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)圖1。治療過(guò)程中（第1～3次抗PD-1免疫治療前），Ki-67表達(dá)的增加在PD-1+CD8+ T細(xì)胞和PD-1-CD8+ T細(xì)胞中差異最顯著（P<0.0001），見(jiàn)圖2。與PD-1-亞群相比，PD-1+亞群的Ki-67應(yīng)答在治療1周期后達(dá)到高峰（P<0.0001），大多數(shù)腫瘤患者（85例中的55例）在治療后其PD-1+CD8+T細(xì)胞中Ki-67有生物學(xué)意義的增加。治療周期中，免疫治療應(yīng)答組PD-1+/CD8+T細(xì)胞Ki-67表達(dá)率的最大倍數(shù)變化高于無(wú)應(yīng)答組（P<0.001）。

圖1 患者無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間與臨床免疫參數(shù)特征的關(guān)系Figure 1 Relationship between p r o g r e s s i o n-f r e e s u r v i v a l a n d clinicopathological features

圖2 治療前與治療1周期時(shí)PD-1+CD8+ T細(xì)胞中Ki-67的表達(dá)Figure 2 Ki-67 expression in PD-1+CD8+ T cells before and at the first cycle of treatment

2.3 預(yù)后分析

X-t i l e 對(duì)生存分析相關(guān)外周血生物指標(biāo)Ki-67（%）/TB取截?cái)嘀禐?.6，治療3周后PD-1+CD8+T細(xì)胞Ki-67表達(dá)率與腫瘤負(fù)荷比的無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）、總生存期（OS），見(jiàn)圖3。免疫治療三周后Ki-67（%）/TB≥0.6患者較Ki-67（%）/TB<0.6的患者PFS延長(zhǎng)（7.3月vs.5.9月，P=0.0008）；免疫治療三周后Ki-67（%）/TB≥0.6患者較Ki-67（%）/TB<0.6的患者OS延長(zhǎng)（11.4月vs.9.8月，P=0.0485）。

圖3 治療后PD-1+CD8+ T細(xì)胞Ki-67表達(dá)率與腫瘤負(fù)荷比的無(wú)進(jìn)展生存分析(A)和總體生存分析(B)Figure 3 Progress-free survival(A) and overall survival(B)for Ki-67 expression in PD-1+CD8+ T cells after treatment to tumor burden ratio

3 討論

針對(duì)程序性細(xì)胞死亡蛋白（PD）-1的免疫檢查點(diǎn)阻滯劑（ICBs）已被用于肝癌的治療[10]，免疫治療中的生物標(biāo)志物不僅用于篩選免疫治療潛在獲益人群，而且有助于預(yù)測(cè)免疫療效和制定后續(xù)治療方案。生物指標(biāo)如轉(zhuǎn)移灶的解剖位置、PD-L1的表達(dá)、TMB、外周血循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA）[11]、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（CTC）上的PD-L1表達(dá)[12]等可能對(duì)免疫治療預(yù)后有一定的預(yù)測(cè)作用。腫瘤組織的獲取和檢測(cè)分析仍有局限性，尤其是內(nèi)臟腫瘤患者，考慮到腫瘤的異質(zhì)性及組織標(biāo)本采集的有創(chuàng)性，這些預(yù)測(cè)因子仍不十分理想。外周血的分析更容易重復(fù)進(jìn)行，提供了一個(gè)完整系統(tǒng)的免疫治療反應(yīng)觀察，識(shí)別相關(guān)的反應(yīng)細(xì)胞類型，可能有助于初步了解持續(xù)臨床反應(yīng)的潛在免疫機(jī)制。

Ki-67是一種與核糖體RNA轉(zhuǎn)錄相關(guān)的核蛋白，由MKI67基因編碼，是細(xì)胞增殖的標(biāo)志物。它可以在細(xì)胞分裂周期的所有階段被檢測(cè)到，如果活躍的細(xì)胞周期中的Ki-67被去除會(huì)導(dǎo)致mRNA和蛋白表達(dá)的快速下調(diào)，可引起細(xì)胞暫時(shí)或永久地進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)。這種細(xì)胞增殖和Ki-67蛋白表達(dá)的相關(guān)性表明Ki-67在細(xì)胞生長(zhǎng)或分裂中發(fā)揮的作用，使該蛋白的表達(dá)成為檢測(cè)某一細(xì)胞亞群生長(zhǎng)情況的理想標(biāo)志物。在分裂活躍的癌細(xì)胞中Ki-67呈強(qiáng)表達(dá)，Ki-67陽(yáng)性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞存在提示生存和預(yù)后不良[13]。本研究將Ki-67用于T細(xì)胞再生活化的標(biāo)志物，對(duì)抗PD-1療效進(jìn)行預(yù)測(cè)研究。

在臨床前模型中，腫瘤負(fù)荷是抗PD-1免疫治療后T細(xì)胞衰竭和再生嚴(yán)重程度的關(guān)鍵決定因素，阻斷PD-1通路可部分激活臨床前模型中的Tex細(xì)胞[14-15]，并在包括黑色素瘤在內(nèi)的許多人類癌癥中產(chǎn)生臨床反應(yīng)[16]。在進(jìn)行免疫檢查點(diǎn)阻斷的小鼠模型中[14]以及在接受抗CTLA-4治療聯(lián)合放射治療的患者中[15]，Ki-67是一種細(xì)胞增殖和T細(xì)胞再生的標(biāo)志物。有研究認(rèn)為外周血PD-1+ CD8+ T細(xì)胞的第一周增殖反應(yīng)（Ki-67 D7/D0）可以預(yù)測(cè)實(shí)體瘤抗PD-1治療的反應(yīng)[17]?；谀[瘤負(fù)荷的預(yù)后判斷提示，腫瘤負(fù)荷高的患者接受PD-1治療的預(yù)后相對(duì)較差，可能是由PD-1抑制劑誘導(dǎo)的恢復(fù)活力的CD8+T細(xì)胞數(shù)量不足，無(wú)法啟動(dòng)足夠的細(xì)胞殺傷反應(yīng)。使用特定靶點(diǎn)的免疫抑制劑可釋放T細(xì)胞對(duì)抗腫瘤，這些細(xì)胞的活性呈現(xiàn)出比其他癌癥療法更有利的重要特征，包括特異性、適應(yīng)性和記憶性等[18-19]。

對(duì)抗PD-1治療產(chǎn)生應(yīng)答的CD8+ T細(xì)胞與疫苗接種致急性感染的減毒活病毒誘導(dǎo)的效應(yīng)細(xì)胞具有許多共同特征，如Bcl-2、CCR7和CD45RA的低表達(dá)，以及抗原特異性CD8+ T細(xì)胞，且對(duì)抗PD-1治療有特殊反應(yīng)。衰竭型CD8+ T細(xì)胞表達(dá)包括PD-1在內(nèi)的多個(gè)抑制性受體，阻斷PD-1受體可改善此類T細(xì)胞的反應(yīng)[14]。CD8+ T細(xì)胞可以對(duì)許多人類癌癥類型，特別是那些具有更高突變負(fù)荷的癌癥類型產(chǎn)生反應(yīng)[20]。不同研究中，腫瘤細(xì)胞或腫瘤浸潤(rùn)的外周血細(xì)胞上PD-L1表達(dá)與臨床對(duì)PD-1免疫治療的反應(yīng)有關(guān)，預(yù)先存在的腫瘤T細(xì)胞浸潤(rùn)可能是多種腫瘤的一個(gè)預(yù)后良好的指標(biāo)[21]。此外，PD-L1在腫瘤中的表達(dá)在某些情況下與T細(xì)胞反應(yīng)有關(guān)[22]。這些衰竭型CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)常常不能根除腫瘤，細(xì)胞會(huì)變得功能失調(diào)或衰竭，與效應(yīng)T細(xì)胞和記憶CD8+ T細(xì)胞相比，外周血衰竭型T細(xì)胞的效應(yīng)功能較弱，并且分化模式發(fā)生了改變，這類衰竭型細(xì)胞也受到包括PD-1在內(nèi)的抑制性受體的調(diào)控抑制[23]。

臨床中部分腫瘤患者，接受抗PD-1治療不能獲得較好的臨床治療效果，可能是由于不能誘導(dǎo)免疫恢復(fù)，也可能由于T細(xì)胞活力恢復(fù)和腫瘤負(fù)荷之間的不平衡，與治療前腫瘤負(fù)荷相關(guān)的循環(huán)衰竭型T細(xì)胞恢復(fù)活力的大小與臨床療效相關(guān)[24]。本研究結(jié)果提示預(yù)先存在的與腫瘤負(fù)荷相關(guān)的CD8+T細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，通過(guò)抗PD-1治療增強(qiáng)。這說(shuō)明腫瘤負(fù)荷是抗PD-1免疫治療后T細(xì)胞衰竭和再生程度的關(guān)鍵決定因素。同時(shí)，對(duì)抗PD-1免疫治療不同反應(yīng)的患者，PD-1+CD8+ T細(xì)胞Ki-67在治療周期中表達(dá)率的最大倍數(shù)變化比較，應(yīng)答組更高。外周血中CD8+ T細(xì)胞反應(yīng)一般不持續(xù)，僅在一兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)能被檢測(cè)到。這些發(fā)現(xiàn)可能表明，被抑制信號(hào)阻斷激活的PD-1+ CD8+ T細(xì)胞會(huì)擴(kuò)張，在治療后的幾周內(nèi)可以在外周血中檢測(cè)到循環(huán)，但隨后會(huì)遷移到腫瘤或炎性反應(yīng)部位。

本研究中Ki-67+ CD8+ T細(xì)胞在抗PD-1治療1周期后明顯增加，與PD-1-亞群相比，PD-1+亞群的Ki-67應(yīng)答在治療1周期后達(dá)到高峰，大多數(shù)腫瘤患者在治療后其PD-1+ CD8+ T細(xì)胞中Ki-67有生物學(xué)意義的增加。已知PD-1不僅由衰竭型T細(xì)胞表達(dá)，而且由效應(yīng)細(xì)胞、效應(yīng)記憶和中央記憶CD8+T細(xì)胞[25]表達(dá)，比較該類細(xì)胞與上述T細(xì)胞亞群的Ki-67的表達(dá)差異，衰竭型T細(xì)胞有更高的增殖及Ki-67、PD-1+ CD8+ T細(xì)胞的表達(dá)率。細(xì)胞再生和腫瘤負(fù)荷之間的關(guān)系表明，免疫系統(tǒng)對(duì)抗原負(fù)荷的反應(yīng)是經(jīng)機(jī)體“校準(zhǔn)”的，如果腫瘤負(fù)荷高，即使是強(qiáng)有力的抗PD-1治療也可能在臨床上無(wú)效。

利益沖突聲明：

所有作者均聲明不存在利益沖突。