袁 鳴 朱銘瑋 解志軍 康 真 張中會 李淑嫻

（1.南京林業(yè)大學南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210037；2.南京市六合區(qū)人民政府橫梁街道農業(yè)服務中心 南京 211515；3.襄陽市林業(yè)科學技術推廣站 襄陽 441022；4.蘇州紐邁分析儀器股份有限公司 蘇州 215163）

核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）技術作為一種快速、無損的新型測定技術，能通過測得樣品氫質子密度與分布來反映樣品中的水分相態(tài)含量及遷移情況（謝小雷等，2014；宋平等，2016；Xiaoet al.，2017）。近年來，核磁共振波譜（nuclear magnetic resonance spectroscopy）技術已廣泛應用于食品、生物學等領域（石芳等，2017）。宋珊珊等（2020）利用核磁共振技術發(fā)現(xiàn)板栗（Castanea mollissima）種子貯藏期間，不易流動水可以轉化為結合水、自由水以穩(wěn)定其內部結構。汪楠等（2017）利用核磁共振技術對稻谷（Olyza Sativa）的干燥特性與水分遷移規(guī)律進行研究，結果表明，干燥過程中3 種狀態(tài)水分的核磁反演圖譜向左遷移，結合水和束縛水的峰面積顯著減少，但自由水的峰面積變化較小。

沼生櫟（Quercus palustris）是殼斗科（Fagaceae）櫟屬（Quercusspp.）落葉喬木，原產美國，廣泛分布在北半球溫帶區(qū)域（段麗君等，2020）。沼生櫟樹形優(yōu)美，葉緣有齒裂，新葉亮紅色，熟葉深綠色，秋季葉色逐漸轉變?yōu)槌燃t色或銅紅色（格瑞，2004）。沼生櫟喜光照，抗風性強，抗霜凍，能適應城市環(huán)境污染，在我國北京、泰安等地區(qū)均有引種栽培，是良好的城市園林、工業(yè)區(qū)綠化樹種（李云龍，2001；黃利斌，2007）。沼生櫟以種子繁殖為主，但該種子對失水較敏感，屬頑拗性種子，這給其運輸、貯藏帶來諸多不便（Dickieet al.，2002；Xiaet al.，2012a）。水分流失的高度敏感是影響頑拗性種子貯藏和長期保存的主要因素，失水過程中水分相態(tài)的變化及各相態(tài)的水分在脫水過程中的作用還鮮有研究。鑒于此，本文擬利用核磁共振技術探究沼生櫟種子失水過程中種子內部水分相態(tài)及含量的變化，同時測定失水過程中種子發(fā)芽率的變化，探明其半致死和致死含水量，為沼生櫟種子的運輸、貯藏提供指導，也為其他頑拗性種子的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

沼生櫟種子于2018 年秋季從美國北卡羅來納州達勒姆進口。2019 年春天購于上?，庣鲌@林有限公司，水選去除蟲害粒，選取無機械損傷的種子用于試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 新鮮種子含水量測定及試驗材料處理 隨機數(shù)取新購（對照）沼生櫟種子5 粒，重復3 次，將每粒種子切成4 部分，用千分之一天平稱重，按照ISTA（2020）的要求，采用低恒溫烘干法測定新購種子的含水量。

種子處理：隨機數(shù)取一定數(shù)量的新購種子，稱重后將種子置于實驗室臺面上自然風干，每天對種子進行稱重并計算其含水量。當種子含水量降至30.0%、25.0%、20.0%、15.0%、10.0%時，取一定數(shù)量各失水階段的種子用于各試驗，以新購買的種子作對照。

1.2.2 種子發(fā)芽率測定 沼生櫟種子具有淺休眠特性，因此發(fā)芽率測定前需先將1.2.1 中處于不同含水量階段的種子放在4 ℃的冷庫中，濕沙層積15 天解除休眠。層積結束后，隨機數(shù)取不同含水量的種子25 粒，3 次重復，將種子置于沙床中，在25 ℃的光照培養(yǎng)箱中進行發(fā)芽試驗。3 天后記錄發(fā)芽種子的粒數(shù)，每2 天統(tǒng)計1 次，胚根長度達到0.5 cm 時即認為種子已萌發(fā)。按照ISTA（2020）的規(guī)定，連續(xù)3 天發(fā)芽粒數(shù)不超過1%時即認為發(fā)芽結束。發(fā)芽結束后，計算對照及各處理種子的發(fā)芽率。

1.2.3 種子半致死含水量的確定 根據(jù)試驗結果繪制含水量—發(fā)芽率的關系曲線，再利用Excel 擬合，得出符合該曲線的回歸方程（李佳琦等，2021），計算沼生櫟種子的半致死含水量。

1.2.4 種子失水過程中各水分相態(tài)的測定 選取外表完好的沼生櫟種子10 粒，3 次重復，將其置于玻璃試管中，放置在低場核磁共振儀（蘇州紐邁電子科技有限公司，PQ001，0.5 T；射頻脈沖頻率：12.2 MHz；探頭線圈直徑：25 mm）中進行測定。測定時，采用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gill）脈 沖 序 列，并 利 用SIRT（聯(lián)合迭代重建技術）算法反演操作，得到T2弛豫圖譜。CPMG 脈沖序列的主要參數(shù)：主頻SF=21 MHz，偏移頻率O1=239 082.32 Hz，90°脈沖射頻脈寬P1=5.20 μs，180°脈沖射頻脈寬P2=10.80 μs，信號采樣點數(shù)TD=79 998，重復采樣等待時間TW=2 000 ms，重復采樣次數(shù)NS=16，回波時間TE=0.1 ms，回波個數(shù)NECH=4 000。隨后將種子置于實驗臺面自然風干，每天稱重并計算其含水量。當含水量達到預定值時，再將種子置于核磁共振儀中重復上面的操作，直至種子含水量降為10.0%為止。

1.2.5T2弛豫譜峰面積與沼生櫟種子含水量關系的構建 NMRT2弛豫譜總峰面積與樣品中氫質子的數(shù)量成正比，故可以用T2弛豫譜總峰面積反映種子中水分的含量。參照宋平等（2015）的方法，將傳統(tǒng)的質量信號換做核磁信號量，再通過回歸分析，確定T2弛豫譜總峰面積與種子含水量的回歸方程，通過R2檢驗對回歸方程的擬合效果進行校驗。

2 結果與分析

2.1 失水對沼生櫟種子發(fā)芽率的影響

失水過程中，沼生櫟種子發(fā)芽率的變化見表1。沼生櫟種子初始含水量為38.0%，發(fā)芽率為96.00%。隨著種子的不斷失水，發(fā)芽率呈下降趨勢。當含水量下降至30.0%時，種子的發(fā)芽率較CK 下降6.95%，但二者差異不顯著（P＜0.05）；含水量降至25.0%時，發(fā)芽率顯著下降至81.33%，較CK 下降15.28%；含水量下降至20.0%時，發(fā)芽率下降至74.67%，較CK 下降22.22%，種子的外部形態(tài)也發(fā)生明顯變化，即種皮變硬，顏色變淺，切開后發(fā)現(xiàn)子葉與種皮已明顯分離；含水量下降至10.0%時，種子完全喪失萌發(fā)能力，發(fā)芽率降為0。上述結果表明，沼生櫟種子不耐脫水，屬于頑拗性種子，種子完全致死的含水量為10.0%左右。

2.2 沼生櫟種子含水量與發(fā)芽率之間的擬合曲線

分別采用多種模式對失水過程中沼生櫟種子含水量與發(fā)芽率之間的關系進行擬合，發(fā)現(xiàn)采用“多項式”擬合模式，其R2最接近1。櫟種子含水量與發(fā)芽率的擬合曲線見圖1，關系方程為y= -0.170 7x2+11.601x-100.15，R2= 0.971 5，其中y為沼生櫟種子發(fā)芽率，x為種子含水量。根據(jù)此方程計算發(fā)芽率下降至50.0%，即半致死狀態(tài)時，種子含水量為17.39%，遠高于正常性種子的安全含水量（10.0%），說明沼生櫟種子的耐脫水性較差。

圖1 沼生櫟種子發(fā)芽率與含水量的擬合曲線Fig.1 Fitting curve of moisture content and germination percentage of Quercus palustris seeds

2.3 失水過程中T2 弛豫時間與水分相態(tài)的劃分

根據(jù)核磁技術原理，橫向弛豫時間T2的長短反映了樣品中水分的自由程度，因此根據(jù)T2弛豫譜中波峰位置的差異可以區(qū)分樣品中水分的相態(tài)。弛豫時間越短，水分的自由度越低,在T2譜上峰位置靠左，反之，弛豫時間越長，水分自由度越高, 在T2譜上峰位置靠右。由圖2 可知，沼生櫟種子失水過程中T2的變化范圍主要在0.01～1 000 ms。橫向弛豫時間T2圖譜有3個明顯的波峰，從左向右各峰值的T2弛豫時間分別為T21、T22、T23。其中弛豫時間較短的T21為束縛水（bound water），該狀態(tài)的水主要被淀粉、蛋白質等大分子包圍或是在細胞內通過氫鍵被大分子物質吸附，流動性很差（宋平等，2015）；弛豫時間較長的T22為不易流動水（immobile water），其流動性雖然受到一定限制，但略高于束縛水；自由水（free water）T23弛豫時間最長，該相態(tài)水為游離狀態(tài)，在細胞內可自由流動，不會被生物大分子吸附，是良好的溶劑，能夠參與細胞的物質代謝。

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圖2 失水過程中沼生櫟種子的T2 反演圖譜Fig.2 Spectrum inversion of transverse relaxation time T2 of Q.palustris seeds during desiccation

2.4 失水對沼生櫟種子內水分相態(tài)的影響

沼生櫟種子失水過程中T2反演譜結果見表2，由各組分水的峰起始點和結束點可以得到其弛豫范圍。失水過程中，束縛水的弛豫范圍呈減小趨勢；含水量下降至25.0%時，弛豫范圍由原來的0.34 ms 顯著減小至0.26 ms（P＜0.05）；含水量下降至10.0%時，弛豫范圍再次顯著減小至0.17 ms。失水過程中自由水的變化較束縛水復雜，其弛豫范圍呈先增大（38.0%～30.0%）后顯著減?。?0.0%～25.0%）再小幅波動的變化趨勢（25.0%～10.0%）：當種子含水量下降至30.0%時，自由水的弛豫范圍由對照的757.23 ms 顯著增加至997.97 ms，增加了31.79%；當含水量下降至25.0%時，弛豫范圍明顯減小至308.91 ms，較對照下降了59.21%。失水過程中不易流動水弛豫范圍的變化趨勢與自由水相反，呈先減?。?8.0%～30.0%）后增大（30.0%～15.0%）隨后小幅波動（15.0%～10.0%）的變化趨勢，但變化幅度明顯小于自由水。當含水量下降至20.0%時，其弛豫范圍由對照的6.41 ms 顯著增大至10.26 ms?？偟膩碚f，沼生櫟種子失水過程中，氫質子自由度逐漸降低，種子內束縛水、自由水的弛豫范圍均明顯減小，說明失水過程中水分與營養(yǎng)物質的結合能力在逐漸變強。

表2 失水過程中沼生櫟種子T2 反演結果①Tab.2 T2 inversion of Q.palustris seeds during desiccation

沼生櫟種子失水過程中各峰頂點時間的變化見圖3。失水過程中，束縛水的峰頂點時間變化較小，維持在0.11 ms 左右，各結果間差異不顯著。不易流動水的峰頂點時間總體呈減小趨勢，即峰頂點向左偏移，特別是失水至15.0%時，峰頂點由對照的2.26 ms 顯著向左偏移至1.72 ms；當含水量下降為10.0%時，峰頂點又繼續(xù)向左顯著偏移至1.04 ms，水分流動性明顯減弱。失水過程中，自由水峰頂點時間整體向右偏移，但失水初始階段（38.0%～30.0%），峰頂點變化不顯著；當含水量下降至25.0%時，峰頂點時間由對照的39.59 ms顯著增加至60.76 ms，增加了53.47%；當含水量下降為10.0%時，峰頂點達到最大值77.69 ms。為減緩水分的散失，沼生櫟種子內的不易流動水會使細胞結構變得更緊密，使水的結合能力變強；而自由水由于具有較好的流動性，較容易散失。

圖3 失水過程中沼生櫟種子各組分峰頂點時間變化Fig.3 Changes of peak time of each phase of water of Q.palustris seeds during desiccation

2.5 核磁共振T2 弛豫譜峰面積與沼生櫟種子含水量的關系

沼生櫟種子核磁共振T2弛豫譜峰面積與含水量的擬合曲線見圖4。在顯著水平α=0.05 進行回歸分析，發(fā)現(xiàn)沼生櫟種子含水量與峰面積之間具有明顯的線性關系，其線性回歸方程為y= 21 132x+ 698.05，其中，y為核磁共振T2弛豫譜峰面積；x為樣品的含水量，相關系數(shù)R2=0.999 6。

圖4 沼生櫟種子核磁共振T2 弛豫譜峰面積與含水量之間的回歸關系Fig.4 Regressive relationship between NMR peak area of T2 relaxation spectrum and moisture content of the Q.palustris seeds

2.6 沼生櫟種子失水過程中各峰面積及其比例的動態(tài)變化

沼生櫟種子失水過程中3 種相態(tài)水分的峰面積及峰面積比例的動態(tài)變化見圖5，其中T21、T22、T23所對應的峰面積分別為S21、S22、S23，S為3 種相態(tài)水含量的總和。隨著含水量的下降，總峰面積呈下降趨勢，且各處理間差異顯著。當含水量下降至10.0%時，總峰面積由原來的62 908.25 降至31 569.89，下降了49.82%，但失水過程中各個相態(tài)水分峰面積的變化趨勢不同：隨著失水時間的延長，自由水峰面積總體呈下降趨勢：含水量由38.0%下降至30.0%時，自由水峰面積下降不顯著，其余各處理間差異顯著；含水量下降至25.0%時，峰面積由對照的41 766.89 下降至28 325.78，下降了32.18%；含水量下降至10.0%時，自由水峰面積僅為14 930.85，較對照下降了26 836.04（64.25%），而此時總峰面積下降了31 569.89，自由水下降的量占總水分的85.01%，說明自由水散失較多。與自由水變化趨勢不同，失水過程中，束縛水峰面積呈先上升（38.0%～20.0%）后下降（20.0%～10.0%）的變化趨勢：含水量下降至20.0%時，束縛水峰面積由對照的2 692.78 顯著上升至4 989.20，上升了85.28%；當含水量下降為10.0%時，束縛水峰面積顯著下降至3 008.11，但仍略高于對照。不易流動水峰面積變化較為復雜，失水過程中其峰面積呈先下降（38.0%～30.0%）后上升（30.0%～25.0%）再下降（25.0%～10.0%）的變化趨勢：含水量下降至30.0%時，不易流動水峰面積由對照的18 286.33 顯著下降至13 391.27，下降了26.77%，下降幅度遠高于同階段的自由水，這可能是由于失水時，部分不易流動水向束縛水轉化，使得束縛水增多；隨后不易流動水峰面積上升，當含水量降為25.0%時，峰面積上升至最大值20 039.86，這可能是由于失水時部分自由水向不易流動水轉化；當種子繼續(xù)失水時，種子內不易流動水的峰面積再次顯著下降。

圖5 失水過程中沼生櫟種子峰面積變化Fig.5 The changes of peak area of Q.palustris seeds during desiccation

失水過程中，沼生櫟種子各相態(tài)水分比例的變化趨勢各不相同（圖6）。新鮮種子中，自由水比例最高，占66.39%，而束縛水和不易流動水比例遠低于自由水，分別占4.28%、29.07%。隨著失水時間的延長，自由水峰面積比例總體呈下降趨勢，當含水量下降至10.0%時，峰面積比例顯著下降至47.29%；但在含水量由38.0%下降至30.0%的過程中，自由水的比例稍有上升。失水過程中，不易流動水的比例呈先下降再上升的變化趨勢：含水量由38.0%下降至30.0%的過程中，不易流動水的比例下降；而當含水量從30.0%下降至25.0%時，該比例大幅增加至38.18%；當含水量降為10.0%時，不易流動水的比例緩慢增加至42.98%。這可能是種子在受失水脅迫時，為減緩水分的散失，不易流動水與大分子物質結合能力變強。失水過程中，束縛水由于本身性質較為穩(wěn)定，且失水過程中部分不易流動水也會向束縛水轉化，因此，含水量由38.0%下降至15.0%的過程中，峰比例一直呈上升趨勢，由對照的4.28%上升至11.27%；隨后峰比例下降至9.53%（含水量10.0%），束縛水比例的動態(tài)變化也說明，由于束縛水與營養(yǎng)物質間具有較強的結合能力，才有效地減緩了水分的散失速率，從而降低失水對種子的傷害。

圖6 失水過程中沼生櫟種子峰比例變化Fig.6 The changes of peak proportion of Q.palustris seeds during desiccation

3 討論

3.1 失水對沼生櫟種子發(fā)芽率的影響

櫟屬植物種子成熟時未經歷脫水階段，所以散落時仍具有較高的含水量和代謝活性（Ntuliet al.，2014），表現(xiàn)出頑拗性種子的特征，具有脫水敏感性（Xiaet al.，2012b）。程繼銘等（2019）在研究脫水和低溫對遼東櫟（Q.wutaishansea）種子萌發(fā)的影響中發(fā)現(xiàn)，無論快速脫水還是緩慢脫水，種子的萌發(fā)率和活力指數(shù)都隨脫水時間的延長而下降。溫祺（2010）也發(fā)現(xiàn)栓皮櫟（Q.variabilis）種子的生活力隨風干時間的延長而不斷下降。本研究發(fā)現(xiàn)，沼生櫟種子在自然失水過程中發(fā)芽率顯著下降。當含水量降低至25.0%時，種子的發(fā)芽率由對照的96.00%顯著下降至81.33%；當含水量進一步下降至10.0%時（正常性種子的安全含水量），沼生櫟種子完全喪失發(fā)芽能力，說明含水量的降低對沼生櫟種子質量影響較大。因此，沼生櫟種子表現(xiàn)出脫水敏感性，為頑拗性種子，在貯藏運輸過程中，需使種子維持較高的含水量。

3.2 沼生櫟種子失水過程中各相態(tài)水分T2 弛豫時間的變化

失水過程中隨著種子含水量的變化，各相態(tài)水分的結合能力也會發(fā)生改變。本研究發(fā)現(xiàn)沼生櫟種子失水過程中，自由水弛豫時間范圍先增大后減小，峰頂點整體向右偏移，且T23在含水量為10.0%時達到最大值；不易流動水的弛豫時間范圍總體變大，峰頂點在含水量下降至20.0%后顯著向左偏移；束縛水性質較為穩(wěn)定，弛豫時間范圍和峰頂點變化不大。孫旭等（2019）研究認為，銀杏種子干燥過程中自由水變化較為顯著，干燥220 min 時，自由水的峰頂點時間達到最大值；束縛水的峰頂點時間變化不大，這與本研究結果相似。宋姍姍等（2020）研究發(fā)現(xiàn)，板栗種子在相對濕度 70%， 25 ℃條件下貯藏過程中，前14 天束縛水的橫向弛豫時間不斷向左移而后穩(wěn)定；而不易流動水的橫向弛豫時間則是右移；自由水橫向馳豫時間先向右移動后左移。不同頑拗性種子在失水或干燥過程中種子各相態(tài)水分的變化規(guī)律不同，這可能與種子中營養(yǎng)物質的種類、貯藏條件以及失水方式不相同等有關。由于自由水在細胞內呈游離狀態(tài)，可自由流動，因此失水過程中，沼生櫟種子內自由水峰頂點整體向右偏移；隨著失水時間的延長，種子內淀粉、蛋白質等營養(yǎng)物質濃度的升高，種子為維持細胞膜的穩(wěn)定性，減少失水脅迫帶來的傷害，會使不易流動水和束縛水峰整體向左偏移，從而使水的結合能力增強。

3.3 沼生櫟種子失水過程中各相態(tài)水分峰面積及比例的動態(tài)變化

失水過程中，沼生櫟種子中各相態(tài)水分峰面積及比例也在不斷變化。當含水量下降至25.0%時，自由水峰面積較對照顯著下降了32.18%，而此時不易流動水、束縛水的峰面積較對照卻顯著增加了9.60%、50.20%，這可能是由于自由水向外散失的同時，有部分自由水向不易流動水轉化，同樣束縛水峰面積的顯著增加也可能是由于部分不易流動水轉化為束縛水造成；當含水量繼續(xù)下降至20.0%時，束縛水峰面積及比例仍是持續(xù)增大，但不易流動水峰面積卻在減小，說明此階段仍有一部分不易流動水向束縛水轉化。由此可推測，即使是頑拗性種子，為減緩水分的散失，會采取措施使水分結合能力變強以維持細胞膜的穩(wěn)定性。宋姍姍等（2020）在板栗種子失水的研究中同樣發(fā)現(xiàn)，貯藏前14 天，胚為了保持自身活性，與淀粉、蛋白質等緊密結合，使束縛水所受約束力不斷增強；隨后束縛水相對穩(wěn)定，部分不易流動水向自由水轉化。

4 結論

1）隨著含水量的下降，沼生櫟種子發(fā)芽率不斷下降，含水量下降至25.0%時，發(fā)芽率顯著下降。含水量降為10.0%時，種子完全死亡。根據(jù)含水量與發(fā)芽率的擬合曲線得出其半致死含水量為17.39%。沼生櫟種子持水能力較弱，不耐脫水，不能像正常種子那樣長時間儲存。

2）沼生櫟種子含水量與核磁共振T2馳豫譜峰面積有顯著的線性關系。

3）T2弛豫圖譜中各峰從左至右依次為為束縛水T21、不易流動水T22以及自由水T233 種相態(tài)。

4）沼生櫟種子失水過程中，自由水峰面積及峰比例持續(xù)降低，峰向右偏移；不易流動水峰面積呈先下降后上升再下降的變化趨勢，峰比例呈先下降后上升的趨勢，峰頂點整體向左偏移，與水的結合能力增強；束縛水本身性質較穩(wěn)定，且失水過程中不易流動水向束縛水轉化，水的結合能力變強。