劉高峰 周再知 趙威威 張青青 黃桂華

（1.中國林業(yè)科學研究院熱帶林業(yè)研究所 廣州 510520；2.菏澤學院 菏澤 274015）

土沉香（Aquilaria sinensis），原名牙香樹，又名白木香，為瑞香科（Thymelaeaceae）沉香屬（Aquilaria）常綠喬木，是我國特有珍貴藥源植物（中國科學院中國植物志編輯委員會，1999）。沉香為土沉香樹體受刺激或損傷后產(chǎn)生的分泌物與木質(zhì)結(jié)合形成的沉香木，是傳統(tǒng)名貴藥材和珍貴香料（梅文莉等，2013；Chenet al.，2018），可用于消化、呼吸、心腦血管等疾病的治療（Espinozaet al.，2014），也可用于香水、化妝品的制作（Naef，2011）。近年來，由于沉香價格不斷上升以及人為過度采伐，沉香野生資源趨于枯竭。為滿足市場對沉香的需求并保護野生沉香資源，沉香原產(chǎn)國加強了對沉香栽培和結(jié)香技術(shù)的研究（Donovanet al.，2004；van Thanhet al.，2015；Mohamedet al.，2010）。

通常認為，生物或非生物因素脅迫可誘導(dǎo)沉香形成，該過程受寄主樹、微生物和環(huán)境的影響（Tanet al.，2019；Espinozaet al.，2014），各種傷害（物理、化學）或真菌侵染均可作為激發(fā)子誘導(dǎo)土沉香結(jié)香（張爭等，2010）。目前，人工誘導(dǎo)土沉香結(jié)香主要有物理造傷法、化學法和生物法，其中物理造傷和化學、真菌輸液方式被普遍應(yīng)用（Blanchetteet al.，2009），但這些方法存在結(jié)香質(zhì)量不理想、產(chǎn)量不確定等問題，且易引發(fā)樹體腐爛（梅文莉等，2014）。早期研究表明，木材內(nèi)部高濃度CO2有利于黑荊樹（Acacia mearnsii）心材中類黃酮化合物的形成（Carrodus，1971）。Nilsson 等（2002）發(fā)現(xiàn)樹干填充CO2可誘導(dǎo)歐洲赤松（Pinus sylvestris）形成不同于邊材的變色木材，且誘導(dǎo)的變色木材與天然心材成分相近。劉小金（2012）在研究檀香（Santalumalbum）心材發(fā)育時發(fā)現(xiàn)，樹干填充CO2可誘導(dǎo)心材的形成，促進α-檀香醇和β-檀香醇合成，提高精油產(chǎn)率。這些研究均表明，樹體內(nèi)高濃度CO2能夠促進樹木次生代謝物質(zhì)的合成，誘導(dǎo)木材變色；但樹干填充CO2是否能夠誘導(dǎo)土沉香結(jié)香、結(jié)香效果及生理響應(yīng)機制如何未見報道。

鑒于此，本研究以土沉香樹為試驗材料，采用外源CO2填充樹干的方式誘導(dǎo)結(jié)香，檢測木芯抗氧化酶系活性和結(jié)香范圍，評價結(jié)香質(zhì)量，探明CO2誘導(dǎo)土沉香的結(jié)香過程與抗逆防御反應(yīng)，以期為闡明CO2誘導(dǎo)土沉香結(jié)香機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在廣東省惠州市惠陽區(qū)永湖鎮(zhèn)11 年生土沉香人工林中，選取長勢均勻、健康、平均胸徑13.42±0.63 cm和平均樹高5.18±0.79 m 的土沉香樹開展樹干充氣試驗。高壓CO2氣體純度為99.9%。沉香四醇標準品購自Glpbio 公司，純度大于99.5%。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計 采用隨機區(qū)組設(shè)計，設(shè)置4 個處理，即每隔7 天（T1）和15 天（T2）充氣1 次、樹干打孔（CK1）和不作任何處理（CK2）。每小區(qū)處理5 株，重復(fù)4 次，共計140 株。

1.2.2 充氣方法 選擇晴天，在樹干50 cm 高度處沿水平方向鉆直徑1 cm、長9 cm 的小孔，保留一定厚度不鉆透樹干。鋼管纏繞防水薄膜后插入樹孔一定深度，與樹干接口處涂膠密封，鋼管外接橡膠管。將高壓瓶中的CO2氣體通過減壓器減至0.1 MPa 后，經(jīng)橡膠管充入樹孔內(nèi)，充氣量為樹孔和樹體外膠管的體積之和，采用流量計計量填充氣體量。按試驗設(shè)計持續(xù)處理3 個月。

1.3 測定方法

1.3.1 木質(zhì)部組織結(jié)構(gòu)內(nèi)含物觀察 分別在處理前以及處理后7 和10 個月時，用生長錐取充氣孔上方3 cm處木芯，置于FAA 固定液中備用。實驗室內(nèi)，將固定液中的木芯制成2 mm 薄片，掃描電鏡（JSM-6510LV，Japan）下觀察木質(zhì)部組織結(jié)構(gòu)變化并拍照。

1.3.2 木芯變色范圍測定 處理后10 個月時，沿樹干縱向方向，分別在充氣孔上、下方1 cm 處每隔2 cm鉆取木芯，待木芯沒有黑色結(jié)香區(qū)后，依次間隔3 cm鉆取木芯，直到木芯全為白木。在樹干橫截面方向上，分別在充氣孔左、右1 cm 處每隔2 cm 鉆取木芯，直到木芯全為白木。將木芯黑色區(qū)域稱作沉香區(qū)，將含有部分黑色油線的淺褐色區(qū)域稱作過渡區(qū)，分別測其木芯徑向變色深度。每個處理取5 株樹，根據(jù)縱向變色長度和徑向變色深度，利用Image J1.8.0 軟件計算縱切面變色面積。

1.3.3 醇溶性提取物含量測定 處理后7 和10 個月時，在充氣孔上方3 cm 處取5 cm 厚半圓片，將結(jié)香區(qū)（黑色）和過渡區(qū)（淺褐色）剝離開，分別置于40 ℃干燥箱內(nèi)烘干至恒重，樣品粉碎，過40 目篩網(wǎng)。稱取2.00 g 木粉置于具塞離心管中，加入95%乙醇20 mL，在水浴中超聲處理 30 min 后取上清液，重復(fù)操作1 次。合并2 次上清液，過0.45 μm 濾膜，定容至50 mL，待測。將1.5 mL 濾液裝入稱量好的2 mL 離心管中，置于旋轉(zhuǎn)濃縮儀40 ℃下濃縮。待液體揮發(fā)完至恒重，稱量并計算醇溶性提取物含量，每個處理每次隨機取5 株樹，每份提取液重復(fù)測定10 次。

1.3.4 沉香四醇含量測定 采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（Sciex 4000，SCIEX，USA；Sciex 4000 QTRAP?）測定沉香四醇含量。測定條件：色譜柱Kinetex C18（2.1 mm×100 mm，2.6 μm）；流動相水為0.1%甲酸（A）-乙腈（B）；梯度洗脫為0～1 min10%B；1～3.5 min10%～70%B；3.5～4 min70%～95%B；4～5.9 min95%B；5.9～6 min10%B，6～8 min10%B。柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1，進樣量1 μL。配制不同質(zhì)量濃度沉香四醇標準溶液，繪制標準曲線，然后從1.3.3 中取樣品提取液，測定并計算樣品中沉香四醇含量。

1.3.5 抗氧化酶活性測定 充氣開始后第30、60、90、120、150 天，用內(nèi)徑 1 cm 的生長錐在充氣孔上方2 cm處鉆取木芯，錫箔紙包好置于液氮中備用。每小區(qū)、每個處理選取1 株，當天將樣品帶回實驗室，用液氮磨成粉，超低溫冰箱-80 ℃保存。POD、SOD、CAT活性和MDA 含量采用酶聯(lián)免疫分析試劑盒測定，試劑盒由上海酶聯(lián)生物科技有限公司提供。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 采用Excel 軟件進行數(shù)據(jù)處理，利用ImageJ 1.8.0、 SPSS19.0 和Origin2021 軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2 處理前后木質(zhì)部組織結(jié)構(gòu)內(nèi)含物變化

樹干填充CO2處理前，木質(zhì)部導(dǎo)管紋孔、管壁清晰可見，無任何內(nèi)含物（圖1A）；射線薄壁細胞內(nèi)含有許多淀粉粒（圖1B）。處理后7 個月時（以T1 為例），導(dǎo)管已部分堵塞（圖1C），射線薄壁細胞內(nèi)淀粉粒消失，并出現(xiàn)絮狀侵填物富集，但未填滿細胞腔（圖1D）；處理后10 個月時，T1 處理下導(dǎo)管、射線薄壁細胞內(nèi)油脂類物質(zhì)或侵填物大量富集，堵塞面積變大甚至完全堵塞（圖1E、F）。CK1 處理后7 個月時，部分射線薄壁細胞內(nèi)仍可觀察到淀粉粒，僅有少量侵填體（圖1G）；處理后10 個月時，導(dǎo)管內(nèi)可觀察到明顯的內(nèi)含物（圖1H），射線薄壁細胞內(nèi)侵填體數(shù)量增多，出現(xiàn)部分堵塞（圖1I）。由此可見，與CK1 相比，樹干填充CO2可明顯加快射線薄壁細胞內(nèi)淀粉的分解，促進導(dǎo)管和射線薄壁細胞內(nèi)侵填體形成。

圖1 組織結(jié)構(gòu)內(nèi)含物變化Fig.1 The inclusion changes of tissue structure

2.2 變色范圍

2.2.1 縱向變色長度和橫向變色寬度 樹干填充CO2加速土沉香木質(zhì)部縱向、橫向變色。從圖2A 可看出，處理后10 個月時，T1 和T2 處理下沉香區(qū)、過渡區(qū)縱向變色長度差異不顯著，但均顯著高于CK1 處理。T1 處理下沉香區(qū)、過渡區(qū)和縱向變色總長度分別達8.12 cm、18.33 cm 和26.45 cm，是CK1 處理的3.36、3.05 和3.14 倍。不同處理的縱向變色長度均大于橫向變色寬度。橫向變色上（圖2B），T1 處理下充氣孔左、右1 cm 處檢測到黑色結(jié)香區(qū)產(chǎn)生，而T2 和CK1 處理均未發(fā)現(xiàn)。T1 處理下橫向變色總寬度達4.17 cm，分別比T2 和CK1 處理提高32.38%和69.51%?？v向變色總長度和橫向變色總寬度不同處理的高低順序均為T1＞T2＞CK1＞ CK2（不變色）。較高頻次（7天1 次）的樹干填充CO2比低頻次（15 天1 次）處理誘導(dǎo)變色效果更好。

圖2 不同處理木質(zhì)部縱向變色長度與橫向變色寬度Fig.2 Longitudinal discoloration length and horizontal discoloration width in different treatments

2.2.2 徑向變色長度與縱切面變色面積 充氣處理后10 個月時，離充氣孔越近，沉香區(qū)和過渡區(qū)木質(zhì)部徑向變色越深（圖3）。T1 處理下，充氣孔上方1 cm 處，黑色沉香區(qū)徑向變色深度為2.88 cm，分別是T2 和CK1 處理的1.47 和6.95 倍；徑向總變色深度達9.87 cm，分別比T2 和CK1 處理提高25.73%和61.27%?？梢?，較高的充氣頻率有助于誘導(dǎo)土沉香木質(zhì)部徑向變色。

圖3 不同處理縱向、橫向木芯的徑向變色深度Fig.3 Radial discoloration depth of longitudinal and horizontal wood cores in different treatments

樹干填充CO2可增加土沉香變色面積，尤其是縱切面變色面積（表1）。處理后10 個月時T1 和T2 處理縱切面沉香區(qū)、過渡區(qū)和總變色區(qū)面積均顯著高于CK1 處理，其中T1 處理下3 個區(qū)面積均最大，分別是CK1 處理的18.79、2.96 和3.38 倍。T2 處理下3 個區(qū)面積也顯著高于CK1 處理，分別是CK1 處理的11.9、2.15 和2.41 倍。

表1 不同處理10 個月時縱切面變色面積①Tab.1 The discoloration areas in different treatments

2.3 醇溶性提取物含量

填充CO2可提高樹干木質(zhì)部沉香區(qū)和過渡區(qū)醇溶性提取物含量，且沉香區(qū)高于過渡區(qū)。處理后7 個月時，T1 處理下沉香區(qū)醇溶性提取物含量達19.87%（表2），分別是T2、CK1、CK2 處理的1.26、1.43 和5.24 倍；T2 處理下醇溶性提取物含量也明顯高于CK1 和CK2 處理。隨誘導(dǎo)時間增長，沉香區(qū)中醇溶性提取物含量逐漸增加，T1 處理后10 個月時，醇溶性提取物含量達21.27%，比T2、CK1 處理分別提高25.41%和42.08%，與處理后7 個月時相比提高7.05%。過渡區(qū)中，T1 處理下醇溶性提取物含量仍顯著高于其他3 個處理，但與處理后7 個月時相比顯著下降4.28%。

表2 不同處理土沉香醇溶性提取物含量①Tab.2 The content of alcohol soluble extraction in different treatments

2.4 沉香區(qū)沉香四醇含量

處理后7 個月時，T1 處理下結(jié)香區(qū)中沉香四醇含量達0.12%，分別是T2、CK1 處理的1.24 和2.14 倍；T2 處理下結(jié)香區(qū)中沉香四醇含量比CK1 處理高72.30%。隨誘導(dǎo)時間增長，各處理沉香四醇含量顯著上升（圖4）。處理后10 個月時，T1 處理下沉香四醇含量達0.29%，分別是T2、CK1 處理的1.26 和2.11 倍，是處理后7 個月時沉香四醇含量的2.50 倍。T2 處理下沉香四醇含量也比CK1 處理高67.96%，而CK2 處理均未檢測到沉香四醇。總之，樹干填充CO2可誘導(dǎo)土沉香產(chǎn)生沉香四醇，其結(jié)香區(qū)含量遠高于《中國藥典》規(guī)定的0.1%含量標準（中華人民共和國藥典委員會，2015）。

圖4 不同處理下沉香四醇含量Fig.4 The content of agarotetrol in different treatments

2.5 抗氧化酶POD、SOD、CAT 活性及MDA 含量變化

樹干填充CO2后，不同誘導(dǎo)時間下土沉香木芯中抗氧化酶POD、SOD、CAT 活性不同。以T1 處理為例，T1 處理土沉香木芯中POD 活性隨誘導(dǎo)時間增長先升高后下降，第60 天時達到最大值，分別比CK1、CK2 處理高6.87%和11.07%，隨后活性逐漸下降，到第150 天時降至最低值，但仍比CK2 處理高8.92%。CK1 處理后POD 活性整體呈下降趨勢，但波動性較大；第30 天時POD 活性達最大值，比CK2 處理高15.90%，第150 天時活性最低，與CK2 處理無明顯差異。T1 處理后SOD 活性先下降后升高，第90 天時SOD 活性最低，比CK2 處理低9.98%，隨后活性逐漸升高，第120 天時SOD 活性略高于CK2 處理。CK1處理第30 天SOD 活性明顯低于CK2 處理，隨后緩慢上升，第150 天時SOD 活性仍比CK2 處理低7.75%。T1 處理后木芯CAT 活性也呈先升高后降低的變化趨勢，處理后第60 天時達到相對峰值，活性比CK1 和CK2 處理分別高7.40%和4.53%，隨后活性逐漸下降，第120 天后趨于CK2 處理水平。如圖5 所示，充氣處理后木芯MDA 含量先降低后升高，第90 天時MDA含量最低，分別比CK2、CK1 處理低10.32%和12.99%，隨后逐漸升高，第120～150 天MDA 含量與CK2 處理基本持平。而CK1 處理后第30～150 天CAT 活性和MDA 含量與CK2 處理均無顯著差異。

圖5 不同處理對POD、SOD、CAT 活性和MDA 含量的影響Fig.5 Effect of different treatments on POD, SOD, CAT activity and the content of MDA

3 討論

3.1 外源CO2 對土沉香結(jié)香的影響

3.1.1 沉香的形成及質(zhì)量 傳統(tǒng)物理造傷法誘導(dǎo)結(jié)香距離短、質(zhì)量低、產(chǎn)量不確定（梅文莉等，2014），采用現(xiàn)代液體輸入法易引發(fā)部分組織壞死，產(chǎn)生腐爛組織（Tanet al.，2019），形成薄片狀結(jié)香（張爭等，2010）。本研究中，樹干填充CO2誘導(dǎo)7 個月后檢測發(fā)現(xiàn)土沉香木質(zhì)部縱向、橫向和徑向變色長度及面積逐漸增大，結(jié)香區(qū)呈塊狀、無明顯腐爛現(xiàn)象，且醇溶性提取物和沉香四醇含量較高。隨著誘導(dǎo)時間增長，土沉香結(jié)香部位次生代謝物持續(xù)積累，過渡區(qū)逐漸轉(zhuǎn)化為沉香區(qū)的同時伴隨新過渡區(qū)形成，這是沉香區(qū)面積不斷擴大、醇溶性提取物含量始終明顯高于過渡區(qū)的主要原因。由此可推測，在一定范圍內(nèi)增加充氣次數(shù)和延長充氣時間，可進一步提高結(jié)香質(zhì)量、擴大結(jié)香面積，對此有待進一步驗證。

3.1.2 結(jié)香時間 研究發(fā)現(xiàn)，采用全樹輸液后20 個月時2 種化學誘導(dǎo)沉香樣品的醇溶性提取物平均含量分別為19.65%和22.13%（Zhanget al.，2012）。本研究中，樹干每隔7 天填充1 次CO2、持續(xù)填充3 個月，而后誘導(dǎo)10 個月時沉香（結(jié)香區(qū)）的醇溶性提取物含量達21.27%。由此可見，樹干填充CO2可縮短土沉香結(jié)香時間。人工誘導(dǎo)結(jié)香過程中脅迫處理強度往往直接影響結(jié)香時間，每隔7 天填充1 次CO2處理的結(jié)香效果明顯好于每隔15 天1 次處理CO2，這說明適當提高充氣頻率可縮短結(jié)香時間。

本研究中，充氣處理后10 個月的過渡區(qū)醇溶性提取物含量均低于7 個月，這與過渡區(qū)轉(zhuǎn)化為結(jié)香區(qū)的同時新過渡區(qū)的次生代謝物積累相對滯后有關(guān)，也可能是由于過渡區(qū)的擴展速度大于結(jié)香區(qū)的沉香形成速度，從而導(dǎo)致次生代謝物質(zhì)含量相對降低。另外因沉香中萜烯類和色酮類化合物種類豐富，各類物質(zhì)的合成代謝途徑差異較大，生成時間也不同（Liet al.，2021），表明沉香物質(zhì)形成具有復(fù)雜性和時序性。次生代謝物的合成與積累往往決定人工誘導(dǎo)沉香的最終產(chǎn)量和質(zhì)量，而樹干填充CO2誘導(dǎo)促進沉香物質(zhì)形成的時序性有待深入研究。

3.2 外源CO2 對土沉香抗逆防御反應(yīng)的影響

Peng 等（2014）指出，沉香樹脂在沉香體內(nèi)的積累在防御系統(tǒng)區(qū)隔化過程中具有重要作用。樹干填充CO2后，土沉香木質(zhì)部導(dǎo)管和射線薄壁細胞內(nèi)快速形成油脂和侵填體，說明CO2可激發(fā)土沉香木質(zhì)部組織結(jié)構(gòu)的抗性響應(yīng)，這與張興麗（2013）采用半斷干法傷害誘導(dǎo)下土沉香射線薄壁細胞內(nèi)含物變化與沉香形成有關(guān)的結(jié)果相一致。

通常，植物通過酶促和非酶促抗氧化防御系統(tǒng)清除活性氧（Khanet al.，2014），POD、SOD、CAT 是植物體內(nèi)活性氧清除酶系統(tǒng)的重要組成（張星雨等，2021；Huanget al.，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，樹干填充CO2可明顯提升POD、CAT 活性，處理后第120 天時活性仍高于CK2 處理。SOD 是清除ROS 的第一道防線（Kar，2011；Fanet al.，2011），本研究中SOD 活性在CO2填充90 天內(nèi)持續(xù)下降，可能是因為CO2持續(xù)填充誘導(dǎo)超氧陰離子不斷迸發(fā)，導(dǎo)致SOD 相對過量消耗或在一定程度上抑制SOD 活性。植物細胞在逆境脅迫（如鹽脅迫、干旱等）下超過其所能忍受的活性氧水平閾值，抗氧化酶活性會受到抑制（朱金方等，2015；Milleret al.，2010）。活性氧迸發(fā)可作為第二信使調(diào)控下游信號激活植物防御反應(yīng)以增強抵抗外界脅迫的能力（Mittleret al.，2004），是植物抗逆防御反應(yīng)啟動的關(guān)鍵調(diào)控因素（Youet al.，2015）。持續(xù)填充CO2是否誘導(dǎo)活性氧不斷迸發(fā)從而啟動下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程、激活防御反應(yīng)，對此有待進一步研究。樹干填充CO2后MDA 含量持續(xù)下降，第120～150 天與CK2 處理持平，說明土沉香體內(nèi)抗氧化系統(tǒng)可及時清除自由基，較好維持活性氧代謝的動態(tài)平衡，避免自由基引發(fā)的脂質(zhì)過氧化損傷（Gillet al.，2010；Milleret al.，2010）。CK1處理第30～150 天CAT 活性和MDA 含量與空白（CK2）無明顯差異，第60 天POD 活性開始與CK2 處理基本持平，說明打孔處理引發(fā)的脅迫傷害較小，防御反應(yīng)波動時間較短。

綜上所述，土沉香是一種典型的傷害誘導(dǎo)型藥用植物（Liuet al.，2013），通過比較T1 和CK1 處理下抗氧化酶活性和MDA 含量的動態(tài)變化，可知高頻率樹干填充CO2能夠不斷激發(fā)土沉香的抗逆防御反應(yīng)，土沉香結(jié)香效果與防御反應(yīng)持續(xù)時間正相關(guān)，然而可持續(xù)激發(fā)土沉香防御反應(yīng)的物質(zhì)或方法有待進一步研究。本研究結(jié)果表明樹干填充CO2可顯著誘導(dǎo)土沉香結(jié)香，但參與該結(jié)香過程的代謝通路及內(nèi)在機制還需深入研究。

4 結(jié)論

1） 外源CO2可顯著促進木質(zhì)部射線薄壁細胞內(nèi)淀粉的轉(zhuǎn)化，增大導(dǎo)管和射線薄壁細胞內(nèi)侵填體堵塞面積。

2） 外源CO2可誘導(dǎo)土沉香木質(zhì)部變色，隨誘導(dǎo)時間增長，樹干木質(zhì)部縱向、橫向和徑向變色長度增長，縱向變色面積增加。

3） 外源CO2可誘導(dǎo)土沉香形成沉香塊且質(zhì)地細膩，最優(yōu)處理后10 個月時的醇溶性提取物含量達21.27%，沉香四醇含量達0.29%，分別是打孔對照的1.42 倍和2.11 倍。

4） 外源CO2可在短期內(nèi)誘導(dǎo)POD、CAT 抗氧化酶活性升高，降低MDA 含量，激活土沉香樹體的抗逆防御反應(yīng)。