張憲基 汪宗保 王科文 李 鑫 李德坤 單自亮 姚長(zhǎng)風(fēng)

（安徽中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，安徽合肥 230038）

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是一種在中老年人群中常見(jiàn)的退行性關(guān)節(jié)疾病，主要臨床表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)的疼痛、腫脹、僵硬、活動(dòng)受限等[1]。流行病學(xué)研究顯示，全球約有6.5億人受到KOA的影響，其中年齡在40歲以上者約占22.9%[2]。KOA引起的膝關(guān)節(jié)不穩(wěn)定對(duì)患者的日常生活造成了極大不便。因此，探索科學(xué)、有效、多樣的KOA治療方案并研究其具體作用機(jī)制顯得尤為重要。

臨床研究表明，艾灸可有效降低KOA患者體內(nèi)炎性因子水平并改善患者的臨床癥狀與膝關(guān)節(jié)功能狀況[3]。有實(shí)驗(yàn)顯示，不同產(chǎn)地和存儲(chǔ)期限灸材均可有效降低KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度、軟骨組織細(xì)胞病變程度和曼金（Mankin's）評(píng)分[4]。明代《針灸大成》記載：“犢鼻，主膝中痛不仁”，一項(xiàng)對(duì)近20年臨床針灸治療KOA文獻(xiàn)的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)分析也發(fā)現(xiàn)，犢鼻是臨床治療KOA選穴中最核心的腧穴[5]。目前研究發(fā)現(xiàn)，影響KOA發(fā)生和發(fā)展的信號(hào)通路有十余條，其中Wnt信號(hào)通路是與炎性反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)通路之一[6]。Wnt/β-連環(huán)蛋白（Wnt/β-catenin）信號(hào)通路在骨骼、軟骨及滑膜組織中起著直接調(diào)節(jié)作用，在軟骨細(xì)胞的不同生長(zhǎng)階段均發(fā)揮重要調(diào)控作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖并抑制其細(xì)胞凋亡[8]。本研究制作KOA兔模型，并予艾灸犢鼻穴干預(yù)，觀察其干預(yù)效果，并從Wnt/β-catenin信號(hào)通路角度探討艾灸犢鼻穴治療KOA的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性普通級(jí)新西蘭兔24只，3月齡，體質(zhì)量2.2～2.5 kg，購(gòu)自邳州市東方養(yǎng)殖有限公司，合格證號(hào)：SCXK蘇20170002。兔分籠飼養(yǎng)，室溫24℃，飲食自由。本實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處理均符合國(guó)家科學(xué)技術(shù)部頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》，且經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)（AHUCM-rabbits-2022056）。

1.2 主要試劑 木瓜蛋白酶（批號(hào)：517S021，北京索萊寶科技有限公司）；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）試劑盒（批號(hào)：GR20220119，武漢基因美生物科技有限公司）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)：GR20220426，武漢基因美生物科技有限公司）；總RNA提取試劑盒（批號(hào)：3505080，美國(guó)生命技術(shù)公司）；熒光染料（批號(hào)：05229413，蘇州近岸蛋白質(zhì)科技股份有限公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：AL21115A，北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）；RIPA細(xì)胞裂解液（批號(hào)：09271919023，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；PAGE膠促凝劑（批號(hào)：1020F024，北京索萊寶科技有限公司）；PBS緩沖液粉末（批號(hào)：19022401，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；PVDF膜（批號(hào)：R7SA9081E，美國(guó)密理博公司）；山羊抗兔IgG（批號(hào)：20270051，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；蘇木素染液（批號(hào)：09232110，安徽欣樂(lè)生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要儀器 JW3021HR離心機(jī)（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；DNP-9052BS-Ⅲ電熱恒溫箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司）；YB-7LF生物組織包埋機(jī)（湖北孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；PIKOREAL 96熒光定量PCR儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；EPS300電泳儀（上海天能科技有限公司）；VE-180電泳槽（上海天能科技有限公司）；VE-186轉(zhuǎn)膜儀（上海天能科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組與造模 24只兔隨機(jī)分為正常組、模型組、艾灸組，每組8只。采用木瓜蛋白酶水溶液膝關(guān)節(jié)腔注射的方式制作KOA模型，于實(shí)驗(yàn)開(kāi)始的第1、4、7天向模型組和艾灸組兔右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射2%木瓜蛋白酶水溶液0.5 mL，并于首次藥物注射后第14天對(duì)造模兔右膝關(guān)節(jié)進(jìn)行膝骨性關(guān)節(jié)病病情程度指數(shù)（Lequesne MG）評(píng)級(jí)，總分大于4分即為造模成功[9]。模型組、艾灸組所有兔均造模成功。

2.2 干預(yù)方法 造模成功后，即首次藥物注射后第15天開(kāi)始，艾灸組懸灸兔右膝“犢鼻”穴，穴位定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[10]，艾條距兔皮膚約3～5 cm，20 min/次，每日1次，連續(xù)艾灸21 d。空白組、模型組正常飼養(yǎng)，不作其他任何處理。

2.3 樣本采集 干預(yù)結(jié)束后次日，各組兔麻醉，心臟采血取動(dòng)脈血5 mL，靜置，離心分離血清，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆糜诿嘎?lián)免疫吸附（ELISA）試驗(yàn)。取各組兔右膝關(guān)節(jié)股骨端軟骨，經(jīng)固定、脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋、切片等操作后備用于蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化染色使用。取各組兔右膝關(guān)節(jié)脛骨平臺(tái)軟組織，置于液氮中，轉(zhuǎn)入-80℃超低溫保存以備用于實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（quantitative Real-time PCR，qPCR）法、蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)使用。

2.4 指標(biāo)檢測(cè)

2.4.1 ELISA法 測(cè) 定 兔 血 清 中IL-1β、TNF-α含量 取-80℃保存?zhèn)溆玫母鹘M兔血清，按照ELISA試劑盒檢測(cè)說(shuō)明書(shū)，在樣品孔和標(biāo)準(zhǔn)孔分別加入血清和標(biāo)準(zhǔn)品各50 μL，于各孔再加入50 μL酶標(biāo)記抗體，封好后放置于37℃恒溫箱中反應(yīng)30 min；反應(yīng)結(jié)束后，充分棄盡液體，洗滌液清洗，并扣干；在各孔中加入顯色試劑，37℃避光反應(yīng)10 min；各孔加入終止液50 μL，終止顯色；使用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔的吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，計(jì)算各組兔血清中IL-1β、TNF-α水平。

2.4.2 HE染色法觀察兔膝關(guān)節(jié)軟骨病理形態(tài) 取各組兔右膝關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片，置入干燥箱66 ℃烤片20～30 min，常規(guī)脫蠟復(fù)水，蘇木素染液染色2～5 min，1%鹽酸酒精分化，飽和碳酸鋰溶液藍(lán)化，95%乙醇脫水2 min，伊紅染液染色，常規(guī)脫水透明，樹(shù)膠封片，顯微鏡觀察結(jié)果。

2.4.3 qPCR法檢測(cè)兔軟骨組織中Wnt信號(hào)蛋白-3α（Wnt3α）、β-catenin、基質(zhì)金屬蛋白酶-13（MMP-13）mRNA表達(dá) 取-80 ℃凍存的各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，采用Trizol法提取軟骨組織的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA。用RT-PCR進(jìn)行PCR反應(yīng)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作內(nèi)參基因，引物序列見(jiàn)表1。2-△△Ct計(jì)算各指標(biāo)mRNA的相對(duì)表達(dá)量，△△Ct=（Ct實(shí)驗(yàn)組目的基因-Ct實(shí)驗(yàn)組內(nèi)參）-（Ct對(duì)照組目的基因-Ct對(duì)照組內(nèi)參）。

表1 引物序列

2.4.4 Western blot法檢測(cè)兔軟骨組織中Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白表達(dá)取-80 ℃凍 存的各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織，加入RIPA裂解液裂解，12 000×g離心15 min，收集上清液；配制凝膠，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，室溫封閉2 h；加一抗，4℃孵育過(guò)夜，洗滌液（PBST）洗滌；加二抗，室溫孵育1.2 h，洗滌液洗滌；通過(guò)ECL發(fā)光試劑盒檢測(cè)蛋白，使用Image J軟件進(jìn)行膠片條帶分析，計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2.4.5 免疫組化法檢測(cè)兔軟骨組織中IL-1β、TNF-α的表達(dá) 取各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織石蠟切片置入干燥箱，66 ℃烤片20～30 min，常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，緩沖液封閉；加一抗，37 ℃孵育60 min，PBS-T沖洗；加二抗，37 ℃孵育30 min，PBS-T沖洗；DAB顯色，復(fù)染，脫水透明，封片，顯微鏡下采集數(shù)據(jù)及圖片。用IPP 6.0軟件分析樣本中TNF-α、IL-1β的積分光密度（integral optical density，IOD）值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 25.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。本研究所有數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 各組兔血清IL-1β、TNF-α水平比較 模型組兔血清IL-1β、TNF-α水平顯著高于正常組（P＜0.05），艾灸組兔血清IL-1β、TNF-α水平明顯低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組兔血清IL-1β、TNF-α水平比較（x-±s） 單位：pg/mL

3.2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理形態(tài)比較 HE染色結(jié)果顯示，正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑平整，軟骨結(jié)構(gòu)清晰，軟骨細(xì)胞數(shù)目多、形態(tài)自然且分布均勻，基質(zhì)染色均勻，細(xì)胞排列整齊，潮線識(shí)別度清晰，軟骨內(nèi)未見(jiàn)血管、神經(jīng)及纖維增生。模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙不平，軟骨結(jié)構(gòu)紊亂，軟骨細(xì)胞數(shù)目少且分布紊亂、形態(tài)異常，潮線不可見(jiàn)。艾灸組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面局部表現(xiàn)粗糙，軟骨結(jié)構(gòu)較為完整，軟骨細(xì)胞數(shù)目較多且分布較均勻、形態(tài)較為正常，潮線模糊可見(jiàn)。見(jiàn)圖1。

3.3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較 模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著高于正常組（P＜0.05），艾灸組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量均顯著低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Wnt3α、β-catenin、MMP-13 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（x-±s）

3.4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量比較 模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于正常組（P＜0.05）；艾灸組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織上述蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2、表4。

圖2 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白電泳圖

表4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt3α、β-catenin、MMP-13蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（x-±s）

3.5 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)比較 免疫組化結(jié)果顯示，正常組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面完整，軟骨組織中幾乎未見(jiàn)棕色顆粒，即IL-1β、TNF-α蛋白呈弱陽(yáng)性表達(dá)。模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙，棕色顆粒較多，即IL-1β、TNF-α蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。艾灸組兔膝關(guān)節(jié)軟骨表面較平滑，棕色顆粒相對(duì)較少，即IL-1β、TNF-α蛋白呈中等陽(yáng)性表達(dá)。見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β免疫組化表達(dá)（×200）

圖4 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織TNF-α免疫組化表達(dá)（×200）

各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織TNF-α、IL-1β蛋白表達(dá)IOD值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：模型組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)顯著高于正常組（P＜0.05），艾灸組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)顯著低于模型組（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表5 各組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織IL-1β、TNF-α蛋白表達(dá)（IOD值）比較（x-±s）

4 討論

骨科臨床的常見(jiàn)疾病KOA主要由外傷、肥胖和慢性勞損等因素引起，其病理生理表現(xiàn)主要體現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變和繼發(fā)性的骨質(zhì)疏松[6]。隨著人口老齡化現(xiàn)象不斷加劇以及KOA發(fā)病呈年輕化趨勢(shì)，KOA的發(fā)病率逐年上升[1]。目前，KOA主要采用藥物治療，并輔以膝關(guān)節(jié)鍛煉，以提升患肢肌力與膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，改善膝關(guān)節(jié)的穩(wěn)定性[11]。但是，非甾體類抗炎藥和止痛藥等易導(dǎo)致胃腸道不良反應(yīng)，導(dǎo)致患者依從性差[12]。因此，尋找科學(xué)有效治療KOA的方法變得十分迫切。

KOA可歸屬于中醫(yī)學(xué)“痹證”范疇，《素問(wèn)·痹論》曰：“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”，可見(jiàn)痹證與風(fēng)寒濕三邪密切相關(guān)。艾灸是一種將艾絨點(diǎn)燃后置于腧穴或特定部位，利用其燃燒后所產(chǎn)生的揮發(fā)物和熱量透過(guò)皮膚組織，通過(guò)經(jīng)絡(luò)傳入機(jī)體，作用于機(jī)體的過(guò)程，可溫經(jīng)通絡(luò)、活血通痹，不僅安全性高、價(jià)格低廉，還具有操作簡(jiǎn)便、副作用少等優(yōu)點(diǎn)，故艾灸也被廣泛應(yīng)用于KOA的治療之中。研究表明，艾絨燃燒時(shí)具有熱輻射和遠(yuǎn)紅外輻射效應(yīng)，可改善血液循環(huán)并通過(guò)紅外輻射共振作用使異常細(xì)胞產(chǎn)生共振，從而活化組織細(xì)胞，改善組織代謝環(huán)境[13]。本研究選用的犢鼻穴歸屬多氣多血的足陽(yáng)明胃經(jīng)，位于髕韌帶外側(cè)凹陷中，具有祛風(fēng)散寒、通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛的作用。膝關(guān)節(jié)處皮膚薄，皮下組織少，股動(dòng)脈、腘動(dòng)脈、脛前動(dòng)脈、股深動(dòng)脈等分支在此處構(gòu)成動(dòng)脈網(wǎng)，為膝關(guān)節(jié)周圍組織提供豐富的血供。艾灸通過(guò)上述兩個(gè)效應(yīng)可促進(jìn)膝關(guān)節(jié)動(dòng)脈網(wǎng)功能的恢復(fù)，從而改善周圍組織代謝平衡，延緩軟骨破壞和KOA進(jìn)展。

研究證實(shí)，關(guān)節(jié)軟骨是沒(méi)有血管和神經(jīng)的結(jié)締組織，由軟骨細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）組成[14]，其中ECM的主要成分為Ⅱ型膠原蛋白和聚蛋白多糖。KOA患者軟骨退變的病理變化主要是由于膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖與凋亡之間平衡失調(diào)、軟骨基質(zhì)過(guò)度降解等導(dǎo)致的[15]。TNF-α、IL-1β是常見(jiàn)且重要的炎性因子，共同參與了軟骨細(xì)胞和軟骨基質(zhì)的破壞，均能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的早期凋亡[16]。兩者在KOA患者的軟骨中均存在過(guò)度表達(dá)的現(xiàn)象，且兩者在KOA患者血清和關(guān)節(jié)滑液中含量均明顯升高，其含量與病情嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[16-18]。本研究結(jié)果顯示，艾灸組兔血清及膝關(guān)節(jié)軟骨中IL-1β、TNF-α表達(dá)均明顯低于模型組，說(shuō)明艾灸可緩解KOA兔的關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)。

在關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中Wnt/β-catenin信號(hào)通路會(huì)異常激活，從而導(dǎo)致ECM降解和軟骨細(xì)胞凋亡等發(fā)生[19]。Wnt信號(hào)激活后，會(huì)與其受體相結(jié)合并活化信號(hào)蛋白，從而抑制β-catenin的泛素化和降解，β-catenin分泌因此增加，Wnt進(jìn)而與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而激活基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）等下游基因的表達(dá)，促使軟骨破壞[20]。

β-catenin作為具有轉(zhuǎn)運(yùn)功能的Wnt信號(hào)通路下游因子，在軟骨細(xì)胞的分化、增殖和凋亡中起著重要作用。研究證實(shí)，KOA患者關(guān)節(jié)液和血清中β-catenin表達(dá)水平升高，并與病情程度呈正相關(guān)[21]。而Wnt3α在OA的發(fā)展中也同樣起著重要的作用，可作為監(jiān)測(cè)OA病程的指標(biāo)[22]。MMP-13則是MMPs家族中的一員，參與了軟骨細(xì)胞、蛋白多糖、膠原蛋白的降解過(guò)程，ECM由此受到破壞且其正常合成被抑制，使關(guān)節(jié)軟骨腫脹，抗外力能力下降，促使軟骨退行性改變，阻止軟骨修復(fù)，并推動(dòng)OA的發(fā)生發(fā)展[23]。研究表明，在KOA患者關(guān)節(jié)液、血液和軟骨中MMP-13表達(dá)量均異常升高，同時(shí)也表明關(guān)節(jié)液中MMPs的表達(dá)水平可作為間接判斷患者軟骨組織病變程度的指標(biāo)之一[24]。本研究結(jié)果顯示，艾灸組兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt-3α、β-catenin、MMP-13 mRNA及蛋白的表達(dá)均明顯低于模型組，且軟骨表面較平滑，軟骨組織結(jié)構(gòu)相對(duì)完整、清晰，軟骨細(xì)胞數(shù)目相對(duì)較多，形態(tài)較正常且分布較均勻，提示艾灸可能通過(guò)對(duì)KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨中Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵因子表達(dá)的抑制作用以延緩KOA兔軟骨破壞進(jìn)展。

綜上，艾灸能夠改善KOA兔膝關(guān)節(jié)軟骨破壞，抑制血清及軟骨中IL-1β、TNF-α等炎性因子的表達(dá)，下調(diào)軟骨中Wnt-3α、β-catenin、MMP-13 mRNA及蛋白的表達(dá)，從而達(dá)到延緩KOA進(jìn)展的目的，說(shuō)明艾灸可能通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路從而發(fā)揮治療KOA的作用。下一步擬通過(guò)檢測(cè)關(guān)節(jié)液、滑膜中相關(guān)因子的表達(dá)以進(jìn)一步探究艾灸改善KOA的機(jī)制研究。同時(shí)，艾灸具有熱效應(yīng)、輻射效應(yīng)、揮發(fā)物效應(yīng)等多效應(yīng)的治療特點(diǎn)，今后可進(jìn)一步探討艾灸在改善KOA中具體發(fā)揮效應(yīng)及具體有效成分的占比，為研發(fā)出新型艾灸產(chǎn)品提供理論基礎(chǔ)。