趙 強 王 希 趙 容 陳小妹 梁重鋒 譚善忠

（南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院，江蘇南京 210003）

慢加急性肝衰竭（acute on chronic liver failure，ACLF）是在慢性肝病（如慢性乙型肝炎病毒感染或酒精性肝炎）基礎上因急性肝代謝失調(diào)導致的一種危急癥候群，易發(fā)生多器官功能衰竭[1]。ACLF發(fā)病迅速，病情較為嚴重，且并發(fā)癥較多，具有極高的死亡率。ACLF發(fā)生發(fā)展過程中，外周血中性粒細胞百分比增加，但其吞噬功能卻顯著降低，形成中性粒細胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps，NETs）的能力增強，此現(xiàn)象在預后不良的ACLF患者中尤為明顯[2]。NETs是以DNA為骨架，嵌有各種殺菌蛋白如組蛋白Histone H3的網(wǎng)狀結構，Histone H3是真核生物體細胞中的一種堿性蛋白質(zhì)組分，其和DNA共同組成核小體結構，在DNA修復、復制和維持染色體穩(wěn)定性中發(fā)揮核心作用[3]，而NETs的過度生成是造成肝臟損傷的重要原因[4]。

近年來，中醫(yī)藥治療ACLF的臨床研究日益增多，中西醫(yī)結合治療方案在改善ACLF患者臨床癥狀，促進肝功能恢復，提高生存率等方面優(yōu)勢漸顯[5]。筆者團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎（以下簡稱乙肝）病毒相關慢加急性肝衰竭（HBV-ACLF）以正虛為主要病機特點，在內(nèi)科綜合用藥基礎上加用具有補氣健脾、利濕退黃功效的益氣健脾方能明顯減輕該類患者肝損傷程度，且能提升外周血淋巴細胞百分比以恢復免疫功能，進而改善預后[6]。本研究在前期研究基礎上進一步觀察了聯(lián)合用藥對HBV-ACLF肝郁脾虛證患者總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平、凝血酶原活動度（prothrombin time activity，PTA）及中性粒細胞百分比等的影響，并基于中性粒細胞功能調(diào)控探索益氣健脾方的藥理作用機制，現(xiàn)報道如下。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2016年4月至2022年12月在南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院中西醫(yī)結合肝病科收治的基礎病變?yōu)槁砸腋位蚋斡不冶鏋楦斡羝⑻撟C的ACLF患者65例，按隨機數(shù)字表法隨機分為治療組31例與對照組34例。治療組男21例，女10例；年齡44～69歲，平均年齡（52.43±13.92）歲；平均病程（16.32±4.40）d。對照組男22例，女12例；年齡37～60歲，平均年齡（50.84±12.31）歲；平均病程（15.58±5.81）d。2組患者性別、年齡、病程等一般資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院倫理委員會批準（批號：2015-ly-ky030，2017-ly-kt015）。

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫(yī)診斷標準 參照《乙型肝炎相關慢加急性肝衰竭診斷與預后評估的中國標準》[7]中HBVACLF的診斷標準制定：極度乏力，并有明顯厭食、嘔吐和腹脹等嚴重消化道癥狀；黃疸進行性加深，TBIL≥171 μmol/L或每日上升≥17.1 μmol/L；有出血傾向，30%＜PTA≤40%，或1.5＜國際標準化比值（INR）＜1.9；排除肝性腦病或其他并發(fā)癥。

1.2.2 中醫(yī)辨證標準 參照《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準（2017年版）》[8]擬定HBV-ACLF肝郁脾虛證辨證標準：脅肋脹痛，腹脹或便溏，情志抑郁，身倦乏力，舌質(zhì)淡有齒痕、苔白或白膩，脈弦細。

1.3 納入標準 符合HBV-ACLF西醫(yī)診斷標準及肝郁脾虛證中醫(yī)辨證標準；年齡18～70歲，男女不限；半年內(nèi)未使用免疫抑制劑；自愿參加本研究，并簽署知情同意書。

1.4 排除標準 急性肝衰竭、亞急性肝衰竭，或B超/CT等影像檢查提示有肝癌者；有明顯腹水、消化道及其他器官出血傾向者；肝腎綜合征、肝性腦病者；細菌或真菌感染者；妊娠或哺乳期婦女；有精神疾病者。

2 治療方法

2.1 對照組 予內(nèi)科綜合用藥：丁二磺酸腺苷蛋氨酸（浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號82302041A，規(guī)格0.5 g/支），2.0 g/d，靜脈滴注；異甘草酸鎂注射液（正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，批號221212104，規(guī)格50 mg/支），200 mg/d，靜脈滴注；HBV-DNA陽性者予恩替卡韋（北京百奧藥業(yè)有限責任公司，批號A25421210，規(guī)格0.5 mg/片），0.5 mg/d，口服。

2.2 治療組 在對照組治療基礎上加用中藥湯劑益氣健脾方口服，基本方藥物組成：炙黃芪30 g，太子參30 g，炒白術30 g，陳皮10 g，當歸10 g，茯苓10 g，酒女貞子10 g，酒黃芩10 g，炙甘草3 g。隨證加減：濕偏重者，加茵陳30 g、生大黃10 g、虎杖15 g；熱偏重者，加金錢草30 g、赤芍15 g、梔子8 g。中藥湯劑由南京中醫(yī)藥大學附屬南京醫(yī)院中藥房提供。每日1劑，水煎200 mL，分早晚飯后溫服。

2組均連續(xù)治療4周。

3 療效觀察

3.1 觀察指標

3.1.1 肝功能指標和中性粒細胞百分比 于治療前和治療2周、4周后采集2組患者晨起空腹靜脈血5 mL，采用全自動生化分析儀（雅培，型號：C8000）檢測TBIL、PTA水平；采用血細胞分析儀（Mindray，型號：BC-20）檢測中性粒細胞百分比。

3.1.2 中性粒細胞Histone H3蛋白水平 于治療前隨機提取6例患者（治療組、對照組各3例）晨起空腹靜脈血中性粒細胞樣本，參考前期研究方法[9]，使用濃度分別為0.1、0.2、0.4 mg/mL的益氣健脾方藥液對中性粒細胞樣本進行培養(yǎng)。前期研究表明，濃度在0.8 mg/mL以上的益氣健脾方藥液會對細胞產(chǎn)生毒性，因此本研究所選濃度在安全范圍[9]。將中性粒細胞樣本隨機分為4組，分別為益氣健脾方低、中、高劑量組和空白對照組，每組樣本數(shù)為3，加相應濃度的益氣健脾方藥液和生理鹽水培養(yǎng)24 h后，采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法檢測各組中性粒細胞Histone H3蛋白水平。運用Image Lab 6.0.1軟件分析條帶灰度值。

3.2 療效判定標準 治療4周后判定2組患者臨床療效，療效標準參考《中藥新藥臨床研究指導原則（試行）》[10]擬定。臨床治愈：癥狀消失或基本消失，肝功能指標正?；蜉p微異常（TBIL≤34 μmol/L或PTA≥40%）；顯效：癥狀明顯減輕，肝功能指標明顯好轉(zhuǎn)（TBIL較治療前下降50%以上或PTA較治療前提高50%以上），且穩(wěn)定在2周以上，無明顯波動者；有效：癥狀有所改善，肝功能有所好轉(zhuǎn)（TBIL較治療前下降25%以上，或PTA較治療前提高25%以上），且穩(wěn)定在2周以上，無明顯波動者；無效：癥狀無改善，TBIL、PTA無恢復甚至加重，或病情繼續(xù)惡化?？傆行剩?）=[（臨床治愈例數(shù)+顯效例數(shù)+有效例數(shù)）/總例數(shù)]×100%。

3.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 26.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。本研究計量資料均符合正態(tài)分布，用均值±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，組內(nèi)比較采用單因素方差分析。計數(shù)資料以例或百分比表示，率的比較采用Fisher確切概率法檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3.4 治療結果

3.4.1 2組患者臨床療效比較 治療后治療組臨床總有效率為67.74%，對照組為52.94%，組間比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 治療組與對照組患者臨床療效比較

3.4.2 2組患者治療前及治療2周、4周后中性粒細胞百分比、肝功能指標比較 治療前2組患者TBIL水平、PTA、中性粒細胞百分比比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。治療2周后，治療組患者TBIL較治療前改變并不明顯，對照組反而有上升趨勢。治療4周后，治療組患者TBIL水平較本組治療前、本組治療2周后明顯降低（P＜0.05），也明顯低于同期對照組（P＜0.05）；而對照組TBIL水平明顯低于本組治療2周后（P＜0.05）。治療2周后，治療組患者PTA較本組治療前明顯升高（P＜0.05），也顯著高于同期對照組（P＜0.05），對照組此指標與本組治療前比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療4周后，2組患者PTA均明顯高于本組治療前（P＜0.05），治療組明顯高于同期對照組（P＜0.05）。治療2周后，2組患者中性粒細胞百分比與本組治療前比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；治療4周后，2組患者中性粒細胞百分比均明顯低于本組治療前和治療2周后（P＜0.05），治療組明顯低于同期對照組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 治療組與對照組患者治療前及治療2周、4周后中性粒細胞百分比和肝功能指標比較（x-±s）

3.4.3 經(jīng)不同濃度藥物干預后中性粒細胞Histone H3蛋白相對表達量比較 益氣健脾方中、高劑量組中性粒細胞Histone H3蛋白相對表達量明顯低于空白對照組（P＜0.05），其中益氣健脾方高劑量組Histone H3蛋白相對表達量明顯低于低劑量組（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組中性粒細胞Histone H3 蛋白電泳圖

表3 各組中性粒細胞Histone H3 蛋白水平比較（x-±s）

4 討論

ACLF患者在發(fā)病初期即出現(xiàn)嚴重的肝功能障礙，中性粒細胞最先被招募至損傷部位，但中性粒細胞的核心功能發(fā)生缺陷，即吞噬作用和脫顆粒作用下降，而產(chǎn)生NETs的能力增強，加重了ACLF患者肝損傷[11]?；罨拿庖呒毎δ芎慕?，代償性抗炎應答存在缺陷，導致病情進展迅速，病死率高。因此，有效改善患者的免疫抑制狀態(tài)是阻止ACLF進展的關鍵。目前尚無針對ACLF的特異性治療方法，主要采用內(nèi)科綜合支持治療、人工肝治療或肝移植，肝移植是目前治療ACLF最有效的方法，但因供肝緊缺、術后需長期使用抑制劑等因素，臨床應用受到很大限制。

根據(jù)ACLF臨床表現(xiàn)，可將其歸于中醫(yī)學“黃疸”“急黃”“肝瘟”等范疇[12]。本病病理因素包括毒、熱、濕、虛、瘀等，病性屬正虛邪實，病位在肝、腎、脾。HBV-ACLF是在慢性乙肝或肝硬化基礎上發(fā)生的嚴重肝臟損害，病程較長。久病必虛，因虛致實，故本病以本虛標實為主要證候特點[13-14]。筆者團隊發(fā)現(xiàn)，本病之虛以氣虛、血虛為多，實以濕邪為主，瘀為主要兼證，加之病程較長，正氣耗傷嚴重，故而正虛之象尤為明顯?！耙姼沃?，知肝傳脾，當先實脾”，針對HBV-ACLF本虛標實的證候要點，我們法以益氣養(yǎng)肝、健脾補血治其本，清熱利濕、理氣疏肝治其標，運用益氣健脾方標本兼治，臨床取效良好。益氣健脾方化裁自當歸補血湯和四君子湯，方中重用炙黃芪益氣健脾，太子參補氣健脾兼可生津，與黃芪相伍增益氣養(yǎng)陰之功，共為君藥；當歸養(yǎng)血活血，與黃芪配伍取當歸補血湯之意，補氣以生血，酒女貞子滋補肝腎陰精，共為臣藥；佐以炒白術、茯苓、陳皮、酒黃芩等健脾藥，兼清熱利濕、理氣疏肝；炙甘草調(diào)和諸藥為使。藥理研究表明，黃芪可通過降低血小板黏附性、抑制血小板聚集從而改變血液流變性，同時具有保護血管內(nèi)皮細胞、抗肝纖維化等藥理作用[15-16]。

TBIL和PTA是預測和判定ACLF病情程度和療效評價的重要指標，TBIL升高表明肝臟出現(xiàn)病變或者膽管阻塞，導致肝臟代謝功能下降，大量的膽紅素聚集肝臟，嚴重時可引起肝衰竭和多臟器功能衰竭[17]；而PTA是反映肝臟損害的特異性指標，PTA≤40%是診斷ACLF的重要依據(jù)，且PTA越低預示預后越差[18]。本研究結果顯示，2 種治療方案均能明顯改善HBV-ACLF患者PTA、TBIL水平，聯(lián)合治療方案改善效果更明顯，且在治療2 周時已有效果顯現(xiàn)。本研究也觀察了不同濃度益氣健脾方體外干預對HBV-ACLF患者中性粒細胞Histone H3蛋白相對表達量的影響，結果表明，在安全濃度范圍內(nèi)的益氣健脾方藥液能明顯降低HBV-ACLF患者中性粒細胞Histone H3蛋白水平，間接抑制NETs的生成，其抑制能力隨著藥物濃度的增加呈上升趨勢，表現(xiàn)出一定的劑量依賴性。

綜上所述，在內(nèi)科綜合用藥基礎上加用益氣健脾方能顯著提高HBV-ACLF患者的臨床療效，減輕肝損傷，其機制可能與抑制中性粒細胞Histone H3的表達從而降低NETs的生成有關。我們將繼續(xù)收集病例進行臨床研究，增加療效指標以驗證益氣健脾方治療HBV-ACLF的有效性，同時進行分子生物學實驗以探索ACLF發(fā)生時中性粒細胞的變化與肝細胞損傷之間的內(nèi)在聯(lián)系，為建立和完善益氣健脾方對HBV-ACLF患者中性粒細胞干預作用的循證醫(yī)學提供更多的科學證據(jù)。