謝秋紅，邵大志，馬曉靜，宋瑩，崔業(yè)波，馬彧

（1.四平市中心醫(yī)院，吉林四平 136000； 2.四平市食品藥品檢驗所，吉林四平 136000）

三七為五加科三七的干燥根及根莖，具有散瘀止血，消腫定痛功效。三七粉在臨床使用由來已久，尤其在我國北方地區(qū)深受患有心血管疾病老人的歡迎，而三七原粉入成藥的品種，《中華人民共和國藥典》2020 年版一部收載的大約有70 多個品種，在部頒標準中收載的大約有30多個品種，含三七藥粉的藥品臨床療效確切，利用價值高。近年來三七市場需求量巨大，每年約3.5 萬噸[1-6]。中藥材種植者施用農(nóng)藥防治病蟲害是提高中藥材產(chǎn)量的有效措施，但同時也影響了中藥材的品質(zhì)，增大了用藥風險。

《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》)2020年版一部中收載的三七質(zhì)量標準中，沒有有機氯類農(nóng)藥殘留量檢查項。而GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量標準》、《藥用植物及制劑外經(jīng)貿(mào)綠色行業(yè)標準》、《無公害三七藥材及飲片的農(nóng)藥殘留與重金屬及有害元素殘留限量》、《中華人民共和國藥典》(2020 年版)“藥材和飲片檢定通則”對33種禁用農(nóng)藥的殘留限量做出規(guī)定，WM/T2-2004 則規(guī)定了有機氯農(nóng)藥的殘留限量[7]。T/CATCM 003—2017 團體標準參考《中國藥典》及美國、歐盟、日本和韓國等國家及地區(qū)相關(guān)標準，對三七中206 種農(nóng)藥制定了限量標準，是我國記載三七農(nóng)藥殘留限量最全的標準，但普及度和法律效應(yīng)不及GB 2763—2021和《中國藥典》。

三七藥材中有機氯類等農(nóng)藥殘留情況報道和研究較多[8-13]，且五氯硝基苯超標的情況時有報道，現(xiàn)階段對中成藥中有機氯類農(nóng)藥的測定方法報道較少[16-17]，在食品、水果和蔬菜中研究報道較多[18-21]，檢測方法多為氣相色譜法?！吨腥A人民共和國藥典》四部通則2341第一法也為氣相色譜法，該法存在氧化氯丹與δ-六六六、順式環(huán)氧七氯與反式環(huán)氧七氯、p，p'-滴滴滴與p，p'-滴滴涕等組分的分離效果不佳和樣品處理繁瑣等缺點。筆者在此基礎(chǔ)上，采用DM-1701 毛細管柱，優(yōu)化色譜條件，使17 種有機氯類農(nóng)藥組分均達到基線分離。該方法具有樣品處理簡單、分析速度快、靈敏度高、專屬性好的特點。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：7890B 型，配63Ni-ECD 電子捕獲檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

電子天平：BP211D型，感量為0.1 mg，北京賽多利斯儀器天平有限公司。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EⅤ311型，萊伯泰科有限公司。

高速離心機：TG16-WS 型，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司。

二氯甲烷、丙酮和正己烷：色譜純，成都市科隆化學品有限公司。

硫酸、無水硫酸鈉和氯化鈉：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

有機氯農(nóng)藥混合對照品溶液：含有六氯苯、α-六六六、五氯硝基苯、γ-六六六、七氯、艾氏劑、β-六六六、氧化氯丹、δ-六六六、順式環(huán)氧七氯、反式環(huán)氧七氯、反式氯丹、順式氯丹、p，p'-滴滴伊、o，p'-滴滴涕、p，p'-滴滴滴、p，p'-滴滴涕17 種有機氯農(nóng)藥，質(zhì)量濃度依次為10.03、9.71、9.90、9.62、9.84、9.77、8.89、9.79、7.55、9.73、9.65、9.46、9.32、9.86、9.92、9.32、9.28 μg/mL，批號為610005-202003，中國食品藥品檢定研究院。

五氯硝基苯對照品溶液：1 000 mg/mL，批號為A1907264，壇墨質(zhì)檢標準物質(zhì)中心。

三七粉及含有三七成分中成藥樣品：共23 批，其中三七粉3 批、中成藥6 種20 批，包括三七傷藥片、丹七片、腰息痛膠囊等，市售，具體信息見表1。

表1 樣品信息

1.2 儀器工作條件

分析柱：DM-1701型毛細管柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm，北京迪馬克科技有限公司)；載氣：氮氣；流量：1.5 mL/min；進樣口溫度：230 ℃；進樣方式：不分流進樣；色譜柱溫度：程序升溫，初始溫度為60 ℃，保持0.5 min，以10 ℃/min 的速率升至240 ℃，保持3 min，再以20 ℃/min 的速率升至280 ℃，保持5 min；63Ni-ECD電子捕獲檢測器溫度：300 ℃。

驗證柱：DB-5 型毛細管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；載氣：氮氣；初始流量：1.5 mL/min，恒壓模式；色譜柱溫度：程序升溫，初始溫度60 ℃，保持0.3 min，以60 ℃/min 的速率升至170 ℃，再以10 ℃/min 的速率升至220 ℃，保持10 min，再以1 ℃/min的速率升至240 ℃，再以15 ℃/min 的速率甚至280 ℃，保持5 min；其它條件同分析柱。

1.3 溶液配制

有機氯農(nóng)藥混合對照品儲備液：0.1 μg/mL。準確移稱取有機氯農(nóng)藥混合對照品溶液1 mL，置于100 mL 的容量瓶中，用正己烷定容至標線，混勻，0～4 ℃冰箱中密封保存。

有機氯農(nóng)藥系列混合標準工作溶液：依次移取有機氯農(nóng)藥混合對照品儲備液適量，用正己烷稀釋配制質(zhì)量濃度分別為5、10、20、50、100 ng/mL 的有機氯類農(nóng)藥系列混合標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

五氯硝基苯標準溶液：0.1 mg/mL。準確移取五氯硝基苯對照品溶液1 mL，置于100 mL 的容量瓶中，用正己烷定容至標線，混勻，再移取1 mL，置于100 mL的容量瓶中，用正己烷定容至標線，混勻，于0～4 ℃冰箱中密封保存。

1.4 樣品處理

按日服用量，稱取三七粉或含有三七成分中成藥樣品，置于具塞錐形瓶中，加入水30 mL，振搖使完全崩解(或溶散)，準確加入丙酮50 mL，稱定質(zhì)量，超聲30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用丙酮補足減失的質(zhì)量。加入氯化鈉約8 g，準確加入二氯甲烷25 mL，稱定質(zhì)量，超聲15 min，再稱定質(zhì)量，用二氯甲烷補足減失的質(zhì)量，振搖使氯化鈉充分溶解，靜置，轉(zhuǎn)移至離心管中，以3 000 r/min 離心3 min，將有機相轉(zhuǎn)移至裝有適量無水硫酸鈉的具塞錐形瓶中，放置30 min。準確移取15 mL，于40 ℃減壓濃縮至約1 mL，加入正已烷約5 mL，減壓濃縮至近干，用正己烷溶解并轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，用正己烷定容至標線，搖勻，移至離心管中，緩緩加入硫酸溶液(硫酸與水體積比為9∶1)1 mL，振搖1 min，以3 000 r/min 離心10 min，分取上清液，加水1 mL，振搖，取上清液，作為樣品溶液。同法制備空白溶液。

1.5 實驗方法

取樣品溶液和有機氯農(nóng)藥系列混合標準工作溶液各1 μL，注入氣相色譜儀中，按照1.2項下分析柱色譜條件分析，得各農(nóng)藥殘留對照品線性方程；樣品溶液中如檢出與相應(yīng)農(nóng)藥殘留對照品保留時間相一致的色譜峰，則取對應(yīng)濃度的有機氯農(nóng)藥對照品溶液，連續(xù)同法分析3次，取3次平均值，按外標法計算其含量，并用驗證柱對檢出成分進行驗證。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

《中國藥典》2020 年版四部通則2341 第一法9種有機氯農(nóng)藥殘留測定法[14]，以(14%-氰丙基-苯基)甲基聚硅氧烷或(5%苯基)甲基聚硅氧烷為固定液，依法操作，p，p'-滴滴滴與p，p'-滴滴涕無法充分分離。22 種有機氯農(nóng)藥殘留測定法，以50%苯基-50%二甲基聚硅氧烷為固定液，依法操作，氧化氯丹與δ-六六六和順式環(huán)氧七氯與反式環(huán)氧七氯等多組分均無法充分分離。因此，選擇固定液為鍵合交聯(lián)14%氰丙基苯基二基硅氧烷的色譜柱進行試驗。

分別對同規(guī)格30 m×0.32 mm，0.5 μm的色譜柱OⅤ1701 柱、DM1701 柱和DB1701 柱進行篩選，17種有機氯類農(nóng)藥對照品在上述三款色譜柱上的分離效果有明顯差異。DM-1701柱分離效果最好，色譜圖見圖1，空白溶液在16.8 min 時有一色譜峰，與7號色譜峰保留時間17.1 min不一致；而DB1701柱采用恒壓模式，初始流量為1.5 mL/min，程序升溫同驗證柱條件，可較好地分離17個農(nóng)藥對照品。試驗結(jié)果表明，OⅤ1701柱較難獲得較好的色譜圖，通過調(diào)整程序升溫條件、氮氣流量及分析模式，β-六六六、氧化氯丹、δ-六六六和順式環(huán)氧七氯的分離效果仍不理想?？紤]到樣品中可能有雜質(zhì)對結(jié)果有干擾，需要用DB-5 柱進一步驗證，筆者對19 批檢測出五氯硝基苯的樣品采用DB-5柱對分析柱的檢測結(jié)果進行驗證，驗證結(jié)果均可得到與五氯硝基苯對照品保留時間相一致的色譜峰，證明檢測結(jié)果無誤。綜合上述，最后選取DM-1701色譜柱。

圖1 DM1701分析柱氣相色譜圖

2.2 柱溫

《中國藥典》2020 年版四部通則2341 第一法分別針對9種和22種有機氯類農(nóng)藥殘留分析，均采用程序升溫，但依法操作，均難以得到理想的分離效果圖。參考人參藥材質(zhì)量標準[15]，優(yōu)化程序升溫條件，將原來5個階段程序升溫優(yōu)化至三個階段。初始溫度保持時間延長至0.5 min，增加各組分的保留值；第二階段柱溫提高至240 ℃，保持3 min，升溫速率為10 ℃/min，確保氧化氯丹與δ-六六六和順式環(huán)氧七氯與反式環(huán)氧七氯達到基線分離；第三階段柱溫280 ℃，保持5 min，升溫速率提高至20 ℃/min，確保o，p'-滴滴涕檢出的同時，縮短分析時長。

2.3 樣品處理

《中國藥典》2020 年版四部通則2341 第一法22種有機氯類農(nóng)藥殘留分析方法，樣品通過乙腈提取后需要經(jīng)凝膠滲透色譜柱凈化，然后再經(jīng)過弗羅里硅土固相萃取柱凈化，操作繁瑣，且準確度不高。取樣品日服用量，參考9 種有機氯類農(nóng)藥殘留分析方法和人參質(zhì)量標準，用硫酸對溶液進行凈化，置換試劑改為正己烷，消除溶劑干擾的同時，并縮短樣品處理時間，提高方法的準確性。

2.4 線性關(guān)系和檢出限

取有機氯農(nóng)藥系列混合標準工作溶液，按照1.2分析柱色譜條件，分別進樣分析，記錄色譜圖，以各農(nóng)藥質(zhì)量濃度為橫坐標，以對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算線性方程及相關(guān)系數(shù)。

取農(nóng)藥殘留對照品溶液10 ng/mL，用正己烷適當稀釋，按照信噪比法計算各農(nóng)藥殘留對照品檢出限，以信噪比約為3∶1 時對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為對應(yīng)組分的檢出限。

17 種有機氯農(nóng)藥線性關(guān)系及方法檢出限列于表2。由表2數(shù)據(jù)可知，各組分線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.998，表明在對應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 17種有機氯農(nóng)藥線性關(guān)系及方法檢出限

2.5 樣品加標回收試驗

取上述23 批次樣品，用該方法測定，有19 批樣品檢出五氯硝基苯，其它農(nóng)藥組分均未檢出。19批陽性樣品中，丹七片等5批樣品超出限度，存在一定的安全隱患。因此，按照丹七片處方工藝，取丹參250 g 按照處方工藝提取濃縮，不添加三七粉，加入等量的淀粉與糊精混勻，制備陰性樣品。

取上述陰性樣品3.5 g，精密稱定，共計6 份，置于具塞三角瓶中，準確量取2 mL有機氯農(nóng)藥混合對照品儲備液(0.1 μg/mL)，待低溫揮干溶劑后，按照1.4方法處理，得加標樣品溶液，照1.2分析柱色譜條件分析，以色譜峰面積外標法定量，計算回收率及相對標準偏差，結(jié)果列于表3。由表3可知，17種有機氯類農(nóng)藥平均回收率為90.3%～102.2%，相對標準偏差為1.8%～2.8%，表明該方法準確度、精密度均良好。

表3 陰性樣品加標回收試驗結(jié)果

3 結(jié)語

用改進條件的氣相色譜法對丹七片等6種中成藥和三七粉中17種有機氯農(nóng)藥殘留量進行測定，該方法靈敏度高，分析速度快，準確度和精密度良好。