苗會(huì)娟，徐艷梅，郝麗娟，梁皓，劉瑞娜，高燕霞

（河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院，國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050200）

腦蛋白水解物是一種從豬腦中提取的器官特異性氨基酸混合物，為多種游離氨基酸和小分子肽混合物，具有類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用。在臨床上作為腦血管補(bǔ)償不足引起的功能障礙、器質(zhì)性腦綜合征、注意力缺陷和記憶障礙、阿爾茨海默病、新生兒缺血性腦疾病、抑郁癥和癲癇等腦神經(jīng)類疾病的預(yù)防和輔助治療［1-4］，不良反應(yīng)較少。

腦蛋白水解物由健康豬腦經(jīng)脫脂、酶水解、超濾、干燥等工藝得到，主要有效成分為胰酶水解后的多肽分子、多種氨基酸及腦磷脂、卵磷脂和神經(jīng)生長(zhǎng)因子等?，F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［5］中并未對(duì)多肽含量進(jìn)行控制，只是規(guī)定其總氮含量和氨基氮含量，缺乏科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。

腦蛋白水解物中的多肽是由一系列氨基酸脫羧形成的產(chǎn)物。因氨基酸序列具有不確定性，難以通過常規(guī)外標(biāo)法直接確定其含量，只能利用水解后總氨基酸和游離氨基酸之差來粗略定量，包括樣品水解和分離測(cè)定兩個(gè)步驟。

常見的蛋白質(zhì)水解方法有酶水解法［6］、酸水解法［7］、堿水解法［8］以及微波消解法［9］等。堿水解方法多用于易氧化色氨酸的測(cè)定［8］。酶水解方法用于對(duì)化學(xué)水解敏感的氨基酸的測(cè)定，缺點(diǎn)是酶反應(yīng)選擇性較高，反應(yīng)條件苛刻，通用性較差。微波消解法水解效率高，節(jié)約時(shí)間，但是蘇氨酸和絲氨酸的回收率較低。酸水解是目前蛋白質(zhì)水解最常用的方法，通常選擇揮發(fā)性酸在加熱條件下水解，如鹽酸水解（6 mol/L 鹽酸，在隔離氧氣的密閉條件下，于110 ℃水解20～22 h），因此，擬采用酸水解腦蛋白水解物。

氨基酸測(cè)定法主要有氨基酸分析儀法［10］、離子色譜法［11］、液相色譜法［12］、原子熒光光譜法［13］、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［8］、毛細(xì)管電泳儀法［14］、氣相色譜法［15］、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［16］等。其中，液相色譜法因儀器價(jià)格相對(duì)低廉而應(yīng)用較多，在氨基酸分析領(lǐng)域占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，因此選擇液相色譜儀方法。

除色氨酸、組氨酸、甲硫氨酸等少數(shù)氨基酸外，絕大多數(shù)氨基酸無紫外吸收，因此需要先衍生為具有紫外吸收的化合物。常見的衍生試劑包括異硫氰酸苯酯（PⅠTC）［12］、鄰苯二甲醛（OPA）［17］、9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC）［18］、2，4-二硝基氟苯（DNFB）［19］等。鄰苯二甲醛不能和脯氨酸發(fā)生衍生反應(yīng)，不適用于該品種；9-芴甲基氯甲酸酯和2，4-二硝基氟苯毒性較大，因此選用異硫氰酸苯酯作為衍生劑。

綜上，采用反相高效液相色譜法建立了肽圖鑒別（指紋圖譜）方法，并成功篩選出一批對(duì)照品，采用異硫氰酸苯酯柱前衍生-反相高效液相儀法測(cè)定腦蛋白水解物中氨基酸含量，用酸水解法對(duì)腦蛋白水解物進(jìn)行水解，進(jìn)一步測(cè)定其中總氨基酸含量?？偘被岷浚ㄒ缘?jì)）和游離氨基酸含量（以氮計(jì)）之差即為腦蛋白水解物中肽含量（以氮計(jì)）。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：U-3000型，配紫外檢測(cè)器，美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。

電子天平：XS-105型，感應(yīng)量為0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

酸度計(jì)：PB-10 型，測(cè)量精度為0.01，德國(guó)賽多利斯公司。

自動(dòng)移液器：1 mL，A級(jí)，美國(guó)Eppendorf公司。

電熱箱：101-2AB 型，溫度控制精度為0.1 ℃，天津泰勒斯儀器有限公司。

水浴鍋：D91126 型，溫度控制精度為0.1 ℃，德國(guó)孟默特公司。

衍生管：5 mL 中硼硅西林瓶，滄州四星玻璃股份有限公司。

氨基酸對(duì)照品：批號(hào)及含量見表1，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

表1 氨基酸對(duì)照品信息

鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸：化學(xué)純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不小于99.0%，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

異硫氰酸苯酯：化學(xué)純，質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.5%，上海阿拉丁生化科技試劑有限公司。

三乙胺、乙腈、正己烷：色譜純，德國(guó)默克試劑有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水：超純水，由MilliporeQ-2882x型純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）制得。

腦蛋白水解物樣品：批號(hào)分別為M20220105、M20220106、M20220107，河北智同生物制藥股份有限公司。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse AAA 柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司）；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣體積：2 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；流動(dòng)相：（A）0.1 mol/L 醋酸鈉溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至6.5）-乙腈（體積比為900∶43），（B）乙腈-水（體積比為3∶1）；流量為1.0 mL/min，梯度洗脫，洗脫程序見表2。

1.3 溶液配制

混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液：稱取上述各氨基酸對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于同一50 mL容量瓶中，加鹽酸1 mL，水適量，超聲使溶解，并用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，得到各組分質(zhì)量濃度均為200 μg/mL的混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。

混合氨基酸對(duì)照品工作液：取混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，分別用水稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為100、50、20、10、1 μg/mL 的系列混合氨基酸對(duì)照品工作液。

樣品溶液A：取腦蛋白水解物樣品約0.3 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，過濾。該樣品溶液用于游離氨基酸的測(cè)定。

樣品溶液B：取腦蛋白水解物樣品約0.3 g，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加水適量，超聲使溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻。精密量取5 mL，置于10 mL容量瓶中，用鹽酸稀釋至標(biāo)線，搖勻。取上述溶液約3 mL，置于水解管中，充氮?dú)?～5 min，密封，于110 ℃水解20 h，啟封。放冷，精密量取水解后的溶液2 mL，置于蒸發(fā)皿中，用氮?dú)獯蹈苫蛩]干，精密加入水2 mL復(fù)溶，過濾。該樣品溶液用于總氨基酸的測(cè)定。

衍生液：即0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯乙腈溶液，取異硫氰酸苯酯12 μL，加入乙腈988 μL，混勻。

三乙胺乙腈溶液：1 mol/L，取三乙胺139 μL，加乙腈861 μL，混勻。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

取系列混合氨基酸對(duì)照品工作溶液、樣品溶液A、樣品溶液B 各400 μL，分別置于衍生管中，依次精密加入三乙胺乙腈溶液200 μL、衍生液200 μL，混勻，于室溫反應(yīng)1 h，精密加入正己烷800 μL，劇烈振搖1 min，放置20 min，取下層溶液，用0.45 μm濾膜過濾，各精密量取2 μL 注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以系列對(duì)照品工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。將樣品溶液A、樣品溶液B 的色譜峰面積分別帶入線性方程，計(jì)算氨基酸含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1 溶劑的選擇

分別選擇水、0.1 mol/L鹽酸溶液和0.5 mol/L鹽酸溶液作為溶劑，考察不同溶劑對(duì)游離氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，使用0.5 mol/L鹽酸溶液作為溶劑時(shí)，有大量的沉淀出現(xiàn)；0.1 mol/L 鹽酸溶液作為溶劑時(shí)，游離氨基酸含量明顯低于水作為溶劑。因此選擇水作為溶劑。

2.1.2 樣品溶液A濃度的選擇

實(shí)驗(yàn)所用腦蛋白水解物樣品中含有較多相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì)，在水中溶解性較差。測(cè)定結(jié)果顯示，當(dāng)樣品溶液的質(zhì)量濃度大于100 μg/mL時(shí)，溶液難以通過濾膜；當(dāng)樣品溶液的質(zhì)量濃度大于50 μg/mL 時(shí)，樣品溶液A 中谷氨酸峰和相鄰雜質(zhì)峰的分離小于1.5，不能滿足測(cè)定要求；當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為20 μg/mL 時(shí)，脯氨酸的濃度在定量限附近，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大，不能滿足測(cè)定要求。綜合考慮色譜柱壽命和測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性，樣品溶液A的質(zhì)量濃度選擇為30 μg/mL。

2.1.3 衍生時(shí)間的選擇

分別設(shè)置衍生時(shí)間為45、60、75 min，考察目標(biāo)物的色譜峰面積，不同衍生時(shí)間對(duì)應(yīng)的鹽酸賴氨酸的色譜峰面積見表3。由表3可見，衍生60 min后目標(biāo)物的色譜峰面積明顯高于衍生45 min 對(duì)應(yīng)目標(biāo)物的色譜峰面積，而衍生75 min目標(biāo)物的色譜峰面積與衍生60 min 目標(biāo)物的色譜峰面積相當(dāng)。因此選擇衍生時(shí)間為60 min。

表3 不同衍生時(shí)間對(duì)應(yīng)的鹽酸賴氨酸的色譜峰面積

2.1.4 色譜柱的選擇

分別選擇C18及氨基酸專用分析柱AAA進(jìn)行試驗(yàn)，混合氨基酸對(duì)照品溶液的色譜圖如圖1所示。

圖1 不同色譜柱對(duì)應(yīng)的混合氨基酸對(duì)照品溶液色譜圖

由圖1 可見，在同樣的條件下，C18色譜柱的色譜峰明顯存在前延；而使用AAA色譜柱的色譜峰對(duì)稱因子明顯提高，且平衡時(shí)間短。因此采用AAA填料作為色譜柱。

2.1.5 衍生管的選擇

分別選擇使用5 mL 塑料圓底離心管、3 mL 中硼硅西林瓶和5 mL 中硼硅西林瓶3 種衍生管進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)考察了對(duì)應(yīng)衍生物的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，中硼硅西林瓶衍生管可以明顯縮短正己烷萃取后的平衡時(shí)間，同時(shí)考慮萃取效果和萃取后吸取下層溶液的難易程度，選擇5 mL 中硼硅西林瓶作為衍生管。

2.2 典型色譜圖

分別取溶劑、系列混合氨基酸對(duì)照品溶液、樣品溶液，按照1.4 方法衍生，在1.2 色譜條件下進(jìn)樣分析，色譜圖見圖2。由圖2 可知，各氨基酸色譜峰分離良好。

圖2 空白溶劑、氨基酸混合對(duì)照品溶液及樣品溶液的色譜圖

2.3 線性方程和定量限

精密量取系列氨基酸混合對(duì)照品溶液各2 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。以每種氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表4。由表4 可知，各氨基酸在質(zhì)量濃度1～200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.998。

表4 線性方程和回歸系數(shù)

稱取各個(gè)氨基酸對(duì)照品適量，分別加0.1 mol/L鹽酸，制成質(zhì)量濃度約為1 μg/mL 的氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液，并不斷稀釋，按照1.4 方法進(jìn)行衍生，在1.2色譜條件下分析，取信噪比為10對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法定量限，各氨基酸方法定量限見表5。

表5 16種氨基酸方法定量限

2.4 方法精密度

平行稱取樣品6份，按照1.3方法分別制備樣品溶液B，分別按1.4 方法衍生，在1.2 色譜條件下分析，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別定量，結(jié)果見表6。由表6 可知，該方法測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于5%，精密度良好，滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求。

表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.5 樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)

參照表7 稱取氨基酸對(duì)照品，置于同一50 mL容量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制氨基酸混合溶液A；參照表7稱取氨基酸對(duì)照品，置于同一20 mL 容量瓶中，用0.1 mol/L 鹽酸溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻，配制氨基酸混合溶液B。

表7 氨基酸對(duì)照品稱樣質(zhì)量 mg

2.5.1 游離氨基酸含量測(cè)定

取已知多肽的樣品1 批3 份，稱樣質(zhì)量均為0.150 0 g，分別置于100 mL 容量瓶中，加入60 mL水溶解，精密加入1.0 mL氨基酸混合溶液A，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，按照1.4方法衍生，在1.2色譜條件下分析測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表8。

表8 游離氨基酸測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表8 可知，游離氨基酸含量測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收率為88.9%～104.3%，表明該法測(cè)量準(zhǔn)確度較高，滿足分析要求。

2.5.2 總氨基酸含量測(cè)定

取已知多肽的樣品1 批3 份，稱樣質(zhì)量均為0.150 0 g，分別置于100 mL 容量瓶中，加入60 mL水溶解，依次精密加入氨基酸混合溶液B 5.0 mL，用水稀釋至標(biāo)線，搖勻，按照1.3 樣品溶液B 制備方法處理，按照1.4 方法進(jìn)行衍生，在1.2 色譜條件下分析，計(jì)算回收率，結(jié)果見表9。由表9可知，總氨基酸含量測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收率為91.5%～107.6%，表明該法測(cè)量準(zhǔn)確度較高。

表9 總氨基酸測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語

建立了異硫氰酸苯酯柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定腦蛋白水解物中多肽含量的方法，并考察了該法的專屬性、精密度、回收率和定量限。結(jié)果表明，各技術(shù)參數(shù)均滿足檢測(cè)要求，建立的方法科學(xué)可行，可為腦蛋白水解物多肽含量的控制提供技術(shù)依據(jù)。