苗會(huì)娟,徐艷梅,郝麗娟,梁皓,劉瑞娜,高燕霞
(河北省藥品醫(yī)療器械檢驗(yàn)研究院,國(guó)家藥品監(jiān)督管理局仿制藥質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,石家莊 050200)
腦蛋白水解物是一種從豬腦中提取的器官特異性氨基酸混合物,為多種游離氨基酸和小分子肽混合物,具有類神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的作用。在臨床上作為腦血管補(bǔ)償不足引起的功能障礙、器質(zhì)性腦綜合征、注意力缺陷和記憶障礙、阿爾茨海默病、新生兒缺血性腦疾病、抑郁癥和癲癇等腦神經(jīng)類疾病的預(yù)防和輔助治療[1-4],不良反應(yīng)較少。
腦蛋白水解物由健康豬腦經(jīng)脫脂、酶水解、超濾、干燥等工藝得到,主要有效成分為胰酶水解后的多肽分子、多種氨基酸及腦磷脂、卵磷脂和神經(jīng)生長(zhǎng)因子等?,F(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)[5]中并未對(duì)多肽含量進(jìn)行控制,只是規(guī)定其總氮含量和氨基氮含量,缺乏科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性。
腦蛋白水解物中的多肽是由一系列氨基酸脫羧形成的產(chǎn)物。因氨基酸序列具有不確定性,難以通過常規(guī)外標(biāo)法直接確定其含量,只能利用水解后總氨基酸和游離氨基酸之差來粗略定量,包括樣品水解和分離測(cè)定兩個(gè)步驟。
常見的蛋白質(zhì)水解方法有酶水解法[6]、酸水解法[7]、堿水解法[8]以及微波消解法[9]等。堿水解方法多用于易氧化色氨酸的測(cè)定[8]。酶水解方法用于對(duì)化學(xué)水解敏感的氨基酸的測(cè)定,缺點(diǎn)是酶反應(yīng)選擇性較高,反應(yīng)條件苛刻,通用性較差。微波消解法水解效率高,節(jié)約時(shí)間,但是蘇氨酸和絲氨酸的回收率較低。酸水解是目前蛋白質(zhì)水解最常用的方法,通常選擇揮發(fā)性酸在加熱條件下水解,如鹽酸水解(6 mol/L 鹽酸,在隔離氧氣的密閉條件下,于110 ℃水解20~22 h),因此,擬采用酸水解腦蛋白水解物。
氨基酸測(cè)定法主要有氨基酸分析儀法[10]、離子色譜法[11]、液相色譜法[12]、原子熒光光譜法[13]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[8]、毛細(xì)管電泳儀法[14]、氣相色譜法[15]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[16]等。其中,液相色譜法因儀器價(jià)格相對(duì)低廉而應(yīng)用較多,在氨基酸分析領(lǐng)域占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì),因此選擇液相色譜儀方法。
除色氨酸、組氨酸、甲硫氨酸等少數(shù)氨基酸外,絕大多數(shù)氨基酸無紫外吸收,因此需要先衍生為具有紫外吸收的化合物。常見的衍生試劑包括異硫氰酸苯酯(PⅠTC)[12]、鄰苯二甲醛(OPA)[17]、9-芴甲基氯甲酸酯(FMOC)[18]、2,4-二硝基氟苯(DNFB)[19]等。鄰苯二甲醛不能和脯氨酸發(fā)生衍生反應(yīng),不適用于該品種;9-芴甲基氯甲酸酯和2,4-二硝基氟苯毒性較大,因此選用異硫氰酸苯酯作為衍生劑。
綜上,采用反相高效液相色譜法建立了肽圖鑒別(指紋圖譜)方法,并成功篩選出一批對(duì)照品,采用異硫氰酸苯酯柱前衍生-反相高效液相儀法測(cè)定腦蛋白水解物中氨基酸含量,用酸水解法對(duì)腦蛋白水解物進(jìn)行水解,進(jìn)一步測(cè)定其中總氨基酸含量??偘被岷浚ㄒ缘?jì))和游離氨基酸含量(以氮計(jì))之差即為腦蛋白水解物中肽含量(以氮計(jì))。
液相色譜儀:U-3000型,配紫外檢測(cè)器,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司。
電子天平:XS-105型,感應(yīng)量為0.1 mg,瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。
酸度計(jì):PB-10 型,測(cè)量精度為0.01,德國(guó)賽多利斯公司。
自動(dòng)移液器:1 mL,A級(jí),美國(guó)Eppendorf公司。
電熱箱:101-2AB 型,溫度控制精度為0.1 ℃,天津泰勒斯儀器有限公司。
水浴鍋:D91126 型,溫度控制精度為0.1 ℃,德國(guó)孟默特公司。
衍生管:5 mL 中硼硅西林瓶,滄州四星玻璃股份有限公司。
氨基酸對(duì)照品:批號(hào)及含量見表1,中國(guó)食品藥品檢定研究院。
表1 氨基酸對(duì)照品信息
鹽酸、乙酸鈉、冰乙酸:化學(xué)純,質(zhì)量分?jǐn)?shù)均不小于99.0%,天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。
異硫氰酸苯酯:化學(xué)純,質(zhì)量分?jǐn)?shù)不小于99.5%,上海阿拉丁生化科技試劑有限公司。
三乙胺、乙腈、正己烷:色譜純,德國(guó)默克試劑有限公司。
實(shí)驗(yàn)用水:超純水,由MilliporeQ-2882x型純水機(jī)(美國(guó)密理博公司)制得。
腦蛋白水解物樣品:批號(hào)分別為M20220105、M20220106、M20220107,河北智同生物制藥股份有限公司。
色譜柱:Agilent Eclipse AAA 柱(150 mm×4.6 mm,3.5 μm,美國(guó)安捷倫科技有限公司);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣體積:2 μL;檢測(cè)波長(zhǎng):254 nm;流動(dòng)相:(A)0.1 mol/L 醋酸鈉溶液(用冰乙酸調(diào)節(jié)pH 至6.5)-乙腈(體積比為900∶43),(B)乙腈-水(體積比為3∶1);流量為1.0 mL/min,梯度洗脫,洗脫程序見表2。
混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液:稱取上述各氨基酸對(duì)照品約10 mg,精密稱定,置于同一50 mL容量瓶中,加鹽酸1 mL,水適量,超聲使溶解,并用水稀釋至標(biāo)線,搖勻,得到各組分質(zhì)量濃度均為200 μg/mL的混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液。
混合氨基酸對(duì)照品工作液:取混合氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,分別用水稀釋,制成質(zhì)量濃度分別為100、50、20、10、1 μg/mL 的系列混合氨基酸對(duì)照品工作液。
樣品溶液A:取腦蛋白水解物樣品約0.3 g,精密稱定,置于100 mL容量瓶中,加水適量,超聲使溶解并稀釋至標(biāo)線,搖勻,過濾。該樣品溶液用于游離氨基酸的測(cè)定。
樣品溶液B:取腦蛋白水解物樣品約0.3 g,精密稱定,置于100 mL容量瓶中,加水適量,超聲使溶解并稀釋至標(biāo)線,搖勻。精密量取5 mL,置于10 mL容量瓶中,用鹽酸稀釋至標(biāo)線,搖勻。取上述溶液約3 mL,置于水解管中,充氮?dú)?~5 min,密封,于110 ℃水解20 h,啟封。放冷,精密量取水解后的溶液2 mL,置于蒸發(fā)皿中,用氮?dú)獯蹈苫蛩]干,精密加入水2 mL復(fù)溶,過濾。該樣品溶液用于總氨基酸的測(cè)定。
衍生液:即0.1 mol/L 異硫氰酸苯酯乙腈溶液,取異硫氰酸苯酯12 μL,加入乙腈988 μL,混勻。
三乙胺乙腈溶液:1 mol/L,取三乙胺139 μL,加乙腈861 μL,混勻。
取系列混合氨基酸對(duì)照品工作溶液、樣品溶液A、樣品溶液B 各400 μL,分別置于衍生管中,依次精密加入三乙胺乙腈溶液200 μL、衍生液200 μL,混勻,于室溫反應(yīng)1 h,精密加入正己烷800 μL,劇烈振搖1 min,放置20 min,取下層溶液,用0.45 μm濾膜過濾,各精密量取2 μL 注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以系列對(duì)照品工作溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),色譜峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程。將樣品溶液A、樣品溶液B 的色譜峰面積分別帶入線性方程,計(jì)算氨基酸含量。
2.1.1 溶劑的選擇
分別選擇水、0.1 mol/L鹽酸溶液和0.5 mol/L鹽酸溶液作為溶劑,考察不同溶劑對(duì)游離氨基酸測(cè)定結(jié)果的影響。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),使用0.5 mol/L鹽酸溶液作為溶劑時(shí),有大量的沉淀出現(xiàn);0.1 mol/L 鹽酸溶液作為溶劑時(shí),游離氨基酸含量明顯低于水作為溶劑。因此選擇水作為溶劑。
2.1.2 樣品溶液A濃度的選擇
實(shí)驗(yàn)所用腦蛋白水解物樣品中含有較多相對(duì)分子質(zhì)量較大的物質(zhì),在水中溶解性較差。測(cè)定結(jié)果顯示,當(dāng)樣品溶液的質(zhì)量濃度大于100 μg/mL時(shí),溶液難以通過濾膜;當(dāng)樣品溶液的質(zhì)量濃度大于50 μg/mL 時(shí),樣品溶液A 中谷氨酸峰和相鄰雜質(zhì)峰的分離小于1.5,不能滿足測(cè)定要求;當(dāng)樣品質(zhì)量濃度為20 μg/mL 時(shí),脯氨酸的濃度在定量限附近,測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差較大,不能滿足測(cè)定要求。綜合考慮色譜柱壽命和測(cè)量結(jié)果的重復(fù)性,樣品溶液A的質(zhì)量濃度選擇為30 μg/mL。
2.1.3 衍生時(shí)間的選擇
分別設(shè)置衍生時(shí)間為45、60、75 min,考察目標(biāo)物的色譜峰面積,不同衍生時(shí)間對(duì)應(yīng)的鹽酸賴氨酸的色譜峰面積見表3。由表3可見,衍生60 min后目標(biāo)物的色譜峰面積明顯高于衍生45 min 對(duì)應(yīng)目標(biāo)物的色譜峰面積,而衍生75 min目標(biāo)物的色譜峰面積與衍生60 min 目標(biāo)物的色譜峰面積相當(dāng)。因此選擇衍生時(shí)間為60 min。
表3 不同衍生時(shí)間對(duì)應(yīng)的鹽酸賴氨酸的色譜峰面積
2.1.4 色譜柱的選擇
分別選擇C18及氨基酸專用分析柱AAA進(jìn)行試驗(yàn),混合氨基酸對(duì)照品溶液的色譜圖如圖1所示。
圖1 不同色譜柱對(duì)應(yīng)的混合氨基酸對(duì)照品溶液色譜圖
由圖1 可見,在同樣的條件下,C18色譜柱的色譜峰明顯存在前延;而使用AAA色譜柱的色譜峰對(duì)稱因子明顯提高,且平衡時(shí)間短。因此采用AAA填料作為色譜柱。
2.1.5 衍生管的選擇
分別選擇使用5 mL 塑料圓底離心管、3 mL 中硼硅西林瓶和5 mL 中硼硅西林瓶3 種衍生管進(jìn)行試驗(yàn),對(duì)考察了對(duì)應(yīng)衍生物的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明,中硼硅西林瓶衍生管可以明顯縮短正己烷萃取后的平衡時(shí)間,同時(shí)考慮萃取效果和萃取后吸取下層溶液的難易程度,選擇5 mL 中硼硅西林瓶作為衍生管。
分別取溶劑、系列混合氨基酸對(duì)照品溶液、樣品溶液,按照1.4 方法衍生,在1.2 色譜條件下進(jìn)樣分析,色譜圖見圖2。由圖2 可知,各氨基酸色譜峰分離良好。
圖2 空白溶劑、氨基酸混合對(duì)照品溶液及樣品溶液的色譜圖
精密量取系列氨基酸混合對(duì)照品溶液各2 μL,注入液相色譜儀,記錄色譜圖。以每種氨基酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),以對(duì)應(yīng)色譜峰面積為縱坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù),結(jié)果見表4。由表4 可知,各氨基酸在質(zhì)量濃度1~200 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,線性相關(guān)系數(shù)均不小于0.998。
表4 線性方程和回歸系數(shù)
稱取各個(gè)氨基酸對(duì)照品適量,分別加0.1 mol/L鹽酸,制成質(zhì)量濃度約為1 μg/mL 的氨基酸對(duì)照品儲(chǔ)備液,并不斷稀釋,按照1.4 方法進(jìn)行衍生,在1.2色譜條件下分析,取信噪比為10對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為方法定量限,各氨基酸方法定量限見表5。
表5 16種氨基酸方法定量限
平行稱取樣品6份,按照1.3方法分別制備樣品溶液B,分別按1.4 方法衍生,在1.2 色譜條件下分析,以標(biāo)準(zhǔn)曲線法分別定量,結(jié)果見表6。由表6 可知,該方法測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于5%,精密度良好,滿足方法學(xué)驗(yàn)證要求。
表6 精密度試驗(yàn)結(jié)果
參照表7 稱取氨基酸對(duì)照品,置于同一50 mL容量瓶中,用0.1 mol/L 鹽酸溶解并稀釋至標(biāo)線,搖勻,配制氨基酸混合溶液A;參照表7稱取氨基酸對(duì)照品,置于同一20 mL 容量瓶中,用0.1 mol/L 鹽酸溶解并稀釋至標(biāo)線,搖勻,配制氨基酸混合溶液B。
表7 氨基酸對(duì)照品稱樣質(zhì)量 mg
2.5.1 游離氨基酸含量測(cè)定
取已知多肽的樣品1 批3 份,稱樣質(zhì)量均為0.150 0 g,分別置于100 mL 容量瓶中,加入60 mL水溶解,精密加入1.0 mL氨基酸混合溶液A,用水稀釋至標(biāo)線,搖勻,按照1.4方法衍生,在1.2色譜條件下分析測(cè)定,計(jì)算回收率,結(jié)果見表8。
表8 游離氨基酸測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
由表8 可知,游離氨基酸含量測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收率為88.9%~104.3%,表明該法測(cè)量準(zhǔn)確度較高,滿足分析要求。
2.5.2 總氨基酸含量測(cè)定
取已知多肽的樣品1 批3 份,稱樣質(zhì)量均為0.150 0 g,分別置于100 mL 容量瓶中,加入60 mL水溶解,依次精密加入氨基酸混合溶液B 5.0 mL,用水稀釋至標(biāo)線,搖勻,按照1.3 樣品溶液B 制備方法處理,按照1.4 方法進(jìn)行衍生,在1.2 色譜條件下分析,計(jì)算回收率,結(jié)果見表9。由表9可知,總氨基酸含量測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收率為91.5%~107.6%,表明該法測(cè)量準(zhǔn)確度較高。
表9 總氨基酸測(cè)定方法樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果
建立了異硫氰酸苯酯柱前衍生-高效液相色譜法測(cè)定腦蛋白水解物中多肽含量的方法,并考察了該法的專屬性、精密度、回收率和定量限。結(jié)果表明,各技術(shù)參數(shù)均滿足檢測(cè)要求,建立的方法科學(xué)可行,可為腦蛋白水解物多肽含量的控制提供技術(shù)依據(jù)。