張小風, 趙建鋒, 呂 洋, 范金強, 強 勇

(湖北省荊門市人民醫(yī)院/荊楚理工學院附屬中心醫(yī)院, 湖北 荊門 448000)

結(jié)直腸癌(CRC)是全球第三大常見癌癥,被認為是最常見的癌癥之一,對人類健康影響很大,盡管在過去幾十年中,CRC的治療取得一些進展,但CRC患者的總生存率并沒有預期的變化[1]。CRC的發(fā)展涉及多步驟,包括遺傳和表觀遺傳變化,這導致癌細胞中癌基因的激活和腫瘤抑制基因的失活[2]。MicroRNA(miRNA)是非編碼RNA分子,通過與相應mRNA靶標的39個非翻譯區(qū)域結(jié)合來發(fā)揮其功能,大約三分之一的人類基因被認為受miRNA調(diào)控,這表明miRNA在生理和病理過程中具有關(guān)鍵作用[3]。大量研究表明,miRNA與人類腫瘤有關(guān),異常的miRNA表達可導致相應的異常蛋白表達,這可能導致獲得惡性特征[3]。因此,miRNA的功能應該是腫瘤抑制因子或癌基因。最近,研究顯示miR-155在CRC腫瘤發(fā)生和腫瘤進展中起著至關(guān)重要的作用[4]。miR-155場缺損的檢測和監(jiān)測可能對預防和治療具有微衛(wèi)星不穩(wěn)定性的炎癥性腸病相關(guān)CRC產(chǎn)生影響。此外,miR-155的表達與人結(jié)直腸癌中MLH1或MSH2蛋白的表達之間存在負相關(guān)關(guān)系[5]。研究證實miR-155過表達可以下調(diào)MLH1,MSH2和MSH6的表達,從而導致腫瘤發(fā)生[6]。然而,miR-155對CRC增殖和侵襲轉(zhuǎn)移的影響遠未得到充分了解。有研究顯示HuR與CRC的惡性表型密切相關(guān),主要是通過其靶mRNA的穩(wěn)定[7]。相關(guān)研究顯示通過敲低circPPFIA1s增加的轉(zhuǎn)移潛力通過HuR沉默減弱,可阻斷結(jié)直腸癌中HuR的致癌作用[8]。本研究主要探究miR-155通過對HuR的調(diào)控參與結(jié)腸癌細胞轉(zhuǎn)移的機制研究。

1 材料與方法

1.1細胞培養(yǎng):HCT-116結(jié)腸癌細胞系均從中國科學院細胞庫類型培養(yǎng)收集中購買,并在含有10%胎牛血清(FBS;Gibco;賽默飛世爾科學公司)rmi-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)(Gibco;賽默飛世爾科學公司)維持在37℃和5%CO2。MCF-7和H184B5F5/M10細胞在MEM-α中維持,具有相同的補充劑和培養(yǎng)條件。

1.2轉(zhuǎn)染:miR-155模擬物(5′-UUAAUGCUAAUCGUGAUAGGGGU-3′)和抑制劑(5′-AAUUACGAUUAGCACUAUCCCCA-3′)或其相應的陰性對照從Bioomics Biotech購買。收獲細胞并以1×105細胞/孔的密度接種在6孔板中。孵育24h后,將細胞培養(yǎng)基改為無血清培養(yǎng)基,額外培養(yǎng)6h后,根據(jù)制造商的協(xié)議使用Lipofectamine 2000試劑(Invitrogen;賽默飛世爾科技公司)進行轉(zhuǎn)染。

1.3逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR):在轉(zhuǎn)染后48h,收集每組細胞,使用TRIzol試劑(Invitrogen)對RNA進行逆轉(zhuǎn)錄,并通過RT-qPCR(SYBR Green方法)和miR-155檢測試劑盒(Biomics Biotech)檢測miR-155的水平。使用Moloney小鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶(Promega Corp)和隨機引物將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(c)DNA,以cDNA為模板,采用RT-qPCR方法檢測HuR mRNA水平,引物如下:HuR正向,5'-GGACCAGTGAGTTGGGAGTTATTACT-3 ',反向,HuR,5'-GGCAAGACTTCACTGTGAAGTCA-3';GAPDH正向,5'-AAGGTCGGAGTCACCGGATT-3',反向,5' -CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3',PCR混合物包含:2μL cDNA、1μL正向引物、1μL反向引物、10μL 2X SYBR混合物和最多20μL的ddH2O2,熱循環(huán)條件為:95℃ 10min;95℃為10s,62℃為20s,72℃為30s,40個周期。將HuR的mRNA水平歸一化為GAPDH,使用2-ΔΔCq方法計算HuR的相對mRNA水平。

1.4傷口愈合試驗:將細胞接種在6孔板(1×106細胞/孔)并在12孔板中生長至80%匯合,在細胞單層中產(chǎn)生兩個線性劃痕,每個孔中具有200μL微量移液管尖端,之后在無血清培養(yǎng)基中處理細胞并允許遷移24h。在AxioVert 200M熒光顯微鏡下捕獲傷口區(qū)域的圖像(放大倍率,×100)在0h和24h。遷移根據(jù)以下公式計算:細胞遷移率=(培養(yǎng)后0h劃痕寬度-劃痕寬度)/0h劃痕寬度。

1.5MTT測定:將細胞接種在96孔板中,每孔中有6000個細胞,用miR-155模擬物,模擬物的陰性對照,miR-155抑制劑或抑制劑的陰性對照轉(zhuǎn)染細胞。在轉(zhuǎn)染后0、24、48、72和96h,向每個孔中加入5mg/mL MTT,再孵育4h后,除去上清液,向每個孔中加入200μL二甲基亞砜,使用酶標儀在490nm處測量吸光度。

1.6菌落形成測定:用miR-155模擬物、miR-155抑制劑或其陰性對照轉(zhuǎn)染后,將200個細胞在6孔板中孵育,并在含有37℃,5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)時,孵育后7天,將細胞用結(jié)晶紫染色30min,并用PBS洗滌后計數(shù)菌落數(shù)。

1.7細胞周期分析:用miR-155模擬物、miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉(zhuǎn)染后收獲細胞,并在4℃下固定在冰冷的70%乙醇中過夜,用PBS洗滌細胞,并用細胞周期檢測試劑盒在黑暗中染色30min,后用FACScalibur流式細胞儀(BD生物科學)分析細胞周期分布。

1.8細胞凋亡測定:根據(jù)制造商的方案,使用膜聯(lián)蛋白V-熒光素異硫氰酸酯(FITC)/碘化丙啶(PI)細胞凋亡檢測試劑盒(KeyGEN生物技術(shù),中國江蘇)檢測細胞凋亡,用miR-155模擬物,miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉(zhuǎn)染后,用PBS洗滌細胞并重新懸浮在500μL結(jié)合緩沖液中,加入5μL膜聯(lián)蛋白V-FITC和5μL PI后,將細胞懸液在黑暗中孵育15min,用FACScalibur流式細胞儀分析細胞。

1.9蛋白質(zhì)印跡分析:將總細胞樣品用冰冷的PBS洗滌兩次,并在裂解緩沖液中孵育10min。使用BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒(中國上海Sangon Biotech)測定蛋白質(zhì)濃度。使用SDS-PAGE分離等量的樣品蛋白(20μg)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂牛奶試劑封閉膜,后與一抗在4℃下孵育12h。通過與辣根過氧化物酶偶聯(lián)二抗(中國上海Sangon Biotech)孵育來檢測蛋白質(zhì)條帶,并用增強型化學發(fā)光試劑(中國江蘇Beyotime)可視化。

1.10熒光素酶報告基因測定:采用熒光素酶報告基因檢測miR-155是否直接與HuR的3′UTR結(jié)合,正如TargetScan(http://www.targetscan.org/)預測的那樣,含有野生型(WT)或突變型(MUT)miR-155結(jié)合位點或缺乏miR-155結(jié)合位點(DEL)的HuR mRNA片段分別克隆到pMIR-REPORT熒光素酶報告載體中。將HCT-116細胞接種到24孔板中,將0.2μg熒光素酶報告質(zhì)粒WT、MUT或DEL與0.2μg β-半乳糖苷酶對照質(zhì)粒(Ambion)一同接種,使用Lipofectamine 2000試劑將20 pmolmiR-155模擬物或陰性模擬物對照共轉(zhuǎn)染到HCT-116細胞中,在轉(zhuǎn)染后48h,根據(jù)制造商的方案使用熒光素酶測定系統(tǒng)(Promega Corp.)測量熒光素酶活性。

2 結(jié) 果

2.1miR-155的上調(diào)對結(jié)腸癌細胞的增殖和細胞周期作用:用miR-155模擬物轉(zhuǎn)染后,通過RT-qPCR檢測miR-155的水平,結(jié)果表明與對照組比較,用miR-155模擬物轉(zhuǎn)染后,miR-155水平升高;用miR-155模擬物轉(zhuǎn)染后,通過MTT測定檢測結(jié)腸癌細胞的活力。結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染miR-155模擬物72h后細胞活力增加。菌落形成試驗結(jié)果顯示,miR-155模擬物轉(zhuǎn)染后,菌落數(shù)為90±2.6,顯著高于模擬物陰性對照轉(zhuǎn)染的細胞(60.6±5.1),證明miR-155模擬物促進了結(jié)腸癌細胞的增殖。用miR-155模擬物或其相應的陰性對照轉(zhuǎn)染后檢測細胞周期分布,流式細胞術(shù)分析顯示,用miR-155模擬物轉(zhuǎn)染后,G1期細胞由67.83%降至54.41%,但S期細胞由23.78%增至36.16%,結(jié)果表明miR-155模擬物增加了S期細胞的百分比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1A-D。

圖1 miR-155的上調(diào)對結(jié)腸癌細胞的增殖和細胞周期作用

圖2 miR-155的上調(diào)對結(jié)腸癌細胞的遷移和凋亡作用

2.2miR-155的上調(diào)對結(jié)腸癌細胞的遷移和凋亡作用:細胞凋亡測定,轉(zhuǎn)染miR-155模擬物陰性對照后,早期凋亡率為13.83±0.76%,晚期凋亡率為2.51±0.31%,用miR-155模擬物轉(zhuǎn)染后,早期凋亡率降至3.72±0.59%,晚期凋亡率降至1.65±0.14%,結(jié)果表明miR-155模擬物抑制結(jié)腸癌細胞的凋亡,使用傷口愈合測定法評估轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌細胞的遷移能力,轉(zhuǎn)染有模擬物陰性對照的細胞的遷移率為0.148±0.015,而轉(zhuǎn)染miR-155模擬物的細胞的遷移率為0.265±0.18,結(jié)果表明miR-155模擬物促進了結(jié)腸癌細胞的遷移,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2A-D。

2.3miR-155的下調(diào)對結(jié)腸癌細胞的增殖和細胞周期作用:用miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染后,通過RT-qPCR檢測miR-155的水平,結(jié)果表明與陰性對照轉(zhuǎn)染細胞比較,用miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染后miR-155降低;檢測結(jié)腸癌細胞的細胞活力和集落形成能力。結(jié)果表明,與轉(zhuǎn)染抑制劑陰性對照的細胞相比,miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染后結(jié)腸癌細胞的活力受到抑制,菌落數(shù)量從73.67±4.16減少到48.33±3.05;用miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉(zhuǎn)染后檢測細胞周期分布,結(jié)果表明轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑后,G1期細胞百分比從57.97%增加到72.54%,但S期細胞百分比從30.81%下降到17.07%,表明miR-155抑制劑增加了G1期細胞的百分比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3A-D。

圖3 miR-155的下調(diào)對結(jié)腸癌細胞的增殖和細胞周期作用

圖4 miR-155的下調(diào)對結(jié)腸癌細胞的遷移和凋亡作用

2.4miR-155的下調(diào)對結(jié)腸癌細胞的遷移和凋亡作用:用miR-155抑制劑或其相應的陰性對照轉(zhuǎn)染后進行細胞凋亡測定,轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑陰性對照后,早期凋亡率為(6.49±0.90)%,晚期凋亡率為(2.88±0.15)%,而miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染后,早期凋亡率提高至(21.03±1.17)%,晚期凋亡率提高至(5.92±0.29)%,結(jié)果表明miR-155抑制劑誘導結(jié)腸癌細胞凋亡,用miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染后檢測結(jié)腸癌細胞的遷移能力,轉(zhuǎn)染抑制劑陰性對照的細胞遷移率為0.178±0.018,而轉(zhuǎn)染miR-155抑制劑的細胞遷移率為0.076±0.025,傷口愈合試驗表明miR-155抑制劑減少了結(jié)腸癌細胞的遷移,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4A-D。

2.5miR-155-5p與HuR的作用:通過RT-qPCR和蛋白質(zhì)印跡分析檢測HuR水平,RT-qPCR結(jié)果表明,用miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染后HuR的mRNA水平降至(25.33±3.05)%,轉(zhuǎn)染miR-155模擬物后,HuR的mRNA水平升高至陰性對照組(3.51±0.27)倍。用miR-155抑制劑轉(zhuǎn)染后HuR蛋白水平降至(14±5.29)%,轉(zhuǎn)染miR-155模擬物后HuR蛋白水平升高至陰性對照組(1.69±0.27)倍,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)果表明,HuR受miR-155調(diào)控,為了確定HuR是否是miR-155的直接靶標,進行了熒光素酶報告基因測定。熒光素酶報告基因測定,與WT加miR-155模擬物共轉(zhuǎn)染導致相對熒光素酶活性顯著降低至WT加模擬物陰性對照組的(61±17)%,轉(zhuǎn)染MUT加miR-155模擬物的細胞的相對熒光素酶活性與MUT加模擬物陰性對照之間沒有顯著差異,轉(zhuǎn)染DEL加miR-155模擬物的細胞和DEL加模擬物陰性對照的細胞的相對熒光素酶活性之間也沒有顯著差異,這些結(jié)果表明,miR-155與HuR的3′UTR結(jié)合,并且HuR是miR-155的直接靶標。見圖5A-D。

圖5 miR-155-5p與HuR的作用

3 討 論

目前的研究表明結(jié)直腸癌中miRNA的不同表達水平可參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和進展,并可作為結(jié)直腸癌診斷和預后的生物標志物[3]。在本研究中,探討了miR-155對結(jié)腸癌細胞的影響。發(fā)現(xiàn)miR-155的上調(diào)可促進結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移,同時促進細胞周期進程并抑制細胞凋亡。相反,發(fā)現(xiàn)miR-155的下調(diào)可抑制結(jié)腸癌細胞的增殖和遷移,引起細胞周期停滯并誘導細胞凋亡。進一步的研究表明,HuR是miR-155的直接靶標,miR-155可能通過它對增殖、遷移、細胞周期和細胞凋亡產(chǎn)生影響。

在許多癌癥中,miR-155促進增殖,遷移和分化,并抑制細胞凋亡,但在部分癌癥中,miR-155抑制增殖和遷移,并促進細胞凋亡[9]。因此,miR-155在不同癌細胞類型中充當腫瘤促進或腫瘤抑制因子。在本研究中,發(fā)現(xiàn)miR-155在結(jié)腸癌細胞中充當腫瘤因子。據(jù)報道,miR-155在結(jié)腸癌中過度表達,但miR-155在結(jié)腸癌中的作用仍有待完全闡明[5]。研究發(fā)現(xiàn)基于納米顆粒的抗miR-155療法在miR-155依賴性淋巴瘤小鼠模型中具有出色的治療效果[10]。miR-155通常與預后不良相關(guān),可能成為結(jié)直腸癌治療的關(guān)鍵靶點。在本研究中,發(fā)現(xiàn)miR-155在結(jié)腸癌細胞中充當腫瘤因子,促進其增殖,細胞周期和遷移,但抑制細胞凋亡。部分研究結(jié)果與本研究的結(jié)果一致,miR-155與結(jié)腸癌細胞的增殖,遷移和侵襲有關(guān)[5]。miR-155可能是結(jié)腸癌治療的一個有前途的治療靶點。

HuR是一種癌癥相關(guān)RNA結(jié)合蛋白(RBP),是胚胎致死性異常視力(ELAV)家族的成員,它通過與3'非翻譯區(qū)(UTR)內(nèi)的保守富AU元件(ARE)結(jié)合來增加mRNA的穩(wěn)定性,從而防止基因降解[11]。HuR表達在不同腫瘤中均上調(diào),包括乳腺癌、結(jié)直腸癌、胃癌和前列腺癌,與臨床病理參數(shù)先進、腫瘤相關(guān)蛋白表達、生存率低、預后差相關(guān)。CRC相關(guān)研究表明,HuR通過靶向細胞質(zhì)中的RNA上調(diào)并促進結(jié)腸癌生長[12]。此外,細胞質(zhì)中HuR蛋白的增加與T分期相關(guān),重要的是,HuR過表達增加了裸鼠模型中結(jié)腸癌細胞的生長。此外,miR-22作為一種腫瘤抑制性miRNA,直接與HuR結(jié)合并下調(diào)其表達以抑制CRC的增殖和遷移能力,以及異種腫瘤生長[13]。在本研究中,使用RT-qPCR,蛋白質(zhì)印跡分析和熒光素酶報告基因測定將HuR確定為miR-155的新靶標。

本研究指出,miR-155可促進增殖,阻斷S期細胞周期,促進結(jié)腸癌細胞遷移,抑制其凋亡。HuR的生物學功能與miR-155一致,被確定為miR-155的目標。本研究結(jié)果表明,miR-155通過靶向HuR在結(jié)腸癌細胞中發(fā)揮腫瘤作用,miR-155可能成為結(jié)腸癌的有希望的治療靶點。