張萌，李亞蕾

（寧夏大學(xué)食品與葡萄酒學(xué)院 銀川 750021）

肉色及其穩(wěn)定性是影響消費(fèi)者購(gòu)買(mǎi)肉品的重要因素之一[1]。宰后生鮮肉肉色的變化機(jī)制以及護(hù)色工藝一直是肉類(lèi)科學(xué)的研究熱點(diǎn)。當(dāng)動(dòng)物宰后充分放血時(shí)，肉品色澤主要由肌紅蛋白含量和所呈現(xiàn)的化學(xué)狀態(tài)決定[2]。隨著機(jī)體宰后供氧的切斷，肉品色澤受到肌肉耗氧量的影響。氧合肌紅蛋白（Oxymyoglobin，OxyMb）隨著機(jī)體耗氧量的增加轉(zhuǎn)化成脫氧肌紅蛋白（Deoxymyoglobin，DeoMb），而脫氧肌紅蛋白更易被氧化成導(dǎo)致肉色褐變的高鐵肌紅蛋白（Metmyoglobin，MetMb），高鐵肌紅蛋白的積累是造成肉色劣變的主要原因[3]。蛋白質(zhì)水平的變化會(huì)對(duì)肉色產(chǎn)生影響。傳統(tǒng)的肉色研究方法不能反映內(nèi)部蛋白質(zhì)的變化，而采用蛋白質(zhì)組學(xué)可以從蛋白變化角度探究肉色形成機(jī)制和外界因素影響肉色的途徑。

蛋白質(zhì)組學(xué)通過(guò)大規(guī)模篩選技術(shù)，對(duì)組織或細(xì)胞中所有蛋白進(jìn)行定量、定性，確定其結(jié)構(gòu)以及生物化學(xué)和細(xì)胞功能，可從整體上揭示蛋白質(zhì)功能及蛋白質(zhì)間的相互作用。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)已被應(yīng)用于肉品科學(xué)領(lǐng)域，在肉品品質(zhì)研究方面也取得許多進(jìn)展[4]。羅輝等[5]通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)發(fā)現(xiàn)隨著牛肉貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，不同差異表達(dá)蛋白質(zhì)對(duì)能量代謝存在不同程度的調(diào)控作用，且能量物質(zhì)的變化對(duì)肉品質(zhì)產(chǎn)生影響。Hughes 等[6-7]采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究不同牛種、不同肌肉部位的肌原纖維，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)蛋白豐度的變化影響光線的吸收和散射，從而改變?nèi)馍oseph 等[8]采用蛋白質(zhì)組學(xué)分析肉色穩(wěn)定性不同的牛背最長(zhǎng)肌和腰大肌中的肌漿蛋白組差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肉色穩(wěn)定的背最長(zhǎng)肌中氧化還原酶和伴侶蛋白的含量比肉色不穩(wěn)定的腰大肌高?，F(xiàn)有研究多集中于不同貯藏期影響肉色穩(wěn)定性的因素，宰后貯藏期間肉色褐變相關(guān)生物標(biāo)志物鑒定等，然而，貯藏期間能量關(guān)鍵代謝通路——氧化磷酸化在肉色形成過(guò)程中的代謝作用尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以25 月齡秦川牛肉背最長(zhǎng)肌為研究對(duì)象，測(cè)定4 ℃貯藏0，4，8 d 時(shí)其pH 值、肉色和肌紅蛋白相對(duì)含量的變化。基于4D-非標(biāo)記蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究不同貯藏過(guò)程中氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化情況，確定其在肉色形成過(guò)程中的作用，為宰后牛肉品質(zhì)控制技術(shù)以及延長(zhǎng)肉品貨架期提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛肉樣品，采集于寧夏尚農(nóng)生物科技有限公司。

磷酸三鈉、尿素、磷酸（85%）、氫氧化鈉均為分析純級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水氯化鎂、抗壞血酸鈉、鹽酸胍、考馬斯亮藍(lán)R250、2-硝基苯甲酸（DTNB）、乙二醇雙（2-氨基乙基）醚（EGTA）均為分析純級(jí)，上海麥克林生化科技有限公司；2，4-二硝基苯肼（2，4-DNPH）分析純級(jí)，北京索萊寶科技有限公司；乙醇（95%）、氯化鈉、十二烷基硫酸鈉、氯化鉀、乙二胺四乙酸（EDTA）均為分析純級(jí)，西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SJ-3F 便攜式pH 計(jì)，上海德圖儀器國(guó)際貿(mào)易有限公司；CR-400 便攜式色差儀，日本柯尼卡美能達(dá)公司；UV-1200 紫外分光光度計(jì)，上海美譜達(dá)儀器有限公司；TG16W 型離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；LC-11L 拍打式無(wú)菌均質(zhì)器，上海凈信事業(yè)發(fā)展有限公司；JXFSTPRP-CL全自動(dòng)樣品冷凍研磨儀，上海凈信事業(yè)發(fā)展有限公司；ImageScanner 掃描儀，美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集 選取3 頭體質(zhì)量相近的25 月齡秦川公牛，屠宰后用滅菌刀取下右側(cè)背最長(zhǎng)肌，每個(gè)背最長(zhǎng)肌樣品平均分成3 份，共計(jì)9 個(gè)樣本。編號(hào)后置于聚乙稀薄膜內(nèi)，儲(chǔ)存于風(fēng)速3 m/s，相對(duì)濕度80%，4 ℃條件下。采集貯藏0，4，8 d 的樣品約200 g 用于測(cè)定pH 值、肉色及肌紅蛋白相對(duì)含量，采集不同貯藏時(shí)間的樣品各200 mg，迅速置于液氮中放置2 h 后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，以備蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

1.3.2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析 采用張杏亞等[9]的方法，從牛肉中提取總蛋白，取上清液測(cè)定蛋白含量，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。4D-LFQ 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析委托杭州景杰生物科技有限公司，運(yùn)用MaxQuant（杭州景杰生物科技有限公司）軟件系統(tǒng)獲得蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)。基因本體注釋?zhuān)℅ene ontology，GO）采用InterProScan（v.5.14-53.0）軟件系統(tǒng)獲得。京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通過(guò)KEGG 網(wǎng)站通路層級(jí)分類(lèi)方法將這些通路進(jìn)行分類(lèi)。InterPro（對(duì)蛋白序列的家族分類(lèi)、結(jié)構(gòu)域和特殊位點(diǎn)的預(yù)測(cè)等功能分析提供資源）數(shù)據(jù)庫(kù)用于分析差異表達(dá)蛋白的功能結(jié)構(gòu)域的富集情況。

1.3.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.3.1 pH 測(cè)定 分別在貯藏期第0，4，8 天用便攜式pH 計(jì)直接測(cè)量每塊牛排的pH 值，共測(cè)定3 次，結(jié)果取平均值。

1.3.3.2 肉色的測(cè)定 冷卻秦川牛肉貯藏第0，4，8 天，用便攜式色差儀測(cè)定L*（亮度值）、a*（紅度值）與b*（黃度值），儀器在測(cè)量前用白盤(pán)進(jìn)行校準(zhǔn)，提供3 個(gè)生物副本2.5 cm×2.5 cm×2.5 cm，每個(gè)副本在肉表面的6 個(gè)位置測(cè)量，取平均值。

1.3.3.3 肌紅蛋白相對(duì)含量的測(cè)定 參考Tang等[10]的方法并適當(dāng)修改。首先，制備磷酸鹽緩沖液（0.04 mol/L，pH 6.8）和待測(cè)肉樣（5 g），樣品加入25 mL 緩沖液中，混合均勻；其次，在室內(nèi)使用拍打式無(wú)菌均質(zhì)器（12 次/s）均質(zhì)10 min，所得溶液在冰箱中儲(chǔ)存1 h，離心15 min（4 ℃，6 000×g），過(guò)濾上清液；最后，在503，525，557 nm 和582 nm 波長(zhǎng)處讀取濾液的吸光度，磷酸鹽緩沖液作空白。

3 種肌紅蛋白含量的測(cè)定均采用紫外分光光度法。在582 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定脫氧肌紅蛋白的吸光值；分別在557，503 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白的吸光值；在525 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定肌紅蛋白總量的吸光值。3 種肌紅蛋白相對(duì)含量計(jì)算公式：

式中，R1=A582/A525，R2=A557/A525，R3=A503/A525。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用Excel 軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，采用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及相關(guān)性分析，采用Origin 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 肌肉的pH 值、肉色及肌紅蛋白相對(duì)含量

由表1 可知，宰后0～8 d，秦川牛背最長(zhǎng)肌pH值呈先下降后上升的趨勢(shì)（P〈0.05），在第4 天達(dá)到最低點(diǎn)5.43。宰后成熟0～8 d 內(nèi)牛肉的pH 呈先下降后上升的趨勢(shì)，這一變化趨勢(shì)與劉佳東等[11]對(duì)黃牛肉的研究結(jié)果一致。國(guó)內(nèi)外諸多學(xué)者研究表明家畜屠宰后初期整體下降幅度大于上升幅度，可能是由于宰后機(jī)體氧氣供應(yīng)切斷，機(jī)體通過(guò)無(wú)氧糖酵解產(chǎn)能的同時(shí)產(chǎn)生乳酸；此外宰后ATP水解產(chǎn)生磷酸，這些酸性物質(zhì)長(zhǎng)期積累無(wú)法分解與轉(zhuǎn)運(yùn)，使得肌肉組織的pH 值迅速下降[12]。而pH值在4～8 d 升高可能是由于分解代謝消耗了肌肉中所積累的酸性物質(zhì)[13]。

表1 牛肉宰后貯藏過(guò)程中肌肉pH、肉色的變化Table 1 The changes of muscle pH and meat color during postmortem storage of beef

肉色是評(píng)價(jià)肉品質(zhì)最直觀的指標(biāo)之一，決定肉品的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其主要由肌紅蛋白3 種衍生態(tài)的相對(duì)含量和理化狀態(tài)決定[14]。貯藏過(guò)程中秦川牛背最長(zhǎng)肌色澤變化如表1 所示，L*值表示牛肉的亮度值，0～8 d L*值呈先升高后降低的趨勢(shì)（P〈0.05），初期的上升可能是由于貯藏背最長(zhǎng)肌汁液滲出較多，表面水分增加光的反射率導(dǎo)致L*值升高[15]；而4～8 d 肉色的下降是由于肌紅蛋白被不可逆地轉(zhuǎn)化成高鐵肌紅蛋白致肉色變暗[16]。本研究結(jié)果與盧驍[17]的一致。a*表示牛肉的紅度值，是評(píng)價(jià)肉色變化的重要指標(biāo)。貯藏過(guò)程中a*值呈下降趨勢(shì)（P〈0.05），這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間貯藏使牛肉的pH 值升高，細(xì)胞環(huán)境的改變，也使氧合肌紅蛋白難以形成；且ATP 的降低導(dǎo)致還原反應(yīng)無(wú)法發(fā)生，使脫氧肌紅蛋白被不可逆地氧化成暗褐色的高鐵肌紅蛋白，因此紅度值下降。本研究結(jié)果與Wu 等[18]一致。b*值表示牛肉的黃度值，如表1所示，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，牛肉的b*值呈上升趨勢(shì)（P〈0.05）。這可能是由于長(zhǎng)時(shí)間貯藏使肌肉與脂肪充分接觸，肌肉中的脂肪被不斷氧化，從而使b*值增加。本研究結(jié)果與劉佳東等[11]的一致。

本研究中貯藏8 d 內(nèi)肌紅蛋白相對(duì)含量的變化如圖1 所示。牛肉中氧合肌紅蛋白顯著下降（P〈0.05），高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量顯著上升（P〈0.05），脫氧肌紅蛋白變化不顯著?；铙w內(nèi)，脫氧肌紅蛋白與氧合肌紅蛋白、高鐵肌紅蛋白可相互轉(zhuǎn)化，脫氧肌紅蛋白在有氧條件下轉(zhuǎn)化為氧合肌紅蛋白，氧合肌紅蛋白在有氧條件下轉(zhuǎn)化為高鐵肌紅蛋白，而高鐵肌紅蛋白還原為氧合肌紅蛋白和脫氧肌紅蛋白是需要一定條件的，比如能量的維系以及細(xì)胞環(huán)境的穩(wěn)定。本研究中高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量顯著上升，這可能是由于宰后成熟時(shí)間延長(zhǎng)，pH降低導(dǎo)致細(xì)胞環(huán)境發(fā)生變化，同時(shí)肌肉中氧含量降低，ATP 大量的消耗無(wú)法維持還原反應(yīng)的發(fā)生。羅輝等[19]研究表明在0～8 d 貯藏過(guò)程中ATP 不可逆地降解。高鐵肌紅蛋白不能被還原，導(dǎo)致其含量持續(xù)上升。這些因素綜合影響肌紅蛋白氧化-還原反應(yīng)過(guò)程，最終導(dǎo)致肉色變差。

圖1 冷鮮牛肉貯藏過(guò)程中3 種形式肌紅蛋白的相對(duì)含量Fig.1 Relative contents of three types of myoglobin in chilled beef during storage

2.2 蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析

對(duì)不同貯藏期秦川牛背最長(zhǎng)肌蛋白質(zhì)表達(dá)模式進(jìn)行樣品相關(guān)性分析，以驗(yàn)證蛋白質(zhì)組學(xué)樣本采集及試驗(yàn)設(shè)置的合理性，結(jié)果如圖2 所示。貯藏時(shí)間可將樣本很好地區(qū)分開(kāi)。同一貯藏時(shí)間樣本間差異不明顯，不同貯藏時(shí)間樣本間差異明顯。這一結(jié)果充分表明本試驗(yàn)樣品采集合理，蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)可靠，可滿足后續(xù)分析要求。

圖2 不同貯藏期樣本蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果的組間相關(guān)性分析Fig.2 Intergroup correlation analysis of proteomic results of samples with different storage periods

2.2.1 差異蛋白質(zhì)篩選 以變化倍數(shù)（Fold Change，F(xiàn)C）〉1.5 或〈1/1.5，且P〈0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4 d 對(duì)比0 d 組共鑒定出15 個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)，其中6 個(gè)為顯著上調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)，9 個(gè)為顯著下調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)（圖3a）。8 d 對(duì)比4 d 組共鑒定出15 個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)，其中6 個(gè)為顯著上調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)，9 個(gè)為顯著下調(diào)表達(dá)的差異蛋白質(zhì)（圖3b）。

圖3 不同貯藏期牛肉差異蛋白質(zhì)的火山圖Fig.3 Volcano gram of differential proteins in beef at different storage periods

2.2.2 差異蛋白質(zhì)生物信息學(xué)分析

2.2.2.1 Gene Ontology（GO）功能注釋富集分析通過(guò)GO 注釋對(duì)所篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行生物信息分析，從生物過(guò)程（Biological Process，BP）、分子功能（Molecular Function，MF）、細(xì)胞組分（Cellular Components，CC）3 個(gè)方面解析其功能，結(jié)果表明：4 d 對(duì)比0 d 組顯著富集到137 個(gè)BP，63 個(gè)CC，35 個(gè)MF；8 d 對(duì) 比4 d 組顯著 富集到83 個(gè)BP，58 個(gè)CC，49 個(gè)MF。

由圖4a 可知，宰后貯藏0～4 d，差異蛋白質(zhì)主要涉及的生物過(guò)程包括Rho-依賴(lài)蛋白負(fù)調(diào)控，高爾基間池囊泡介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)，Rho-依賴(lài)蛋白絲氨酸/蘇氨酸的調(diào)控，微管正端調(diào)節(jié)，ATP 生物合成過(guò)程，蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶的調(diào)節(jié)等。細(xì)胞組成主要包括交界肌漿網(wǎng)膜，線粒體質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)ATP 合酶復(fù)合物，高爾基膜的外部成分，大分子復(fù)合物，細(xì)胞內(nèi)部成分等。分子功能主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合，鈣黏蛋白結(jié)合，細(xì)胞黏附分子結(jié)合，硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶活性，果糖二磷酸醛縮酶活性，寡糖轉(zhuǎn)移酶活性等。以上結(jié)果表明，牛肉屠宰后初期構(gòu)成肌肉組織的交界肌漿網(wǎng)膜、連接膜復(fù)合體、膜結(jié)合囊泡等發(fā)生變化。這些變化可能引起細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氧含量降低，細(xì)胞的主動(dòng)運(yùn)輸發(fā)生障礙，細(xì)胞內(nèi)能量無(wú)法正常交換，能量代謝發(fā)生紊亂，使褐色的高鐵肌紅蛋白還原反應(yīng)無(wú)法進(jìn)行，從而引起肉品色澤的變化。

圖4 不同貯藏期牛肉差異蛋白質(zhì)的GO 注釋?zhuān)═OP 10）Fig.4 Gene ontology annotation of differential proteins of beef at different storage periods（TOP 10）

由圖4b 可知，宰后貯藏4～8 d，差異蛋白質(zhì)主要涉及的生物過(guò)程包括組成型分泌途徑、核苷酸切除修復(fù)的調(diào)控、肉堿生物合成過(guò)程、轉(zhuǎn)鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)、內(nèi)吞循環(huán)的調(diào)節(jié)等。在細(xì)胞組成中主要包括細(xì)胞外膜結(jié)合的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)復(fù)合物、胞外外泌體、細(xì)胞外囊泡、細(xì)胞外器等。在分子功能中主要包括蛋白質(zhì)結(jié)合、氨基丁醛脫氫酶活性、4-三甲基氨基丁醛脫氫酶活性、未折疊蛋白結(jié)合、磷酸蘇氨酸結(jié)合等。以上結(jié)果表明，牛肉貯藏4 d 后，除細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，差異表達(dá)蛋白質(zhì)還涉及內(nèi)吞循環(huán)調(diào)節(jié)和在酸性pH 的細(xì)胞反應(yīng)等代謝過(guò)程。這些代謝過(guò)程的變化反映細(xì)胞內(nèi)金屬離子穩(wěn)定性受到破壞和細(xì)胞環(huán)境的改變使細(xì)胞正常的能量代謝受到影響，其可能直接影響肌紅蛋白及其衍生物的占比，使高鐵肌紅蛋白逐漸累積，肉色發(fā)生褐變。

2.2.2.2 京都基因與基因組百科全書(shū)（KEGG）途徑分析 通過(guò)KEGG pathway 對(duì)所篩選的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行通路注釋分析，結(jié)果表明，4 d 對(duì)比0 d組顯著富集到3 個(gè)KEGG 通路，8 d 對(duì)比4 d 組顯著富集到17 個(gè)KEGG 通路。由圖5a 可知，宰后貯藏0～4 d 差異蛋白質(zhì)主要參與的KEGG 通路包括氧化磷酸化、N-聚糖的生物合成和胰島素信號(hào)通路。由圖5b 可知，宰后貯藏4～8 d 差異蛋白質(zhì)主要參與的KEGG 通路包括抗壞血酸和醛糖酸鹽代謝、丙酮酸代謝、氧化磷酸化、脂肪酸代謝、組氨酸代謝等。這些代謝過(guò)程可能通過(guò)影響宰后能量代謝方式，使高鐵肌紅蛋白還原反應(yīng)的發(fā)生無(wú)法進(jìn)行，間接影響肉品的色澤變化。同時(shí)，氧化磷酸化為0～4 d 和4～8 d 共同富集到的顯著差異代謝通路，并且它對(duì)能量代謝有顯著影響，而能量代謝在宰后成熟過(guò)程中對(duì)肉品質(zhì)變化具有重要的調(diào)控作用。本研究以氧化磷酸化代謝通路為重點(diǎn)，探究氧化磷酸化代謝通路中關(guān)鍵蛋白在肉色形成中的重要作用。

圖5 不同貯藏期牛肉差異蛋白質(zhì)的KEGG 通路注釋Fig.5 KEGG pathway annotation of differential proteins in beef at different storage periods

2.3 氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化

為明確氧化磷酸化代謝通路對(duì)宰后肉色的作用，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析鑒定氧化磷酸化通路中關(guān)鍵蛋白質(zhì)的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：貯藏4 d 與0 d 對(duì)比，鑒定出1 個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)富集于氧化磷酸化代謝通路，為上調(diào)表達(dá)差異蛋白質(zhì)。8 d 與4 d 對(duì)比，鑒定出2 個(gè)顯著差異蛋白質(zhì)富集于氧化磷酸化代謝通路，均為下調(diào)表達(dá)差異蛋白質(zhì)（表2）。

表2 不同貯藏期氧化磷酸化代謝通路中富集的差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 2 Differentially expressed proteins enriched in oxidative phosphorylation signaling pathways at different storage stages

ATP5F1D 即ATP 合酶亞基δ，它是線粒體ATP 合成酶的一個(gè)亞基，在質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)和ATP 合成的偶聯(lián)過(guò)程中起著重要的作用[20]。ATP 合酶參與ATP 的合成與消耗，因此其直接影響機(jī)體細(xì)胞的供能和耗能，也反映細(xì)胞中能量需求情況和三羧酸循環(huán)的產(chǎn)能情況[21]。本試驗(yàn)中ATP5F1D 在0～4 d 處于上調(diào)表達(dá)，8 d 與4 d 比較其表達(dá)量變化不顯著，表明直至宰后8 d，ATP5F1D 表達(dá)量仍處于較高水平，這可能反映宰后短期內(nèi)組織/細(xì)胞的自我保護(hù)機(jī)制。組織/細(xì)胞通過(guò)提高ATP5F1D 表達(dá)量，滿足其正常代謝所需能量水平，然而，呼吸作用及血液循環(huán)的停止導(dǎo)致細(xì)胞環(huán)境發(fā)生改變，因此，組織/細(xì)胞無(wú)法通過(guò)提高蛋白質(zhì)的表達(dá)量促進(jìn)三羧酸循環(huán)，以達(dá)到正常產(chǎn)能的目的。其上調(diào)可能引起宰后能量代謝的轉(zhuǎn)換。同時(shí)，ATP5F1D 表達(dá)量升高可能引起細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡。張同剛等[22]研究表明，動(dòng)物屠宰后其機(jī)體細(xì)胞氧氣供能被切斷，細(xì)胞內(nèi)氧含量逐漸降低，會(huì)引起肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)的失衡，導(dǎo)致線粒體損傷，從而使后續(xù)pH 持續(xù)下降以及ATP 持續(xù)降解，高鐵肌紅蛋白被不可逆地轉(zhuǎn)換，肉色變差。

NDUFA4 是細(xì)胞色素c 氧化酶（COX，complex IV）的一個(gè)副亞基，它在NADH 和呼吸鏈間的電子傳遞中起著重要的生理作用，維持和促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)生物氧化的進(jìn)行，并最終推動(dòng)ATP 合成以維持正常生命活動(dòng)[23]。而細(xì)胞色素c 氧化酶具有質(zhì)子泵的作用，可將H+由基質(zhì)抽提到膜間隙，同時(shí)可通過(guò)血紅素中鐵原子的氧化還原變化，傳遞給還原的氧，形成水。Purslow 等[24]研究表明宰后大量的H+會(huì)引起金屬離子超載，從而激活蛋白水解酶，由此引起肌肉結(jié)構(gòu)被水解，肌肉小片化程度加劇，可能會(huì)導(dǎo)致光在肌肉結(jié)構(gòu)中的反射與折射發(fā)生變化，從而影響肉色。本試驗(yàn)中NDUFA4 在4～8 d 呈下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，這可能從側(cè)面說(shuō)明細(xì)胞環(huán)境和所需能量條件發(fā)生改變，導(dǎo)致細(xì)胞增殖減弱，細(xì)胞凋亡進(jìn)入后期階段[25]。

NDUFB5 是線粒體膜呼吸鏈NADH 脫氫酶I的副亞基，參與線粒體內(nèi)膜上的呼吸作用，對(duì)電子從NADH 傳遞給輔酶Q 有催化作用[26]。調(diào)控NADH 脫氫酶的活性，NADH 脫氫酶可促使穩(wěn)定肉色的甲基血紅蛋白、高鐵肌紅蛋白、細(xì)胞色素b5 和細(xì)胞色素c 含量降低[27]。4～8 d 其表達(dá)量下調(diào)，可能是因?yàn)檠貉h(huán)終止后，細(xì)胞內(nèi)氧含量降低，有氧產(chǎn)能過(guò)程發(fā)生改變，使能量供給方式轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒獾倪^(guò)程，不利于維持肉色穩(wěn)定。不同貯藏期氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化表明，屠宰后初期牛肉肌細(xì)胞內(nèi)可能因H+跨膜交換而引起離子穩(wěn)態(tài)的失衡，激活水解肌肉結(jié)構(gòu)的內(nèi)源酶，引起肌肉纖維小片化，導(dǎo)致光在結(jié)構(gòu)中的反射與折射發(fā)生變化[24]。同時(shí)，能量代謝方式的改變引起pH 值降低，氧化還原反應(yīng)不能逆向發(fā)生，褐色的高鐵肌紅蛋白無(wú)法被還原，因此，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肉色變差。

2.4 貯藏期間肌紅蛋白表達(dá)量的變化

肌紅蛋白（Mb）是存在于肌肉纖維肌漿中的一種蛋白質(zhì)，決定宰后肉的顏色狀態(tài)[28]。秦川牛肉宰后0～4 ℃貯藏過(guò)程中肌紅蛋白表達(dá)量變化如表3 所示。貯藏0～4 d 時(shí)，肌紅蛋白表達(dá)量為上調(diào)表達(dá)，可能是因?yàn)檠鯕夂肯陆担辜〖t蛋白在細(xì)胞水平通過(guò)提高表達(dá)量適應(yīng)周邊環(huán)境[29]。4～8 d 貯藏中，肌紅蛋白表達(dá)量為下調(diào)表達(dá)。有研究表明肌紅蛋白表達(dá)水平受氧氣水平和線粒體鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)控，因此貯藏后期的下調(diào)可能是由于含氧量降低使肌紅蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；同時(shí)，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，氧含量降低也會(huì)使肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，造成線粒體功能受損，ATP 持續(xù)發(fā)生降解，最終導(dǎo)致肌紅蛋白表達(dá)量下降[3，30]。

表3 秦川牛肉貯藏過(guò)程中肌紅蛋白表達(dá)量變化Table 3 Changes in myoglobin expression in meat of Qinchuan cattle during postmortem storage

表4 不同貯藏時(shí)間牛肉pH、肉色、肌紅蛋白相對(duì)含量與ATP5F1D、NDUFA4 及NDUFB5 的相關(guān)性分析Table 4 Correlation analysis of pH，meat color，myoglobin relative content and ATP5F1D，NDUFA4 and NDUFB5 in beef at different storage time

2.5 不同貯藏時(shí)間pH、肉色、肌紅蛋白相對(duì)含量以及氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白的相關(guān)性分析

通過(guò)Pearson 相關(guān)性分析確定氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)與秦川牛背最長(zhǎng)肌色澤的關(guān)系。牛肉背最長(zhǎng)肌pH 與肉色、肌紅蛋白相對(duì)含量均呈顯著相關(guān)性，與ATP5F1D、NDUFB5 呈負(fù)相關(guān)。a*值與NDUFB5 呈顯著正相關(guān)（P〈0.05），b*值與NDUFB4 呈顯著負(fù)相關(guān)（P 〈 0.05），L*值與DeoMb 相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)（P 〈 0.01），與OxyMb 相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P 〈 0.01），與ATP5F1D 呈極顯著正相關(guān)（P〈0.01）。MetMb 相對(duì)含量與NDUFB5 呈顯著負(fù)相關(guān)（P〈0.05）。相關(guān)性分析表明，氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白ATP5F1D、NDUFB5 和NDUFA4 通過(guò)引起宰后能量代謝方式轉(zhuǎn)變對(duì)肉色產(chǎn)生顯著影響。

相關(guān)性分析表明，氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白對(duì)pH、肉色以及肌紅蛋白相對(duì)含量均有不同程度的影響。牛肉背最長(zhǎng)肌pH 與肉色及其3 種肌紅蛋白相對(duì)含量均呈顯著相關(guān)，可能是因?yàn)樵缀蠊┭醣磺袛?，?xì)胞內(nèi)環(huán)境發(fā)生改變，酸性物質(zhì)長(zhǎng)期積累而無(wú)法代謝。有研究表明pH 是影響宰后成熟過(guò)程中肉色形成的重要指標(biāo)之一[2]。而ATP5F1D、NDUFB5 與pH 呈負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)槟芰看x方式的轉(zhuǎn)變，ATP5F1D、NDUFB 通過(guò)影響肌肉pH 值，間接影響肌紅蛋白氧化還原狀態(tài)。a*值與NDUFB5 呈顯著正相關(guān)；b*值與NDUFB4呈顯著負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)殡x子穩(wěn)態(tài)失衡，激活了水解肌肉結(jié)構(gòu)的內(nèi)源酶，引起肌肉纖維小片化，導(dǎo)致光在結(jié)構(gòu)中的反射與折射發(fā)生變化[31]。L*值與DeoMb 呈極顯著正相關(guān)，與OxyMb 呈極顯著負(fù)相關(guān)，表明宰后隨著機(jī)體耗氧量的增加，細(xì)胞環(huán)境以及能量代謝方式的轉(zhuǎn)變，MetMb 無(wú)法被還原，使得肉色變差，L*值也增大[32]。MetMb 與NDUFB5 呈顯著負(fù)相關(guān)，這可能是因?yàn)槟芰看x方式的改變引起pH 降低，氧化還原反應(yīng)不能逆向發(fā)生，且隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，肉色變差。綜上，宰后成熟過(guò)程中肉色的變化由多個(gè)因素共同決定。Wu 等[33]研究表明氧化磷酸化在宰后貯藏過(guò)程中降低了MetMb的穩(wěn)定性，導(dǎo)致深切牛肉色澤變差。楊嘯吟等[34]采用蛋白質(zhì)組學(xué)研究高氧氣調(diào)包裝下牛排肉色穩(wěn)定性，結(jié)果表明宰后貯藏期間共15 個(gè)酶與肉色相關(guān)，且隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量的下降，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸減少，從而使肉色穩(wěn)定性發(fā)生變化[35]。氧化磷酸化代謝通路中的關(guān)鍵蛋白可能通過(guò)引起宰后能量代謝方式轉(zhuǎn)變、加劇金屬離子超載以及調(diào)控離子穩(wěn)態(tài)平衡等方式最終導(dǎo)致3 種肌紅蛋白占比發(fā)生改變，高鐵肌紅蛋白無(wú)法還原。

3 討論

肌紅蛋白是肉色的主要來(lái)源，肌紅蛋白的氧化還原穩(wěn)定性和鮮肉的顏色受多種因素控制，其表達(dá)量以及蛋白結(jié)構(gòu)的改變對(duì)氧氣運(yùn)輸和能量代謝有顯著影響，從而引起肉色變化[36]。本研究中肌紅蛋白表達(dá)量在貯藏0～4 d 呈上升趨勢(shì)，4～8 d 呈下降趨勢(shì)。肌細(xì)胞內(nèi)含氧量的持續(xù)降低，一方面使肌紅蛋白的初級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，分子間相互作用降低；另一方面使肌細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，從而刺激下游一系列蛋白質(zhì)表達(dá)的變化，引起不同時(shí)期ATP 的生物合成、嘌呤核苷三磷酸的生物合成等發(fā)生變化，細(xì)胞內(nèi)能量代謝發(fā)生紊亂，最終導(dǎo)致肌紅蛋白穩(wěn)定性下降，表達(dá)量降低。氧化磷酸化關(guān)鍵蛋白ATP5F1D 在0～4 d 處于上調(diào)表達(dá)，在4～8 d處于較高水平。其表達(dá)量的持續(xù)上調(diào)可能引起宰后能量代謝的轉(zhuǎn)換以及離子穩(wěn)態(tài)的失衡，最終導(dǎo)致高鐵肌紅蛋白無(wú)法被還原，肌紅蛋白表達(dá)量持續(xù)下降，肉色變差。NDUFA4 和NDUFB5 在4～8 d呈下調(diào)表達(dá)的趨勢(shì)，說(shuō)明細(xì)胞凋亡進(jìn)入中后期。隨著能量供給方式的轉(zhuǎn)變，氧化-還原反應(yīng)所需的細(xì)胞環(huán)境以及能量條件都發(fā)生改變，肌紅蛋白表達(dá)量也持續(xù)下降，作為色素蛋白的肌紅蛋白特有功能也在減弱乃至消亡，3 種肌紅蛋白衍生態(tài)占比發(fā)生轉(zhuǎn)變。綜上，這3 種關(guān)鍵蛋白表達(dá)量的變化對(duì)肌紅蛋白表達(dá)量均有不同程度的影響。

4 結(jié)論

宰后0～8 d 內(nèi)，隨著貯藏時(shí)間的增加，秦川牛肉背最長(zhǎng)肌pH 值呈先下降后上升的趨勢(shì)。L*值呈先上升后下降的趨勢(shì)，a*值逐漸降低，b*值逐漸升高。氧合肌紅蛋白顯著下降，高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量顯著上升，脫氧肌紅蛋白變化不顯著。肌紅蛋白表達(dá)量在0～4 d 上調(diào)，4～8 d 下調(diào)，總體為下降趨勢(shì)。氧化磷酸化代謝通路上的關(guān)鍵蛋白質(zhì)ATP5F1D 貯藏初期上調(diào)，NDUFA4、NDUFB5 貯藏后期下調(diào)，且氧化磷酸化代謝通路上的關(guān)鍵蛋白對(duì)牛肉背最長(zhǎng)肌pH 值、肉色均有顯著影響；L*值與DeoMb 相對(duì)含量呈極顯著正相關(guān)，與OxyMb 相對(duì)含量呈極顯著負(fù)相關(guān)，與ATP5F1D 呈極顯著正相關(guān)。NDUFA5 與高鐵肌紅蛋白相對(duì)含量顯著負(fù)相關(guān)。研究結(jié)果表明：氧化磷酸化代謝通路中的關(guān)鍵蛋白表達(dá)水平的變化對(duì)氧和細(xì)胞環(huán)境的影響使其能量代謝方式發(fā)生轉(zhuǎn)變，從而引起細(xì)胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)失衡，后續(xù)pH 持續(xù)下降以及ATP 的持續(xù)降解，使高鐵肌紅蛋白無(wú)法還原，肌紅蛋白表達(dá)量持續(xù)下降。同時(shí)，氧化磷酸化關(guān)鍵蛋白質(zhì)的變化可能引起貯藏期間金屬離子超載，從而激活水解肌肉結(jié)構(gòu)的內(nèi)源酶。肌肉微觀結(jié)構(gòu)的變化也使光的反射、散射和吸收程度受到影響，使肉品色澤發(fā)生變化。綜上，探究氧化磷酸化代謝通路關(guān)鍵蛋白質(zhì)對(duì)肉色的影響，對(duì)于宰后肉品品質(zhì)形成具有重要調(diào)控作用。