薛遠(yuǎn)，宋春麗*，任 健

（1 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 黑龍江齊齊哈爾161006 2植物性食品加工技術(shù)教育部工程研究中心 黑龍江齊齊哈爾 161006）

大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，必需氨基酸種類齊全，接近動(dòng)物蛋白，是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白[1]。此外，該蛋白作為重要的蛋白質(zhì)配料而廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[2]。蛋白質(zhì)的起泡性是賦予食品良好的質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性和加工特性的重要內(nèi)在因素。例如，利用蛋白質(zhì)包裹的方式保留住空氣，賦予面包、蛋糕、餅干、蛋白霜、冰淇淋和一些烘焙產(chǎn)品理想的結(jié)構(gòu)屬性[3-4]。然而，天然食品蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性等性質(zhì)常常不能滿足產(chǎn)品的需求[5-6]。因此，有必要對(duì)食品蛋白質(zhì)進(jìn)行改性處理，以獲得理想的功能性質(zhì)。

美拉德反應(yīng)在一定溫度和濕度條件下，能夠改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)，將糖分子的親水性羰基引入蛋白質(zhì)分子之中，該反應(yīng)無(wú)需加入化學(xué)試劑，安全性高。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者利用美拉德反應(yīng)顯著提高了大豆蛋白的起泡性，探索不同種類糖基的導(dǎo)入對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響規(guī)律[7-9]。值得注意的是，在利用美拉德糖基化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化的同時(shí)，會(huì)伴隨著蛋白質(zhì)自交聯(lián)反應(yīng)[10]。在剖析蛋白質(zhì)糖基化對(duì)功能性質(zhì)的影響規(guī)律時(shí)，無(wú)法充分界定導(dǎo)入糖分子含量變化本身所帶來(lái)的影響。

本研究采用美拉德反應(yīng)獲得大豆蛋白糖基化產(chǎn)物，利用β-淀粉酶依次斷裂導(dǎo)入糖基的麥芽糖單位，改變糖基化產(chǎn)物側(cè)鏈糖基含量，從而獲得具有不同糖含量的大豆蛋白。構(gòu)建出自交聯(lián)程度相同，而側(cè)鏈糖基不同的糖基化產(chǎn)物模型，通過對(duì)各指標(biāo)的分析和評(píng)估，確定、剖析糖基化產(chǎn)物的起泡性變化，從而為定向開發(fā)具有特定功能的蛋白質(zhì)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂豆粕，哈爾濱市賓縣禹王植物蛋白有限公司；麥芽糊精（Maltodextrin，MD，DE 值：8～10），山東禹城保齡寶生物有限公司；β-淀粉酶（30 U/mg），上海麥克林生物有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）預(yù)制膠片，金斯瑞生物科技公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250，美國(guó)Sigma 公司；其它試劑均為分析純級(jí)。

1.2 儀器與設(shè)備

XW-80A 型渦旋混合器，上海青浦滬西儀器廠；T25 型均質(zhì)機(jī)，德國(guó)IKA 公司；RF-530IPC 型熒光分光光度計(jì)，日本島津公司；Nano-ZS90 型納米粒度、Zeta 電位分析儀，英國(guó)Malvern 公司；DYY-10 型三恒電泳儀，北京市六一儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 大豆蛋白的提取 將脫脂豆粕與蒸餾水按1∶10（m/V）的比例低溫溶脹過夜，使其充分水合，然后用2 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 值 至8.5，50 ℃水浴攪拌2 h，轉(zhuǎn)速為30～35 r/min。隨后將混合物在3 000 r/min 離心20 min，收集上清液。用2 mol/L 的HCl 將pH 值調(diào)至4.5，將其4 ℃放置分層后3 000 r/min 離心20 min，收集沉淀，用蒸餾水（pH 4.5）水洗2 次后，用2 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8.0。隨后冷凍干燥48 h，制得SPI，蛋白質(zhì)含量為91.36%。

1.3.2 糖基化產(chǎn)物的制備 制備SPI 分散液（70 mg/mL，pH 8.0），將SPI 溶液與麥芽糊精溶液（pH 8.0）按一定比例充分混合，進(jìn)行美拉德反應(yīng)（4%SPI，40 min，質(zhì)量比1∶2），得到反應(yīng)產(chǎn)物。將反應(yīng)產(chǎn)物的pH 值調(diào)至4.5，3 000 r/min 離心10 min，收集沉淀，加蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)pH 值至7.0。在4℃下透析（8～14 ku）24 h，除去游離的麥芽糊精分子，將透析產(chǎn)物（M0）冷凍干燥，備用。

1.3.3 不同糖含量糖基化修飾產(chǎn)物的制備 制備蛋白質(zhì)分散液（M0，40 mg/mL，pH 7.0）于50 ℃時(shí)添加150 U/g（以蛋白質(zhì)質(zhì)量為基準(zhǔn)）β-淀粉酶，恒溫振蕩不同時(shí)間（5，40，80 min）。反應(yīng)結(jié)束后，立刻取出，于95 ℃滅酶5 min，冷凍干燥，得到修飾產(chǎn)物M1（反應(yīng)5 min）、M2（反應(yīng)40 min）和M3（反應(yīng)80 min）。將其在4 ℃其下透析（8～14 ku）24 h，除去游離的麥芽糊精，將糖基化修飾產(chǎn)物冷凍干燥，備用。

1.3.4 糖基化修飾產(chǎn)物中糖含量的測(cè)定 多糖在硫酸的作用下先水解成單糖，并迅速脫水生成糖醛衍生物，最后與苯酚生成橙黃色化合物，以比色法測(cè)定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：配制0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL，再分別加入1.0 mL 的5%苯酚溶液，然后快速加入5.0 mL 濃硫酸，搖勻后靜止10 min。隨后30℃水浴處理20 min。反應(yīng)液在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度。

樣品的測(cè)定：將樣品（40 mg/mL）稀釋100 倍，取1 mL 樣品溶液同法測(cè)定樣品的吸光度，SPI 作為空白對(duì)照組（4.06 g/100 g 大豆蛋白）。

1.3.5 SDS-PAGE 電泳 參照Song 等[11]的方法稍作修改，配制3 mg/mL 蛋白溶液，取100 μL 樣品溶液和等量的樣品緩沖液進(jìn)行混合，離心后取上清液煮沸5 min，冷卻待用。分離膠含量120 mg/mL，濃縮膠含量50 mg/mL。上樣量12 μL，電壓調(diào)為120 V，隨著溴酚藍(lán)進(jìn)入，待溴酚藍(lán)距下緣0.5～

1.0 cm 時(shí)，結(jié)束電泳。

蛋白染色：電泳結(jié)束后，取出膠片放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色30 min，隨后用脫色液進(jìn)行脫色，至背景色完全褪去為止。

糖蛋白染色：電泳結(jié)束后，用12.5%三氯乙酸溶液固定膠片15 min 后用雙蒸水振蕩水洗3 次（每次5 min），再用1%的高碘酸浸泡膠片15 min，將浸泡后的膠片用雙蒸水振蕩水洗4 次（每次10 min）；將水洗后的膠片放入Schiff 試劑避光染色30 min 后，再用0.5%偏重亞硫酸鈉振蕩水洗，直至被染色的粉色糖蛋白條帶出現(xiàn)。

1.3.6 內(nèi)源熒光光譜分析 參照Liu 等[12]的方法，進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定。將蛋白質(zhì)樣品溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.0）配制成1 mg/mL 的蛋白樣品溶液，隨后在10 000 r/min 的條件下離心15 min 后，取上清液4 mL，在發(fā)射波長(zhǎng)為290 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫光度為5 nm 條件下，掃描300～400 nm 范圍的發(fā)射光譜。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo)，相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.7 起泡性及泡沫穩(wěn)定性 將蛋白質(zhì)樣品溶于磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）中，配制質(zhì)量濃度為10 g/L的蛋白質(zhì)溶液。取100 mL 該溶液，以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪打1 min，記錄數(shù)據(jù)，平行測(cè)定3 次[13]。蛋白質(zhì)的起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）的計(jì)算方法見式（1）和式（2）。

式中，VL——攪打前液體的體積（mL）；V0——攪打剛停止時(shí)泡沫的體積（mL）；V30——攪打后靜置30 min 時(shí)泡沫的體積（mL）。

1.3.8 溶解性 參照Peng 等[14]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的溶解性。將蛋白質(zhì)樣品溶于pH 值為7.0 的緩沖液，配制成2 g/L 蛋白質(zhì)溶液。渦旋后4 ℃存放，使其充分水合。次日8 000 r/min 離心20 min，收集上清液，采用福林酚法測(cè)定其可溶性蛋白的含量。以待測(cè)樣品中可溶性蛋白質(zhì)含量的占比表示蛋白質(zhì)溶解性。

1.3.9 水合粒徑分布和Zeta 電位 參照Hayakawa等[15]的方法，配制一定濃度的蛋白質(zhì)分散液并將濃度稀釋至0.1 mg/mL，用0.45 μm 水膜過濾，隨后用粒度分析儀測(cè)定樣品的水合粒徑分布和Zeta電位，平行測(cè)定3 次。

1.3.10 表觀黏度的測(cè)定 參照Gu 等[16]的方法用馬爾文流變儀測(cè)定蛋白質(zhì)的表觀黏度。配制質(zhì)量濃度為40 mg/mL 蛋白樣品溶液（pH 7.0）。測(cè)定時(shí)，將樣品分散液緩慢注入、充滿夾具（直徑為60 mm，錐角為0.5°的錐板）。在溫度25 ℃，頻率0.1～100 s-1時(shí)，測(cè)試樣品的表觀黏度。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖基化修飾產(chǎn)物的糖含量

控制β-淀粉酶對(duì)SPI 美拉德產(chǎn)物（M0）的水解時(shí)間（分別為5，40，80 min）得到糖含量不同的修飾產(chǎn)物，其糖含量分別為8.10，4.88，2.21 g/100 g大豆蛋白。與M0（12.44 g/100 g 大豆蛋白）相比，修飾產(chǎn)物糖含量均存在顯著性差異（P〈0.05）。

表1 4 種糖基化修飾產(chǎn)物的糖含量分析結(jié)果Table 1 Glycan contents of the modified soy protein isolates

2.2 SDS-PAGE 電泳

由圖1a 可以看出，與SPI（泳道1）相比，糖基化修飾產(chǎn)物（泳道2～5）的7S 亞基α 和β 譜帶以及11S 亞基的B 譜帶顯色反應(yīng)減弱，高分子區(qū)域顯色反應(yīng)明顯增強(qiáng)，且出現(xiàn)了新的譜帶。表明大豆蛋白的7S 亞基和11S 亞基成分與麥芽糊精發(fā)生共價(jià)結(jié)合，形成了高分子共聚物，并且被截留在分離膠頂部[17]。

圖1 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of soy protein isolates and its glycated products

由圖1b 可以看出，糖基化修飾產(chǎn)物（泳道2～5）在分離膠頂端有一條明顯的條帶，而且與陽(yáng)性對(duì)照辣根過氧化物酶（糖蛋白，泳道L）相似，具有明顯的糖染色現(xiàn)象。SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示大豆蛋白修飾產(chǎn)物是一個(gè)交聯(lián)的大豆蛋白，而且含有糖基。結(jié)果表明，大豆蛋白與麥芽糊精發(fā)生了美拉德反應(yīng)，生成了蛋白質(zhì)共聚物，且該物質(zhì)為糖蛋白。這直接證實(shí)了通過美拉德反應(yīng)，可以將麥芽糊精導(dǎo)入到大豆蛋白分子中[18]。

2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

內(nèi)源熒光光譜是對(duì)蛋白質(zhì)分子的內(nèi)源性熒光發(fā)色團(tuán)（色氨酸、酪氨酸殘基等）的研究[19]。SPI 及糖基化修飾產(chǎn)物的熒光光譜如圖2 所示。

圖2 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的內(nèi)源熒光光譜圖Fig.2 Internal fluorescence spectrum of soy protein isolates and its glycated products

從圖2 可以看出，SPI 的最大激發(fā)波長(zhǎng)（λmax）是337 nm，是典型的色氨酸熒光光譜[20]。與SPI 相比，糖基化修飾產(chǎn)物的最大激發(fā)波長(zhǎng)分別增加到346 nm（M0），343 nm（M1），343 nm（M2），342 nm（M3），表示熒光吸收呈現(xiàn)紅移現(xiàn)象，表明糖基化修飾產(chǎn)物具有更疏松的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的色氨酸殘基隨反應(yīng)的進(jìn)行暴露在極性環(huán)境中，同時(shí)蛋白質(zhì)分子與糖分子的共價(jià)結(jié)合也使環(huán)境極性增強(qiáng)[21]。同時(shí)由于β-淀粉酶作用位點(diǎn)的不同，產(chǎn)生不同空間位阻作用，也對(duì)大豆蛋白微環(huán)境造成不同影響[22]。

2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

SPI 及糖基化修飾產(chǎn)物的起泡性及泡沫穩(wěn)定性如圖3 所示。SPI 的起泡能力為84.48%，M0 的起泡能力最高，為136.62%。由于糖基的導(dǎo)入顯著提高了大豆蛋白的溶解性，糖基化修飾產(chǎn)物親水性增強(qiáng)，當(dāng)受到急速攪打時(shí)，混入大量氣體，從而形成氣液薄膜[23]，表現(xiàn)為起泡性增強(qiáng)[24]。修飾產(chǎn)物隨著糖含量變化起泡能力分別達(dá)到98.66%（M1），96.08%（M2），91.36%（M3），且差異顯著。結(jié)果表明，修飾產(chǎn)物的糖含量對(duì)大豆蛋白的起泡性影響顯著。

圖3 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.3 Relative overrun and foam stability of soy protein isolates and its glycated products

圖4 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的表觀黏度Fig.4 Apparent viscosity of soy protein isolates and its glycated products

與SPI（57.05%）相比，M0 泡沫穩(wěn)定性最高，為71.56%，修飾產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性均顯著增強(qiáng)。這可能是蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)軣嵴归_，疏水基團(tuán)暴露出來(lái)，增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子在氣液界面的張力，形成厚度高于SPI 的氣液薄膜，從而增加泡沫穩(wěn)定性[25]。此外，糖含量為4.88～8.10 g/100 g 大豆蛋白時(shí)，對(duì)泡沫穩(wěn)定性影響不顯著。

2.5 水合粒徑分布、Zeta 電位及溶解性分析

水合粒徑反映了糖基化修飾產(chǎn)物的聚集行為。如表2 所示，糖基化修飾產(chǎn)物的水合粒徑由SPI 的134.4 nm 分別增大到169.4，165.4，162.6，151.2 nm。由于SPI 的游離氨基與麥芽糊精的羰基發(fā)生了結(jié)合，糖基化修飾產(chǎn)物的糖含量升高，水合能力增強(qiáng)，表現(xiàn)為平均粒徑增大。

表2 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的水合粒徑分布、電位及溶解性Table 2 Hydrodynamic size distribution，zeta-potential and solubility of soy protein isolates and its glycated products

溶液穩(wěn)定性與溶液形成的界面面積有關(guān)，進(jìn)而表現(xiàn)出不同的泡沫穩(wěn)定性。Zeta 電位是在蛋白質(zhì)溶液中帶電粒子剪切面的電勢(shì)，通常電勢(shì)被用來(lái)度量粒子之間的相互吸引力和相互排斥力；也是對(duì)體系分散穩(wěn)定性度量的重要參數(shù)之一。糖基化修飾產(chǎn)物的電位絕對(duì)值增大（從18.3 增大到30.9）。這是因?yàn)镾PI 經(jīng)過糖基化改性后，空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，帶電基團(tuán)暴露出來(lái)，導(dǎo)致Zeta 電位絕對(duì)值進(jìn)一步增大。此外，隨著糖含量的減少，電位的絕對(duì)值逐漸減?。?0.3，29.4，28.7）。電位的絕對(duì)值越大，粒子之間的排斥作用越顯著[26]，糖含量減少，粒子之間排斥力減小，導(dǎo)致溶液的穩(wěn)定性降低。

在pH 值為7.0 時(shí)，糖基化修飾產(chǎn)物的溶解性顯著升高。美拉德反應(yīng)引起的SPI 分子結(jié)構(gòu)變化會(huì)產(chǎn)生特定的表面特性和功能特性。通過美拉德反應(yīng)，糖分子上的親水性羥基與蛋白質(zhì)的游離氨基相結(jié)合，將大量的親水基團(tuán)導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子之中，蛋白質(zhì)分子的空間穩(wěn)定[27]。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展且空間穩(wěn)定，溶液受到攪拌時(shí)，迅速與水分子反應(yīng)且產(chǎn)生大而穩(wěn)定的界面面積，進(jìn)而表現(xiàn)為起泡能力以及泡沫穩(wěn)定性增強(qiáng)。

2.6 表觀黏度

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液受到急速較攪打時(shí)，會(huì)形成氣液薄膜產(chǎn)生泡沫，氣液薄膜的黏性與蛋白質(zhì)溶液的泡沫穩(wěn)定性有關(guān)。表觀黏度可以評(píng)價(jià)流體黏稠度，用于表征液體中分子間吸引力[28]。SPI 及其糖基化修飾產(chǎn)物的表觀黏度測(cè)定結(jié)果如圖6 所示。與SPI 相比，糖基修飾化產(chǎn)物分散液的表觀黏度均顯著增加，且表現(xiàn)出非牛頓流體的特征（隨剪切速率的增加，表觀黏度逐漸降低）?？赡苁堑鞍踪|(zhì)游離氨基與糖的親水性羰基結(jié)合生成大分子物質(zhì)，糖基化修飾產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量、水合粒徑和親水性增加，因此M0 表觀黏度增加[29]。隨著糖基化修飾產(chǎn)物側(cè)鏈糖基含量變少，水合作用變小，糖基化修飾產(chǎn)物的表觀黏度逐漸減小，然而仍高于SPI。當(dāng)體系的黏度增大，溶液被急速攪打時(shí)，蛋白質(zhì)分子迅速吸附在氣液薄膜上，表面張力降低，形成一個(gè)有較強(qiáng)凝聚力和黏性的氣液薄膜，泡沫穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。

3 結(jié)論

美拉德反應(yīng)協(xié)同β-淀粉酶定向斷裂共聚糖鏈，能夠構(gòu)建出自交聯(lián)程度相同，而側(cè)鏈糖含量不同的糖基化大豆蛋白。該反應(yīng)顯著提高了SPI 的起泡性及泡沫穩(wěn)定性；起泡性從83.48%提高到132.63%；泡沫穩(wěn)定性從57.95%提高到71.56%。糖含量對(duì)SPI 的起泡性有顯著影響，而且隨糖含量的增加，起泡性逐漸增大；然而糖含量變化（4.88～8.10 g/100 g 大豆蛋白）對(duì)SPI 的的泡沫穩(wěn)定性影響不顯著。相應(yīng)的，隨著糖含量減少，糖基化產(chǎn)物的水合粒徑、Zeta 電位絕對(duì)值、溶解性逐漸減小，表觀黏度逐漸降低。研究結(jié)果為定向開發(fā)特定功能的大豆蛋白功能性配料提供理論支撐。