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        糖含量對(duì)大豆蛋白起泡性的影響

        2023-12-05 08:47:18薛遠(yuǎn)宋春麗
        中國(guó)食品學(xué)報(bào) 2023年10期
        關(guān)鍵詞:糖基化泡沫產(chǎn)物

        薛遠(yuǎn),宋春麗*,任 健

        (1 齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 黑龍江齊齊哈爾161006 2植物性食品加工技術(shù)教育部工程研究中心 黑龍江齊齊哈爾 161006)

        大豆蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,必需氨基酸種類齊全,接近動(dòng)物蛋白,是一種優(yōu)質(zhì)植物蛋白[1]。此外,該蛋白作為重要的蛋白質(zhì)配料而廣泛應(yīng)用于食品加工領(lǐng)域[2]。蛋白質(zhì)的起泡性是賦予食品良好的質(zhì)構(gòu)、穩(wěn)定性和加工特性的重要內(nèi)在因素。例如,利用蛋白質(zhì)包裹的方式保留住空氣,賦予面包、蛋糕、餅干、蛋白霜、冰淇淋和一些烘焙產(chǎn)品理想的結(jié)構(gòu)屬性[3-4]。然而,天然食品蛋白質(zhì)的溶解性、起泡性等性質(zhì)常常不能滿足產(chǎn)品的需求[5-6]。因此,有必要對(duì)食品蛋白質(zhì)進(jìn)行改性處理,以獲得理想的功能性質(zhì)。

        美拉德反應(yīng)在一定溫度和濕度條件下,能夠改變蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu),將糖分子的親水性羰基引入蛋白質(zhì)分子之中,該反應(yīng)無(wú)需加入化學(xué)試劑,安全性高。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者利用美拉德反應(yīng)顯著提高了大豆蛋白的起泡性,探索不同種類糖基的導(dǎo)入對(duì)蛋白質(zhì)功能性質(zhì)的影響規(guī)律[7-9]。值得注意的是,在利用美拉德糖基化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)糖基化的同時(shí),會(huì)伴隨著蛋白質(zhì)自交聯(lián)反應(yīng)[10]。在剖析蛋白質(zhì)糖基化對(duì)功能性質(zhì)的影響規(guī)律時(shí),無(wú)法充分界定導(dǎo)入糖分子含量變化本身所帶來(lái)的影響。

        本研究采用美拉德反應(yīng)獲得大豆蛋白糖基化產(chǎn)物,利用β-淀粉酶依次斷裂導(dǎo)入糖基的麥芽糖單位,改變糖基化產(chǎn)物側(cè)鏈糖基含量,從而獲得具有不同糖含量的大豆蛋白。構(gòu)建出自交聯(lián)程度相同,而側(cè)鏈糖基不同的糖基化產(chǎn)物模型,通過對(duì)各指標(biāo)的分析和評(píng)估,確定、剖析糖基化產(chǎn)物的起泡性變化,從而為定向開發(fā)具有特定功能的蛋白質(zhì)提供理論參考。

        1 材料與方法

        1.1 材料與試劑

        脫脂豆粕,哈爾濱市賓縣禹王植物蛋白有限公司;麥芽糊精(Maltodextrin,MD,DE 值:8~10),山東禹城保齡寶生物有限公司;β-淀粉酶(30 U/mg),上海麥克林生物有限公司;十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(Sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)預(yù)制膠片,金斯瑞生物科技公司;低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì),北京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司;考馬斯亮藍(lán)R-250,美國(guó)Sigma 公司;其它試劑均為分析純級(jí)。

        1.2 儀器與設(shè)備

        XW-80A 型渦旋混合器,上海青浦滬西儀器廠;T25 型均質(zhì)機(jī),德國(guó)IKA 公司;RF-530IPC 型熒光分光光度計(jì),日本島津公司;Nano-ZS90 型納米粒度、Zeta 電位分析儀,英國(guó)Malvern 公司;DYY-10 型三恒電泳儀,北京市六一儀器廠。

        1.3 方法

        1.3.1 大豆蛋白的提取 將脫脂豆粕與蒸餾水按1∶10(m/V)的比例低溫溶脹過夜,使其充分水合,然后用2 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 值 至8.5,50 ℃水浴攪拌2 h,轉(zhuǎn)速為30~35 r/min。隨后將混合物在3 000 r/min 離心20 min,收集上清液。用2 mol/L 的HCl 將pH 值調(diào)至4.5,將其4 ℃放置分層后3 000 r/min 離心20 min,收集沉淀,用蒸餾水(pH 4.5)水洗2 次后,用2 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié)pH 值至8.0。隨后冷凍干燥48 h,制得SPI,蛋白質(zhì)含量為91.36%。

        1.3.2 糖基化產(chǎn)物的制備 制備SPI 分散液(70 mg/mL,pH 8.0),將SPI 溶液與麥芽糊精溶液(pH 8.0)按一定比例充分混合,進(jìn)行美拉德反應(yīng)(4%SPI,40 min,質(zhì)量比1∶2),得到反應(yīng)產(chǎn)物。將反應(yīng)產(chǎn)物的pH 值調(diào)至4.5,3 000 r/min 離心10 min,收集沉淀,加蒸餾水溶解并調(diào)節(jié)pH 值至7.0。在4℃下透析(8~14 ku)24 h,除去游離的麥芽糊精分子,將透析產(chǎn)物(M0)冷凍干燥,備用。

        1.3.3 不同糖含量糖基化修飾產(chǎn)物的制備 制備蛋白質(zhì)分散液(M0,40 mg/mL,pH 7.0)于50 ℃時(shí)添加150 U/g(以蛋白質(zhì)質(zhì)量為基準(zhǔn))β-淀粉酶,恒溫振蕩不同時(shí)間(5,40,80 min)。反應(yīng)結(jié)束后,立刻取出,于95 ℃滅酶5 min,冷凍干燥,得到修飾產(chǎn)物M1(反應(yīng)5 min)、M2(反應(yīng)40 min)和M3(反應(yīng)80 min)。將其在4 ℃其下透析(8~14 ku)24 h,除去游離的麥芽糊精,將糖基化修飾產(chǎn)物冷凍干燥,備用。

        1.3.4 糖基化修飾產(chǎn)物中糖含量的測(cè)定 多糖在硫酸的作用下先水解成單糖,并迅速脫水生成糖醛衍生物,最后與苯酚生成橙黃色化合物,以比色法測(cè)定。

        葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:配制0.1 mg/mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別取0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中,用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL,再分別加入1.0 mL 的5%苯酚溶液,然后快速加入5.0 mL 濃硫酸,搖勻后靜止10 min。隨后30℃水浴處理20 min。反應(yīng)液在490 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。標(biāo)準(zhǔn)曲線的橫坐標(biāo)為葡萄糖質(zhì)量濃度,縱坐標(biāo)為吸光度。

        樣品的測(cè)定:將樣品(40 mg/mL)稀釋100 倍,取1 mL 樣品溶液同法測(cè)定樣品的吸光度,SPI 作為空白對(duì)照組(4.06 g/100 g 大豆蛋白)。

        1.3.5 SDS-PAGE 電泳 參照Song 等[11]的方法稍作修改,配制3 mg/mL 蛋白溶液,取100 μL 樣品溶液和等量的樣品緩沖液進(jìn)行混合,離心后取上清液煮沸5 min,冷卻待用。分離膠含量120 mg/mL,濃縮膠含量50 mg/mL。上樣量12 μL,電壓調(diào)為120 V,隨著溴酚藍(lán)進(jìn)入,待溴酚藍(lán)距下緣0.5~

        1.0 cm 時(shí),結(jié)束電泳。

        蛋白染色:電泳結(jié)束后,取出膠片放入考馬斯亮藍(lán)染色液中染色30 min,隨后用脫色液進(jìn)行脫色,至背景色完全褪去為止。

        糖蛋白染色:電泳結(jié)束后,用12.5%三氯乙酸溶液固定膠片15 min 后用雙蒸水振蕩水洗3 次(每次5 min),再用1%的高碘酸浸泡膠片15 min,將浸泡后的膠片用雙蒸水振蕩水洗4 次(每次10 min);將水洗后的膠片放入Schiff 試劑避光染色30 min 后,再用0.5%偏重亞硫酸鈉振蕩水洗,直至被染色的粉色糖蛋白條帶出現(xiàn)。

        1.3.6 內(nèi)源熒光光譜分析 參照Liu 等[12]的方法,進(jìn)行內(nèi)源熒光光譜的測(cè)定。將蛋白質(zhì)樣品溶于0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.0)配制成1 mg/mL 的蛋白樣品溶液,隨后在10 000 r/min 的條件下離心15 min 后,取上清液4 mL,在發(fā)射波長(zhǎng)為290 nm,激發(fā)和發(fā)射狹縫光度為5 nm 條件下,掃描300~400 nm 范圍的發(fā)射光譜。以波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),相對(duì)熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)作圖。

        1.3.7 起泡性及泡沫穩(wěn)定性 將蛋白質(zhì)樣品溶于磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)中,配制質(zhì)量濃度為10 g/L的蛋白質(zhì)溶液。取100 mL 該溶液,以12 000 r/min的轉(zhuǎn)速攪打1 min,記錄數(shù)據(jù),平行測(cè)定3 次[13]。蛋白質(zhì)的起泡性(FC)和泡沫穩(wěn)定性(FS)的計(jì)算方法見式(1)和式(2)。

        式中,VL——攪打前液體的體積(mL);V0——攪打剛停止時(shí)泡沫的體積(mL);V30——攪打后靜置30 min 時(shí)泡沫的體積(mL)。

        1.3.8 溶解性 參照Peng 等[14]的方法測(cè)定蛋白質(zhì)的溶解性。將蛋白質(zhì)樣品溶于pH 值為7.0 的緩沖液,配制成2 g/L 蛋白質(zhì)溶液。渦旋后4 ℃存放,使其充分水合。次日8 000 r/min 離心20 min,收集上清液,采用福林酚法測(cè)定其可溶性蛋白的含量。以待測(cè)樣品中可溶性蛋白質(zhì)含量的占比表示蛋白質(zhì)溶解性。

        1.3.9 水合粒徑分布和Zeta 電位 參照Hayakawa等[15]的方法,配制一定濃度的蛋白質(zhì)分散液并將濃度稀釋至0.1 mg/mL,用0.45 μm 水膜過濾,隨后用粒度分析儀測(cè)定樣品的水合粒徑分布和Zeta電位,平行測(cè)定3 次。

        1.3.10 表觀黏度的測(cè)定 參照Gu 等[16]的方法用馬爾文流變儀測(cè)定蛋白質(zhì)的表觀黏度。配制質(zhì)量濃度為40 mg/mL 蛋白樣品溶液(pH 7.0)。測(cè)定時(shí),將樣品分散液緩慢注入、充滿夾具(直徑為60 mm,錐角為0.5°的錐板)。在溫度25 ℃,頻率0.1~100 s-1時(shí),測(cè)試樣品的表觀黏度。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 糖基化修飾產(chǎn)物的糖含量

        控制β-淀粉酶對(duì)SPI 美拉德產(chǎn)物(M0)的水解時(shí)間(分別為5,40,80 min)得到糖含量不同的修飾產(chǎn)物,其糖含量分別為8.10,4.88,2.21 g/100 g大豆蛋白。與M0(12.44 g/100 g 大豆蛋白)相比,修飾產(chǎn)物糖含量均存在顯著性差異(P〈0.05)。

        表1 4 種糖基化修飾產(chǎn)物的糖含量分析結(jié)果Table 1 Glycan contents of the modified soy protein isolates

        2.2 SDS-PAGE 電泳

        由圖1a 可以看出,與SPI(泳道1)相比,糖基化修飾產(chǎn)物(泳道2~5)的7S 亞基α 和β 譜帶以及11S 亞基的B 譜帶顯色反應(yīng)減弱,高分子區(qū)域顯色反應(yīng)明顯增強(qiáng),且出現(xiàn)了新的譜帶。表明大豆蛋白的7S 亞基和11S 亞基成分與麥芽糊精發(fā)生共價(jià)結(jié)合,形成了高分子共聚物,并且被截留在分離膠頂部[17]。

        圖1 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的SDS-PAGE 電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of soy protein isolates and its glycated products

        由圖1b 可以看出,糖基化修飾產(chǎn)物(泳道2~5)在分離膠頂端有一條明顯的條帶,而且與陽(yáng)性對(duì)照辣根過氧化物酶(糖蛋白,泳道L)相似,具有明顯的糖染色現(xiàn)象。SDS-PAGE 分析結(jié)果顯示大豆蛋白修飾產(chǎn)物是一個(gè)交聯(lián)的大豆蛋白,而且含有糖基。結(jié)果表明,大豆蛋白與麥芽糊精發(fā)生了美拉德反應(yīng),生成了蛋白質(zhì)共聚物,且該物質(zhì)為糖蛋白。這直接證實(shí)了通過美拉德反應(yīng),可以將麥芽糊精導(dǎo)入到大豆蛋白分子中[18]。

        2.3 內(nèi)源熒光光譜分析

        內(nèi)源熒光光譜是對(duì)蛋白質(zhì)分子的內(nèi)源性熒光發(fā)色團(tuán)(色氨酸、酪氨酸殘基等)的研究[19]。SPI 及糖基化修飾產(chǎn)物的熒光光譜如圖2 所示。

        圖2 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的內(nèi)源熒光光譜圖Fig.2 Internal fluorescence spectrum of soy protein isolates and its glycated products

        從圖2 可以看出,SPI 的最大激發(fā)波長(zhǎng)(λmax)是337 nm,是典型的色氨酸熒光光譜[20]。與SPI 相比,糖基化修飾產(chǎn)物的最大激發(fā)波長(zhǎng)分別增加到346 nm(M0),343 nm(M1),343 nm(M2),342 nm(M3),表示熒光吸收呈現(xiàn)紅移現(xiàn)象,表明糖基化修飾產(chǎn)物具有更疏松的蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)的色氨酸殘基隨反應(yīng)的進(jìn)行暴露在極性環(huán)境中,同時(shí)蛋白質(zhì)分子與糖分子的共價(jià)結(jié)合也使環(huán)境極性增強(qiáng)[21]。同時(shí)由于β-淀粉酶作用位點(diǎn)的不同,產(chǎn)生不同空間位阻作用,也對(duì)大豆蛋白微環(huán)境造成不同影響[22]。

        2.4 起泡性及泡沫穩(wěn)定性

        SPI 及糖基化修飾產(chǎn)物的起泡性及泡沫穩(wěn)定性如圖3 所示。SPI 的起泡能力為84.48%,M0 的起泡能力最高,為136.62%。由于糖基的導(dǎo)入顯著提高了大豆蛋白的溶解性,糖基化修飾產(chǎn)物親水性增強(qiáng),當(dāng)受到急速攪打時(shí),混入大量氣體,從而形成氣液薄膜[23],表現(xiàn)為起泡性增強(qiáng)[24]。修飾產(chǎn)物隨著糖含量變化起泡能力分別達(dá)到98.66%(M1),96.08%(M2),91.36%(M3),且差異顯著。結(jié)果表明,修飾產(chǎn)物的糖含量對(duì)大豆蛋白的起泡性影響顯著。

        圖3 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的起泡性及泡沫穩(wěn)定性Fig.3 Relative overrun and foam stability of soy protein isolates and its glycated products

        圖4 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的表觀黏度Fig.4 Apparent viscosity of soy protein isolates and its glycated products

        與SPI(57.05%)相比,M0 泡沫穩(wěn)定性最高,為71.56%,修飾產(chǎn)物的泡沫穩(wěn)定性均顯著增強(qiáng)。這可能是蛋白質(zhì)肽鏈?zhǔn)軣嵴归_,疏水基團(tuán)暴露出來(lái),增強(qiáng)了蛋白質(zhì)分子在氣液界面的張力,形成厚度高于SPI 的氣液薄膜,從而增加泡沫穩(wěn)定性[25]。此外,糖含量為4.88~8.10 g/100 g 大豆蛋白時(shí),對(duì)泡沫穩(wěn)定性影響不顯著。

        2.5 水合粒徑分布、Zeta 電位及溶解性分析

        水合粒徑反映了糖基化修飾產(chǎn)物的聚集行為。如表2 所示,糖基化修飾產(chǎn)物的水合粒徑由SPI 的134.4 nm 分別增大到169.4,165.4,162.6,151.2 nm。由于SPI 的游離氨基與麥芽糊精的羰基發(fā)生了結(jié)合,糖基化修飾產(chǎn)物的糖含量升高,水合能力增強(qiáng),表現(xiàn)為平均粒徑增大。

        表2 大豆蛋白及其糖基化修飾產(chǎn)物的水合粒徑分布、電位及溶解性Table 2 Hydrodynamic size distribution,zeta-potential and solubility of soy protein isolates and its glycated products

        溶液穩(wěn)定性與溶液形成的界面面積有關(guān),進(jìn)而表現(xiàn)出不同的泡沫穩(wěn)定性。Zeta 電位是在蛋白質(zhì)溶液中帶電粒子剪切面的電勢(shì),通常電勢(shì)被用來(lái)度量粒子之間的相互吸引力和相互排斥力;也是對(duì)體系分散穩(wěn)定性度量的重要參數(shù)之一。糖基化修飾產(chǎn)物的電位絕對(duì)值增大(從18.3 增大到30.9)。這是因?yàn)镾PI 經(jīng)過糖基化改性后,空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,帶電基團(tuán)暴露出來(lái),導(dǎo)致Zeta 電位絕對(duì)值進(jìn)一步增大。此外,隨著糖含量的減少,電位的絕對(duì)值逐漸減?。?0.3,29.4,28.7)。電位的絕對(duì)值越大,粒子之間的排斥作用越顯著[26],糖含量減少,粒子之間排斥力減小,導(dǎo)致溶液的穩(wěn)定性降低。

        在pH 值為7.0 時(shí),糖基化修飾產(chǎn)物的溶解性顯著升高。美拉德反應(yīng)引起的SPI 分子結(jié)構(gòu)變化會(huì)產(chǎn)生特定的表面特性和功能特性。通過美拉德反應(yīng),糖分子上的親水性羥基與蛋白質(zhì)的游離氨基相結(jié)合,將大量的親水基團(tuán)導(dǎo)入蛋白質(zhì)分子之中,蛋白質(zhì)分子的空間穩(wěn)定[27]。蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)伸展且空間穩(wěn)定,溶液受到攪拌時(shí),迅速與水分子反應(yīng)且產(chǎn)生大而穩(wěn)定的界面面積,進(jìn)而表現(xiàn)為起泡能力以及泡沫穩(wěn)定性增強(qiáng)。

        2.6 表觀黏度

        當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液受到急速較攪打時(shí),會(huì)形成氣液薄膜產(chǎn)生泡沫,氣液薄膜的黏性與蛋白質(zhì)溶液的泡沫穩(wěn)定性有關(guān)。表觀黏度可以評(píng)價(jià)流體黏稠度,用于表征液體中分子間吸引力[28]。SPI 及其糖基化修飾產(chǎn)物的表觀黏度測(cè)定結(jié)果如圖6 所示。與SPI 相比,糖基修飾化產(chǎn)物分散液的表觀黏度均顯著增加,且表現(xiàn)出非牛頓流體的特征(隨剪切速率的增加,表觀黏度逐漸降低)??赡苁堑鞍踪|(zhì)游離氨基與糖的親水性羰基結(jié)合生成大分子物質(zhì),糖基化修飾產(chǎn)物的相對(duì)分子質(zhì)量、水合粒徑和親水性增加,因此M0 表觀黏度增加[29]。隨著糖基化修飾產(chǎn)物側(cè)鏈糖基含量變少,水合作用變小,糖基化修飾產(chǎn)物的表觀黏度逐漸減小,然而仍高于SPI。當(dāng)體系的黏度增大,溶液被急速攪打時(shí),蛋白質(zhì)分子迅速吸附在氣液薄膜上,表面張力降低,形成一個(gè)有較強(qiáng)凝聚力和黏性的氣液薄膜,泡沫穩(wěn)定性顯著增強(qiáng)。

        3 結(jié)論

        美拉德反應(yīng)協(xié)同β-淀粉酶定向斷裂共聚糖鏈,能夠構(gòu)建出自交聯(lián)程度相同,而側(cè)鏈糖含量不同的糖基化大豆蛋白。該反應(yīng)顯著提高了SPI 的起泡性及泡沫穩(wěn)定性;起泡性從83.48%提高到132.63%;泡沫穩(wěn)定性從57.95%提高到71.56%。糖含量對(duì)SPI 的起泡性有顯著影響,而且隨糖含量的增加,起泡性逐漸增大;然而糖含量變化(4.88~8.10 g/100 g 大豆蛋白)對(duì)SPI 的的泡沫穩(wěn)定性影響不顯著。相應(yīng)的,隨著糖含量減少,糖基化產(chǎn)物的水合粒徑、Zeta 電位絕對(duì)值、溶解性逐漸減小,表觀黏度逐漸降低。研究結(jié)果為定向開發(fā)特定功能的大豆蛋白功能性配料提供理論支撐。

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