趙雪如,李佳瑩,付瑋琦,任佳敏,李風(fēng)娟

(天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 食品營養(yǎng)與安全教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,天津 300457)

解淀粉芽孢桿菌屬于芽孢桿菌屬,為革蘭氏陽性菌,是一種公認(rèn)的GRAS安全菌[1]。已有研究指出解淀粉芽孢桿菌具有產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶的能力,故現(xiàn)也被用于生產(chǎn)發(fā)酵豆制品[2]。Yang等[3]在解淀粉芽孢桿菌SWJS22發(fā)酵豆粕的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),經(jīng)過發(fā)酵豆粕中的酚類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)和低分子肽含量均顯著上升,且表現(xiàn)出了較好的抗氧化活性。Wu等[4]用解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵米豆,發(fā)酵后米豆的理化性質(zhì)得到明顯改善,且抗氧化活性、DPP-IV和α-葡萄糖苷酶的抑制活性遠(yuǎn)高于未發(fā)酵米豆。綠豆(Vignaradiata(Linn.) Wilczek)是生活中常見的藥食兩用的豆類,富含蛋白質(zhì)、不溶性膳食纖維、必需氨基酸和不飽和脂肪酸,還含有多種有益的活性成分,如單寧、酚類化合物、植物甾醇等[5]。已經(jīng)有研究指出綠豆具有解毒、預(yù)防糖尿病、降血壓和緩解中暑等功效[6]。綠豆作為一種原料已被應(yīng)用于發(fā)酵新型豆制品[7-10]。

本研究利用解淀粉芽孢桿菌SY07(BacillusamyloliquefaciensSY07)作為發(fā)酵菌種,考察綠豆在發(fā)酵過程中體外降血糖活性、營養(yǎng)成分及揮發(fā)性風(fēng)味成分的變化,為研發(fā)具有功能活性和良好風(fēng)味的發(fā)酵豆制品提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

綠豆:購自贛州康瑞農(nóng)產(chǎn)品有限公司。菌種:由本研究室從發(fā)酵豆渣中分離得到,并經(jīng)中科院微生物研究所鑒定為解淀粉芽孢桿菌SY07(BacillusamyloliquefaciensSY07)。

1.1.2 試劑

α-葡萄糖苷酶(來源于大鼠)、α-淀粉酶(來源于豬胰腺)、4-硝基苯-α-D-吡喃葡糖苷(4-NPG)、谷胱甘肽、沒食子酸、兒茶素:美國Sigma-Aldrich公司;Folin-Ciocalteu試劑:北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱 美墨爾特(上海)貿(mào)易有限公司;酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司;真空冷凍干燥機(jī) 德國Christ公司;固相微萃取頭 上海安譜科學(xué)儀器有限公司;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 種子液培養(yǎng)

挑取固體培養(yǎng)基上的B.amyloliquefaciensSY07接種到液體種子培養(yǎng)基中(1%胰蛋白胨,0.5%酵母提取物,1% NaCl,pH為7),于37 ℃下培養(yǎng)12 h。

1.3.2 發(fā)酵

將綠豆用3倍體積的自來水浸泡12～14 h,隨后于121 ℃、101 kPa的條件下蒸45 min。接種3%的種子液,將菌液和豆子均勻混合后在37 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)0,8,16,24,32,40,48 h,將樣品分別標(biāo)記為L0、L8、L16、L24、L32、L40和L48。將最終得到的樣品置于-20 ℃保存。

1.3.3 樣品處理

對發(fā)酵后的樣品進(jìn)行冷凍干燥,研磨粉碎后與蒸餾水按1∶10(質(zhì)量和體積比)充分混勻,超聲提取10 min,在25 ℃,200 r/min的搖床上浸提30 min,10 000 r/min 離心10 min,用0.45 μm濾膜進(jìn)行過濾收集上清液,將其濃度標(biāo)記為100 mg/mL。

1.4 活性測定

1.4.1α-葡萄糖苷酶抑制活性

測定方法參考Xiao等[11]的方法。樣品水提液與4-NPG溶液混合均勻后于37 ℃下反應(yīng)50 min,最后加入Na2CO3終止反應(yīng),在405 nm下測定反應(yīng)液的吸光值。

α-葡萄糖苷酶抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%。

式中:A1、A2、A3和A4分別代表樣品組、樣品對照組、對照組和空白組的吸光值。

1.4.2α-淀粉酶抑制活性

測定方法參考Zhou等[12]的方法。樣品水提液與α-淀粉酶于37 ℃下水浴5 min,再加入可溶性淀粉溶液于37 ℃水浴30 min,最后加入DNS試劑終止反應(yīng)。將反應(yīng)液沸水浴10 min后于540 nm下測定吸光值。

α-淀粉酶抑制率(%)=[1-(A1-A2)/(A3-A4)]×100%。

式中:A1、A2、A3和A4分別代表樣品組、樣品對照組、對照組和空白組的吸光值。

1.5 成分測定

1.5.1 總酚含量的測定

采用福林(Folin)-酚試劑法[13]測定綠豆發(fā)酵過程中的總酚含量。以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定結(jié)果表示為沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g DW)。

1.5.2 總黃酮含量的測定

參考Jia等[14]的方法測定綠豆發(fā)酵過程中的總黃酮含量。以兒茶素為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,測定結(jié)果表示為兒茶素當(dāng)量(mg CE/g DW)。

1.5.3 多肽含量的測定

綠豆發(fā)酵過程中多肽含量的測定采用鄰苯二甲醛法[15]。以谷胱甘肽為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,最終測定結(jié)果換算為g/100 g。

1.6 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測定

采用HS-SPME-GC-MS技術(shù)[16]對B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵過程中綠豆的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠豆發(fā)酵過程中α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性的變化

由圖1可知,發(fā)酵綠豆的α-葡萄糖苷酶抑制率在4.2%～50.3%之間變化。在發(fā)酵前24 h,α-葡萄糖苷酶抑制率快速升高,在24 h達(dá)到最大(50.3%),此時活性與未發(fā)酵綠豆相比提高了10.9倍。隨后抑制活性開始緩慢下降,但依然維持著較好的抑制活性。α-葡萄糖苷酶是生物體糖代謝途徑中的重要成員之一,通過抑制α-葡萄糖苷酶活性能夠達(dá)到降低機(jī)體血糖水平的作用。Lee等[17]使用松茸菌絲體發(fā)酵大豆,4 d內(nèi)α-葡萄糖苷酶的抑制率從16.2%增加到40.8%。先前已有研究證實(shí)相較于納豆菌、米曲霉、黑曲霉和紅曲霉,B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵大豆具有更突出的α-葡萄糖苷酶抑制活性[18]。

圖1 綠豆發(fā)酵過程中的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性 Fig.1 Inhibitory activities of α-glucosidase and α-amylase during the fermentation of mung beans

發(fā)酵綠豆的α-淀粉酶抑制率在0%～92.0%之間變化。在未發(fā)酵的綠豆中未檢測到α-淀粉酶抑制活性。發(fā)酵前24 h內(nèi),綠豆的α-淀粉酶抑制率顯著上升,在24 h時抑制率達(dá)到最高(92.0%),隨后抑制率開始下降,在發(fā)酵后24 h內(nèi)同一顯著性水平上依然保持著穩(wěn)定的抑制活性。

2.2 綠豆發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分含量的變化

B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵后綠豆表現(xiàn)出良好的體外降血糖活性,這可能與微生物在代謝過程中釋放的酚類物質(zhì)和活性肽有關(guān)[19-20]。綠豆發(fā)酵過程中總酚、總黃酮及多肽含量的變化見圖2。

圖2 綠豆發(fā)酵過程中營養(yǎng)成分的變化Fig.2 Change of nutrients in mung beans during fermentation

由圖2可知,發(fā)酵過程中綠豆的總酚含量在1.4～3.0 mg GAE/g DW之間變化,隨著B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵的進(jìn)行,多酚含量逐漸增加,在發(fā)酵進(jìn)行的第0～16 h,綠豆中的總酚含量快速積累,說明在發(fā)酵初期,微生物的代謝活動比較活躍;在發(fā)酵的第24～40 h,綠豆的多酚含量在同一顯著性水平上保持穩(wěn)定,在發(fā)酵的第48 h時,綠豆中的多酚含量達(dá)到最大值(3.0 mg GAE/g DW)。發(fā)酵過程中綠豆的總黃酮含量在0.8～1.6 mg CE/g DW之間變化,發(fā)酵48 h時的綠豆具有最高的黃酮含量(1.6 mg CE/g DW)。酚類因其潛在的生物活性而被大家廣泛關(guān)注,發(fā)酵可以作為一種提高多酚含量的途徑。Juan等[21]用枯草芽孢桿菌發(fā)酵黑豆,發(fā)酵過程中枯草芽孢桿菌會分泌β-葡萄糖苷酶,催化黑豆釋放酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì),導(dǎo)致這些化合物含量上升。綠豆種皮中含有豐富的酚酸類物質(zhì),主要以結(jié)合的形式存在,B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵有利于酚類物質(zhì)釋放,提高綠豆中的多酚含量[22]。

綠豆原料中的多肽含量為0.75 g/100 g,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,綠豆中多肽的含量逐漸增加,在發(fā)酵的第48 h時達(dá)到最高(5.4 g/100 g),與未發(fā)酵的綠豆相比提高了6.2倍。在發(fā)酵的前32 h內(nèi),綠豆的多肽含量快速積累,說明此時微生物酶活性較高,對綠豆中的蛋白質(zhì)利用度也比較高,在發(fā)酵的后8 h內(nèi)多肽含量相對穩(wěn)定。在微生物發(fā)酵過程中,微生物可以有效弱化豆類原料中蛋白酶和胰蛋白酶抑制劑的作用,能夠消耗原料中的蛋白質(zhì),將豆子中的蛋白質(zhì)分解為肽和氨基酸,從而提高豆類蛋白的消化率[23]。

2.3 綠豆發(fā)酵過程中風(fēng)味物質(zhì)的變化

由圖3可知,B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵綠豆過程中共檢測到96種揮發(fā)性物質(zhì),包括28種醇類物質(zhì),22種酮類物質(zhì),8種醛類物質(zhì),8種酸類物質(zhì),10種酯類物質(zhì),3種酚類物質(zhì),4種烷烴類物質(zhì),3種醚類物質(zhì),2種呋喃類物質(zhì),2種吡嗪類物質(zhì)和6種其他類物質(zhì)。并進(jìn)一步對揮發(fā)性物質(zhì)的OAV進(jìn)行計(jì)算,OAV>1的物質(zhì)對食品的風(fēng)味具有一定的貢獻(xiàn)作用[24]。

由圖4可知,共檢測到11種揮發(fā)性物質(zhì)。樣品L0中OAV>1的物質(zhì)有3種,分別是芳樟醇、異戊酸、愈創(chuàng)木酚;L8中OAV>1的物質(zhì)有5種,分別是3-羥基-2-丁酮、PPG-2甲醚、芳樟醇、異戊酸、愈創(chuàng)木酚;L16中OAV>1的物質(zhì)有4種,分別是二甲基二硫、3-羥基-2-丁酮、芳樟醇、愈創(chuàng)木酚;L24中OAV>1的物質(zhì)有7種,分別是二甲基二硫、3-羥基-2-丁酮、二甲基三硫、1-辛烯-3-醇、芳樟醇、愈創(chuàng)木酚、苯乙酸甲酯;L32中OAV>1的物質(zhì)有5種,分別是二甲基二硫、二甲基三硫、1-辛烯-3-醇、愈創(chuàng)木酚、芳樟醇;L40中OAV>1的物質(zhì)有5種,分別是1-辛烯-3-醇、芳樟醇、2-甲基丁酸、愈創(chuàng)木酚、6-甲基-2-庚酮;L48中OAV>1的物質(zhì)有3種,分別是1-辛烯-3-醇、芳樟醇、愈創(chuàng)木酚。

圖4 發(fā)酵過程中綠豆的OAV>1的風(fēng)味物質(zhì)熱圖分析 Fig.4 Heatmap analysis of flavor substances with OAV>1 in mung beans during fermentation

可以發(fā)現(xiàn)芳樟醇和愈創(chuàng)木酚存在于綠豆發(fā)酵的全過程,是B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵綠豆的特征風(fēng)味物質(zhì),賦予發(fā)酵綠豆獨(dú)特的花草香[25]和煙熏味;1-辛烯-3-醇被認(rèn)為是給蒸煮豆子帶來豆腥味的物質(zhì),是在豆子浸泡過程中產(chǎn)生的,然而在本實(shí)驗(yàn)中,未發(fā)酵的綠豆中并未檢測到1-辛烯-3-醇,在發(fā)酵的24～48 h有檢測到,在發(fā)酵40 h的綠豆中有較高的OAV,隨后減小,給發(fā)酵綠豆帶來蘑菇香氣[26];3-羥基-2-丁酮,又稱乙偶姻,能夠賦予發(fā)酵綠豆奶油香,未發(fā)酵的綠豆中沒有檢測到該物質(zhì),該物質(zhì)出現(xiàn)在8～32 h的樣品中,該物質(zhì)在發(fā)酵8 h的綠豆中具有最高的OAV,之后隨著發(fā)酵時間的延長而減小。異戊酸具有強(qiáng)烈刺激性氣味,該物質(zhì)只存在于發(fā)酵的第0～8 h,是給L0和L8帶來不良風(fēng)味的關(guān)鍵物質(zhì)之一。此外,在過程中還檢測到2種硫化物,在發(fā)酵的中后期出現(xiàn),具有不良?xì)馕?但其OAV較低,不會影響到整體的風(fēng)味。

3 結(jié)論

與未發(fā)酵的綠豆相比,B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵綠豆的α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制活性均顯著提升,且發(fā)酵24 h的綠豆表現(xiàn)出了優(yōu)良的潛在降血糖活性。此外,B.amyloliquefaciensSY07發(fā)酵明顯提高了綠豆的多酚、黃酮和多肽含量。GC-MS數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示,在發(fā)酵綠豆中共檢測到11種OAV>1的物質(zhì),分別是芳樟醇、異戊酸、愈創(chuàng)木酚、3-羥基-2-丁酮、PPG-2甲醚、二甲基二硫、二甲基三硫、1-辛烯-3-醇、苯乙酸甲酯、2-甲基丁酸、6-甲基-2-庚酮。可進(jìn)一步探究發(fā)酵綠豆中關(guān)鍵活性物質(zhì)及特征性風(fēng)味成分的代謝途徑,為B.amyloliquefaciensSY07在功能性食品中的深入應(yīng)用及開發(fā)兼具良好風(fēng)味的功能性發(fā)酵豆制品提供理論指導(dǎo)。