肖小武， 林凱鵬， 周志強， 付輝政， 羅躍華， 陳偉康， 洪 挺

(江西省藥品檢驗檢測研究院,江西省藥品與醫(yī)療器械質(zhì)量工程技術研究中心,國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點實驗室,江西 南昌 330029)

鮮竹瀝為禾本科植物粉綠竹PhyllostachysglaucaMcCluve、凈竹PhyllostachysnudaMcClure及同屬數(shù)種植物的鮮桿經(jīng)加熱后自然瀝出的液體[1]，具有清熱化痰功效，用于肺熱咳嗽痰多、小兒痰熱驚風等癥[2]，含酚類、糖、氨基酸等成分，其中有效物質(zhì)是愈創(chuàng)木酚、苯酚等及其同系酚性成分[3-7]，但現(xiàn)行質(zhì)量標準未對以鮮竹瀝為主要原料的復方鮮竹瀝液等品種中的酚類進行控制[8]，相關研究報道僅涉及愈創(chuàng)木酚、苯酚[9-12]，而多組分測定只見UV法測定總酚含量及GC-MS法測定其相對含量[13-15]。本實驗在前期對鮮竹瀝中糖和氨基酸研究的基礎上[16-17]，建立GC法同時對苯酚、對甲基苯酚、對乙基苯酚3個苯酚及其同系物，以及愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚7個愈創(chuàng)木酚及其同系物的含量進行測定，以期為原材料選取及其質(zhì)量標準制定提供依據(jù)。

1 材料

Agilent 8890B型GC色譜儀(美國Agilent公司)，配置氫火焰離子化檢測器(FID)、7693型液體自動進樣器、Openlab色譜工作站；BT25S型電子天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)。愈創(chuàng)木酚(批號111510-200202，純度100.0%)、4-甲基愈創(chuàng)木酚(批號AL190815-27，純度99.98%)、苯酚(批號G181013-04，純度99.61%)、4-乙基愈創(chuàng)木酚(批號ZS190617-02，純度98.46%)、甲基苯酚(批號G201021-05，純度99.34%)、乙基苯酚(批號G191026-03，純度99.27%)、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚(批號MX190811-23，純度98.46%)、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚(批號MA190816-07，純度99.08%)、異丁香酚(批號82718，純度99.0%)、4-烯丙基-6-甲氧基愈創(chuàng)木酚(批號93727，純度99.0%)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。剛竹屬毛竹、淡竹(粉綠竹)、凈竹、雷竹、毛金竹、高節(jié)竹及大明竹屬苦竹、仙居苦竹均采自江西省林業(yè)科學院竹類國家林木種質(zhì)資源庫，經(jīng)江西省林業(yè)科學院竹類研究所余林副研究員鑒定為正品，并委托江西仁安藥業(yè)有限公司通過工業(yè)生產(chǎn)干餾制備了鮮竹瀝各3批。乙醚等其他試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備 精密稱取愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對甲基苯酚、對乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6-甲氧基愈創(chuàng)木酚對照品適量，甲醇制成質(zhì)量濃度分別為0.240 8、0.349 4、0.373 6、0.281 6、0.305 2、0.254 8、0.270 4、0.454 9、0.255 8、0.252 8 mg/mL的溶液，精密移取2.5 mL至25 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，即得，于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 供試品溶液制備 精密量取鮮竹瀝20 mL,稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至1～2,乙醚振搖提取3次，每次20 mL，合并乙醚液，乙醚液用20 mL 5%碳酸氫鈉溶液洗滌，分離乙醚層，揮干，殘渣加甲醇溶解并定容至5 mL,即得。

2.3 色譜條件 DB-WAX色譜柱(30 m×0.32 mm，0.25 μm)；載氣N2，柱體積流量3.5 mL/min；分流比30∶1；進樣口溫度260 ℃；程序升溫(初始溫度75 ℃，保持0.5 min，5 ℃/min升至150 ℃保持0.5 min，3 ℃/min升至210 ℃)；FID檢測器溫度300 ℃；進樣量1 μL。色譜圖見圖1。

1.愈創(chuàng)木酚 2.4-甲基愈創(chuàng)木酚 3.苯酚 4.6-甲氧基愈創(chuàng)木酚 5.對甲基苯酚 6.對乙基苯酚 7.4-乙烯基愈創(chuàng)木酚8.4-乙基愈創(chuàng)木酚 9.異丁香酚 10.4-烯丙基-6甲氧基-愈創(chuàng)木酚1.guaiacol 2.4-methyl guaiacol 3. phenol 4.6-methoxy guaiacol 5.p-methyl phenol 6.p-ethyl phenol 7.4-vinyl guaiacol 8.4-ethyl guaiacol 9.isoeugenol 10.4-allyl-6-methoxy guaiacol圖1 各成分GC色譜圖Fig.1 GC chromatograms of various constituents

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 取“2.1”項下對照品溶液，依次稀釋成所需質(zhì)量濃度，在“2.3”項色譜條件下進樣測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4.2 精密度試驗 取“2.1”項下對照品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對甲基苯酚、對乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚峰面積RSD分別為0.97%、1.22%、1.62%、0.60%、0.79%、0.65%、1.00%、0.85%、1.69%、0.82%，表明儀器精密度良好。

表1 各成分線性關系

2.4.3 重復性試驗 取同一批鮮竹瀝(雷竹)，按“2.2”項下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.3”項色譜條件下進樣測定6次，測得愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對甲基苯酚、對乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚含量RSD分別為1.02%、0.87%、0.96%、1.21%、0.54%、0.62%、1.25%、0.53%、0.67%、0.81%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗 取同一批鮮竹瀝(雷竹)，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，于0、6、12、18、24 h在“2.3”色譜條件下進樣測定，測得愈創(chuàng)木酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、苯酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、對甲基苯酚、對乙基苯酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6甲氧基愈創(chuàng)木酚峰面積RSD分別為0.46%、0.86%、1.06%、0.87%、1.16%、1.49%、1.24%、0.65%、1.30%、0.65%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 精密量取各成分含量已知的鮮竹瀝液(雷竹)6份，每份10 mL，精密加入等量對照品溶液，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”色譜條件下進樣測定，計算回收率。結果，苯酚、甲基苯酚、愈創(chuàng)木酚、乙基苯酚、4-甲基愈創(chuàng)木酚、4-乙基愈創(chuàng)木酚、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、異丁香酚、4-烯丙基-6-甲氧基愈創(chuàng)木酚平均加樣回收率分別為96.69%、97.68%、99.02%、98.88%、99.06%、99.77%、98.16%、101.01%、99.40%、98.23%，RSD分別為1.38%、1.88%、2.64%、2.51%、1.88%、2.74%、0.79%、1.41%、2.48%、1.32%。

2.4.6 樣品含量測定 取8種基原樣品各3批，每批2份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.3”色譜條件下進行測定，計算含量，結果見表2。

表2 不同基原樣品中各成分含量測定結果(μg/mL，n=2)

3 討論

3.1 前處理條件考察

3.1.1 萃取溶劑 本實驗考察了正丁醇、乙酸乙酯、乙醚，以各成分含量為指標，發(fā)現(xiàn)相對于乙醚，正丁醇、乙酸乙酯萃取所得愈創(chuàng)木酚、丁香醛含量較低，而且乙醚更易揮發(fā)，故選擇其作為萃取溶劑。

3.1.2 萃取體積和次數(shù) 本實驗考察了10、20、 30、40 mL乙醚萃取不同次數(shù)，以各成分含量為指標，發(fā)現(xiàn)與樣品同等體積時含量達到最高，增加體積、次數(shù)無明顯變化，故選擇20 mL乙醚萃取3次。

3.2 色譜條件優(yōu)化 由于6-甲氧基愈創(chuàng)木酚色譜峰較大，4-乙烯基愈創(chuàng)木酚較小，而且兩者較難分離，故參考文獻[18]對升溫程序和分流比進行優(yōu)化。在保證各成分色譜峰分離度、峰形、出峰時間的情況下，確定為“2.3”項下色譜條件。

3.3 結果分析

3.3.1 基原 不同基原樣品中各成分總含量依次為毛竹>毛金竹>淡竹>雷竹>苦竹>仙居苦竹>苦竹>凈竹>高節(jié)竹；在愈創(chuàng)木酚及其同系物和苯酚及其同系物的含量方面，毛竹最高。目前，鮮竹瀝質(zhì)量標準未涉及毛竹，只列出淡竹和凈竹，但調(diào)研發(fā)現(xiàn)，江西、浙江、湖南等鮮竹瀝主產(chǎn)區(qū)毛竹資源豐富，淡竹、凈竹相對匱乏，故企業(yè)采用毛竹為原料來加工炮制?；谏鲜銮闆r，建議修訂相關標準時將毛竹納入其中。

3.3.2 成分種類 不同基原樣品中含量最高的成分均為6-甲氧基愈創(chuàng)木酚，其次是愈創(chuàng)木酚，但現(xiàn)行鮮竹瀝質(zhì)量標準并未對酚類進行質(zhì)量控制，而2020年版《中國藥典》對復方鮮竹瀝液、竹瀝達痰丸也未作類似規(guī)定。因此，建議修訂相關標準時將6-甲氧基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚等成分或多組分酚類特征圖譜納入其中。

3.3.3 成分限度 6-甲氧基愈創(chuàng)木酚在毛竹、毛金竹中的含量均高于200.00 μg/mL，但在凈竹、高節(jié)竹中均低于50.00 μg/mL；愈創(chuàng)木酚在毛竹、毛金竹中含量均高于50.00 μg/mL，但在凈竹、高節(jié)竹中均低于5.00 μg/mL。按平均值的70%計算，暫定為每1 mL鮮竹瀝含愈創(chuàng)木酚(C7H8O2)不得少于40.0 μg，6-甲氧基愈創(chuàng)木酚(C8H10O3)不得少于145.0 μg。另外，各成分含量差異較大，故采用特征圖譜作為多組分酚類的質(zhì)控指標。