吳日幫,周其洋

(1.佛山市海天調(diào)味食品股份有限公司,廣東 佛山 528000;2.廣東海天創(chuàng)新技術(shù)有限公司, 廣東 佛山 528000;3.佛山市海天(高明)調(diào)味食品有限公司,廣東 佛山 528000)

鮮味是賦予人們愉悅感的味覺,也是人們對美味的重要評判維度之一?？茖W(xué)界已經(jīng)證明谷氨酸、天冬氨酸、5′-呈味核苷酸(IMP和GMP)是已知的最主要的鮮味物質(zhì)[1],但人們發(fā)現(xiàn)鮮味氨基酸和呈味核苷酸并不能完整還原食物的鮮感,谷氨酸鈉鮮味單一、留口短,IMP和GMP與谷氨酸鈉可協(xié)同增鮮,但口感干澀,與食品中協(xié)調(diào)、飽滿、豐富、持久的鮮感有較大差距。隨著對食物呈味物質(zhì)研究的進一步深入,研究人員發(fā)現(xiàn)肽類物質(zhì)對于鮮味同樣具有重要貢獻,并且提供了較鮮味氨基酸和5′-呈味核苷酸更加豐富、柔和、協(xié)調(diào)的鮮感。呈味肽是一類由氨基酸通過肽鍵連接形成的生物小分子,廣泛存在于食物及蛋白質(zhì)的酶解加工產(chǎn)物中。

自1978年Yoshio等[2]從木瓜蛋白酶酶解牛肉中分離出美味肽Lys-Gly-Asp-Glu-Glu-Ser-Leu-Ala并證明其具有風(fēng)味增強效果起,國內(nèi)外學(xué)者不斷對呈味肽進行大量的挖掘與研究,呈味肽也因為其獨特的風(fēng)味增強效果、良好的加工特性、天然安全的物質(zhì)屬性成為食品工業(yè)界技術(shù)開發(fā)的新熱點。鮮味肽在呈味肽領(lǐng)域中研究最廣泛,目前國內(nèi)外關(guān)于鮮味肽的研究主要集中在制備工藝的開發(fā)上,對鮮味肽構(gòu)效關(guān)系、呈味機理等的研究相對缺乏。本文將對現(xiàn)有報道的食源性鮮味肽的種類、呈味效果與制備技術(shù)進行綜述,進而對鮮味肽構(gòu)效關(guān)系、呈味機制研究進展及研究方法展開討論,為鮮味肽的研究、開發(fā)和利用提供參考。

1 食源性鮮味肽的種類與來源

國內(nèi)外研究學(xué)者從天然食材中發(fā)現(xiàn)了諸多鮮味肽的存在,其中以鮮味突出的食用真菌類、水產(chǎn)類最為常見(見表1)。蔣希希等[3]從草菇的水提物中分離出4個鮮味肽,分別為Asp-Asp-Cys-Pro-Asp-Lys、Leu-Val-Asp-Lys-Pro-Arg、Gln-Ala-Asp-Lys-Arg-Lys、Asp-Thr-Phe-Asn-Asp-Lys,其中Asp-Asp-Cys-Pro-Asp-Lys和Asp-Thr-Phe-Asn-Asp-Lys的鮮味閾值分別為0.10 mg/mL和0.17 mg/mL,與谷氨酸鈉的鮮味閾值(0.12 mg/mL)接近。李曉明等[4]從白玉菇中分離鑒定出6個鮮味肽,分別為Glu-Leu-Glu-Leu-Gln、Glu-Leu-Gln-Ser-Gly-Asn-Thr-Tyr、Asn-Tyr-Asn-Gly-Gly-Tyr、Glu-Ala-Lys-Val-Tyr、Val-Ala-Asn-Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-Ala-Ala和Ser-Leu-Leu-Gln-Pro-Leu。Song等[5]從美味牛肝菌中發(fā)現(xiàn)了3個鮮味肽(Asp-Gly-Phe、Lys-Cys-Gly-Gln和His-His-Tyr-Glu),其中His-His-Tyr-Glu不僅具有呈鮮效果,還具備與谷氨酸鈉協(xié)同增鮮的作用,在含有谷氨酸鈉的體系中,其鮮味閾值約為水溶液體系中的一半。具有良好鮮味的水產(chǎn)往往含有效果顯著的鮮味肽,如寧夢華等[6]通過超濾和凝膠過濾層析方式從暗紋東方鲀中分離出7個鮮味肽,其中Asn-Trp-Asp-Asp-Met-Glu-Lys的鮮味閾值最低,為0.38 mmol/L(約0.36 mg/mL)。Zhang等[7]從蛤蜊中發(fā)現(xiàn)了鮮味閾值更低的3個鮮味肽,分別為Asp-Asp-Leu-Asp-Arg(0.198 mmol/L,約0.13 mg/mL)、Ala-Lys-Ala-Leu-Lys-Glu-Glu-Asp-Leu(0.123 mmol/L,約0.13 mg/mL)和Asp-Leu-Arg-Ala-Asp(0.212 mmol/L,約0.12 mg/mL),鮮味閾值與谷氨酸鈉接近。

表1 天然食材來源的鮮味肽Table 1 Umami peptides from natural food sources

科學(xué)界對于傳統(tǒng)發(fā)酵食品中鮮味肽的研究也比較廣泛(見表2),如印度尼西亞學(xué)者Muhamad等[11]從當?shù)氐囊环N利用少孢根霉發(fā)酵的大豆食品中分離出Gly-Glu-Asn-Glu-Glu-Glu-Asp-Ser-Gly-Ala-Ile-Val-Thr-Val-Lys。Yang等[12]從臭鱖魚中鑒定出6個鮮味肽,包括Asp-Gly-Glu-Lys-Val-Asp-Phe-Asp-Asp-Ile-Gln-Lys、Lys-Glu-Val-Lys-Glu-Glu-Pro-Ala-Glu-Ala-Val-Gly-Asp、Asp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp-His-His-Thr、Glu-Glu-Val-Gly-Val-Glu-Glu-Glu-Lys-Pro-Lys-Phe、Asp-Arg-Glu-Val-Asp-Asp-Thr-Gly-His-Val-Pro和Glu-Glu-Ala-Gln-Glu-Arg-Ala-Asp-Ile-Ala-Glu。日本學(xué)者Masashi等[13]從長時間熟成的味噌中分離出1～5 kDa的多肽組分,其具有顯著的增鮮效果,且具有鮮味飽滿持久的特點。醬油作為我國最主要的傳統(tǒng)發(fā)酵調(diào)味品之一,具有濃厚咸鮮的特點,成為國內(nèi)發(fā)酵食品來源鮮味肽的研究熱點。與天然食材中分離的鮮味肽不同,醬油中的鮮味肽氨基酸殘基數(shù)目明顯更少,主要以2～4肽為主,而食用真菌、水產(chǎn)以及其他類型發(fā)酵食品中分離的鮮味肽則以5～11肽甚至分子量更大的肽為主。如Zhu等[14]分析對比了全黃豆與脫脂大豆發(fā)酵醬油中的肽組成時,發(fā)現(xiàn)了多個鮮味肽,包括5個二肽(Glu-Glu、Glu-Leu、Leu-Glu、Val-Glu、Asp-Arg)、4個三肽(Thr-Gly-Cys、Gly-Leu-Glu、Asp-Ala-Glu、Glu-Val-Cys)和2個四肽(Val-Glu-Ala-Leu、Gly-Gly-Gly-Glu),這些鮮味肽中除Thr-Gly-Cys和Glu-Val-Cys的水溶液不呈味或呈澀味以外,其他肽分子水溶液均呈鮮味,在醬油體系中均呈現(xiàn)出增鮮效果。陳嘉輝[15]在研究醬油中的呈味肽時,發(fā)現(xiàn)11個具有顯著鮮味提升作用的肽分子,分別為Gly-Gly-Gly-Glu、Lys-Pro、Glu-Phe、Asp-Pro、Glu-Glu、Asp-Arg、Asp-Ala-Glu、Glu-Val、Asp-Leu、Val-Glu和Gly-Ile-Glu,其中大部分為2～3肽。造成這種差異的原因是醬油使用米曲霉菌種對原料進行固態(tài)發(fā)酵,米曲霉是一類分泌高活力胞外水解酶且酶系豐富的食品發(fā)酵微生物,醬油生產(chǎn)時經(jīng)過米曲霉制曲工序,使得米曲霉的蛋白酶充分合成分泌,結(jié)合長時間發(fā)酵,蛋白酶作用充分,蛋白質(zhì)的水解程度高,因此其呈味肽分子量也相對更小。

表2 發(fā)酵食品來源的鮮味肽Table 2 Umami peptides from fermented food sources

2 食源性鮮味肽的制備技術(shù)

盡管許多食物和發(fā)酵食品中含有效果顯著的鮮味肽,但從食物和發(fā)酵食品中分離純化出足夠的鮮味肽應(yīng)用于食品調(diào)味成本依舊很高,無法實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化,因此開發(fā)規(guī)模化鮮味肽制備技術(shù)成為食品工業(yè)界的研究重點。多肽制備主要包括固相合成法、化學(xué)水解法、基因重組表達法和酶解法[17]。

固相合成法[18]是利用載體樹脂固定氨基酸C端后,通過添加Fmoc-氨基酸進行縮合反應(yīng),實現(xiàn)氨基酸的逐步延伸,是醫(yī)藥和科研領(lǐng)域常用的多肽定制化合成技術(shù),目前產(chǎn)業(yè)界已實現(xiàn)了自動化合成,可輕易實現(xiàn)對多肽的多種修飾,但由于其生產(chǎn)效率較低,且需要對產(chǎn)物進行純化,無法滿足食品行業(yè)的龐大需求,應(yīng)用成本過高。

化學(xué)水解法[19]包括酸水解和堿水解,其中酸水解應(yīng)用更廣泛,是酸水解植物蛋白調(diào)味液的主要生產(chǎn)方式,但酸水解法對氨基酸破壞明顯,如色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸等,天冬酰胺和谷氨酰胺會發(fā)生脫酰胺,此外,酸水解法為非定向水解,因此無法有效獲得目標呈味肽。

基因重組表達法[20]是根據(jù)生物遺傳學(xué)中心法則將多肽氨基酸序列轉(zhuǎn)換為對應(yīng)的基因堿基序列,通過合成相應(yīng)的DNA片段并整合到質(zhì)粒表達載體中,利用細菌、酵母等細胞工廠進行多肽的外源表達,該方法的優(yōu)點在于多肽表達生產(chǎn)可控性高,通過添加標簽序列可實現(xiàn)高效分離純化,然后通過特異性蛋白酶且切除標簽序列獲得成熟的目標多肽[21]。該技術(shù)在多肽藥物生產(chǎn)領(lǐng)域已廣泛使用,目前有研究團隊嘗試對氨基酸數(shù)目較大的鮮味肽進行外源表達,如伍圓明[22]將美味肽對應(yīng)的DNA片段進行多拷貝串聯(lián),并使用細胞密度依賴型高效表達啟動子PsrfA作為產(chǎn)物表達啟動子,以枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis168作為宿主進行高密度發(fā)酵和融合多肽的異源表達,獲得了含有8個美味肽序列且C端帶有His標簽的融合多肽產(chǎn)物,通過His標簽可實現(xiàn)多肽的高效提純。但目前基因重組表達法僅適用于氨基酸數(shù)目較多的肽分子表達,對于鮮味寡肽并不適用。

酶解法是利用蛋白酶對蛋白質(zhì)肽鍵進行水解獲得多肽的方法,由于蛋白酶具有特異性識別、切割氨基酸位點的特性,因此具備可控制備特定結(jié)構(gòu)特征多肽的可能性,且蛋白酶反應(yīng)條件溫和,來源天然安全,易于終止反應(yīng),易于實現(xiàn)規(guī)模化應(yīng)用,是應(yīng)用潛力最大的鮮味肽制備途徑。目前酶解法已在蛋白質(zhì)加工領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用,如生產(chǎn)作為蛋白營養(yǎng)補充劑的大豆肽[22]、乳清蛋白肽[23],以及在護膚領(lǐng)域應(yīng)用的膠原蛋白肽[24]。在食品調(diào)味領(lǐng)域,酶解法也逐步推動了鮮味肽領(lǐng)域的發(fā)展。學(xué)術(shù)界通過酶解法對不同食源性蛋白質(zhì),如豆粕[25]、花生粕[26]、小麥蛋白[27]等進行深加工,從酶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)了許多新型的或已知的鮮味肽,酶解產(chǎn)物呈鮮效果顯著,如范海茹等[28]發(fā)現(xiàn)利用中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對豆粕進行分步連續(xù)復(fù)合酶解后,可以獲得與谷氨酸、呈味核苷酸二鈉相似的鮮味肽組分。劉冰等[29]使用胰蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶對條滸苔進行復(fù)合酶解,當酶活比例為2∶1時獲得的分子量<3 kDa的多肽組分具有顯著的鮮味。楊文君等[30-31]從豌豆蛋白深度酶解產(chǎn)物以及豌豆固態(tài)發(fā)酵酶解產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)咸味肽同時具有顯著的鮮味增強效果,這可能與其氨基酸中富含鮮味氨基酸殘基有關(guān)。李自會等發(fā)現(xiàn)大量禽類肉及其副產(chǎn)物經(jīng)過蛋白酶解后所得肽類物質(zhì)具有增強食物鮮香的作用[32]。酵母是天然的微生物蛋白來源,廣泛用于調(diào)味品、營養(yǎng)補充劑制備,Alim等從商品化的酵母抽提物中分離鑒定出一系列鮮味肽,包括Ala-Asp-Ala、Pro-Gly-Asp、Glu-Met-His、Gln-Pro-Ser、Val-Glu-His、Glu-Asp、Pro-Ser-Gly、Ala-Glu-Ala、Gly-Gly-Pro-Gly、Asp-Asp、Glu-Asp和Asp-Asp-Asp[33],證明鮮味肽的酶法生產(chǎn)已具備產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用條件。

定向酶解技術(shù)是高效獲得目標鮮味肽的重要技術(shù),其中蛋白酶的選擇具有決定性的作用。目前市售的蛋白酶制劑主要為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶等,研究人員可根據(jù)MEROPS蛋白酶數(shù)據(jù)庫(https://www.ebi.ac.uk/merops/)查詢各種蛋白酶的酶切位點偏好性,結(jié)合鮮味肽的氨基酸組成與序列特征,篩選合適的蛋白酶制劑進行鮮味肽的酶法制備。常見的蛋白酶酶切特性見表3。普遍認為,水解活性高的蛋白酶更有利于獲得小分子肽,但其酶切位點也會相應(yīng)更加廣泛,專一性獲得具有某種序列特征的肽分子也越難,酶切位點特異性較強的蛋白酶其水解率較低,原料蛋白利用率較低。此外,不同蛋白酶作用后的產(chǎn)物在風(fēng)味上也有較大區(qū)別,使用單一蛋白酶進行處理往往在效率和風(fēng)味上都達不到預(yù)期效果,如經(jīng)堿性蛋白酶酶解處理的肽分子苦味明顯,需要搭配風(fēng)味蛋白酶或氨肽酶進行脫苦處理[34],但如果在酶解植物蛋白時減少堿性蛋白酶的使用,其蛋白利用率和酶解效率就會顯著下降。因此要根據(jù)蛋白底物種類進行蛋白酶的合理搭配和酶解設(shè)計,這需要技術(shù)開發(fā)者積累大量的蛋白酶應(yīng)用經(jīng)驗,也需要研究人員在肽分子構(gòu)效關(guān)系研究上取得突破。

表3 常見市售蛋白酶的酶切位點Table 3 Restriction sites of common commercially available proteases

3 鮮味肽的呈味機理研究進展

盡管食品領(lǐng)域已對鮮味肽開展大量研究,但仍以鮮味肽制備技術(shù)開發(fā)和鮮味肽的分離純化鑒定為主,對于鮮味肽呈味機制的研究相對有限。有研究學(xué)者通過歸納分析目前已報道的鮮味肽氨基酸組成,認為鮮味肽呈味效果與鮮味氨基酸密切相關(guān),大部分已被鑒定的鮮味肽中都含有鮮味氨基酸殘基Glu或Asp[35],如醬油來源的一系列鮮味肽中,含有鮮味氨基酸殘基的肽閾值更低,在0.50～1.09 g/kg范圍內(nèi),而不含鮮味氨基酸殘基的Thr-Gly-Cys呈味閾值則達到(2.35±0.11) g/kg,顯著高于其他鮮味肽[14]。此外,鮮味氨基酸在肽中的位置可能對鮮味強度同樣具有影響,當肽分子氨基酸組成一致,鮮味氨基酸位于肽分子C端時,其鮮味閾值普遍低于鮮味氨基酸位于N端的肽分子,如Leu-Glu、Val-Glu和Asp-Glu的鮮味閾值比Glu-Leu、Glu-Val和Glu-Asp更低。

錢方等已證明游離的鮮味氨基酸通過與鮮味受體T1R1/T1R3兩個亞基上的正構(gòu)位點結(jié)合激活鮮味受體的細胞轉(zhuǎn)導(dǎo)信號[34],但鮮味肽中的鮮味氨基酸殘基是否直接參與正構(gòu)位點的結(jié)合目前仍缺乏證據(jù),一些研究人員根據(jù)前人鑒定的鮮味肽序列進行合成,發(fā)現(xiàn)其鮮味作用并不明顯。此外,許多研究報道鑒定出的鮮味肽并不含有鮮味氨基酸殘基,而含有鮮味氨基酸殘基的肽分子并不顯示出鮮味。因此,學(xué)術(shù)界針對鮮味氨基酸對鮮味肽的作用仍存在較大分歧。

從蛋白質(zhì)相互作用角度開展研究是從本質(zhì)上闡明鮮味肽呈味機理的必要途徑。目前科學(xué)界普遍采用分子模擬對接的方式研究鮮味肽的作用機理,并推測鮮味肽與游離的鮮味氨基酸和5'-呈味核苷酸的作用機理可能不同。Roberta等[36]研究認為,甜味受體中的T1R2和T1R3蛋白亞基的VFT活性區(qū)域具有一個較大的“楔形”空間,借助其表面的楔形構(gòu)型和電荷互補與蛋白分子相互作用來觸發(fā)后續(xù)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)效應(yīng),而與甜味受體高度相似的鮮味受體同樣具有T1R3蛋白亞基,其與鮮味肽的作用機制可能具有一定的相似性。

與該結(jié)論類似,一些研究學(xué)者通過分子模擬對接同樣發(fā)現(xiàn)鮮味肽可能是結(jié)合在鮮味受體的配體結(jié)合口袋空腔處發(fā)揮作用的,如余霞琴對Arg-Pro-Leu-Gly-Asn-Cys、Thr-Leu-Arg-Arg-Cys-Met、Lys-Gly-Arg-Tyr-Glu-Arg、Glu-His-Ala-Met-Leu-Asn、Glu-Phe-Lys-Glu-Tyr-Asn、Leu-Ser-Glu-Arg-Tyr-Pro、Cys-Cys-Asn-Lys-Ser-Val共7個已鑒定的鮮味六肽與鮮味受體T1R1/T1R3進行分子模擬對接,發(fā)現(xiàn)鮮味受體上的氨基酸殘基Cys62、Arg277、Arg281、Trp303、Ser306對于鮮味六肽結(jié)合可能具有重要影響,其中Cys62和Arg281位于鮮味受體蛋白配體結(jié)合口袋空腔兩側(cè),發(fā)揮類似鉗子的作用,強化了六肽與口袋結(jié)合的穩(wěn)定性,從而提高了激活鮮味受體的概率[37]。Yang等[12]通過分子對接方式研究了臭鱖魚中的鮮味肽與鮮味受體T1R1/T1R3的作用模式,發(fā)現(xiàn)鮮味肽主要與鮮味受體中的T1R3亞基相互作用,而T1R3亞基的結(jié)合口袋表面含有大量氫鍵位點、親水性位點以及堿性位點,這些位點主要由Ser、Glu、His、Gln、Arg和Lys殘基提供,當鮮味肽中含有“-Glu-Glu-”、“-Glu-Asp-”、“-Asp-Glu-”和“-Asp-Asp-”結(jié)構(gòu)時,能夠與結(jié)合口袋形成更穩(wěn)定的氫鍵和鹽橋,從而直接或間接提升其他鮮味物質(zhì)的受體激活能力和作用時間。上述推論主要針對氨基酸數(shù)目較多的鮮味肽分子,對于氨基酸數(shù)目相對較少的鮮味肽,其作用機制可能會有所不同,如Zhao等[38]采取分子模擬對接的方式,研究了虹鱒魚來源的鮮味肽與鮮味受體的作用方式,推測鮮味四肽Glu-Ala-Asn-Lys、Glu-Glu-Ala-Lys和Glu-Met-Gln-Lys能夠進入到T1R1亞基蛋白的結(jié)合口袋中,通過氫鍵和鹽橋與Arg151、Asp147、Gln52和Arg277位點相互作用,從而產(chǎn)生鮮味信號,但目前仍缺乏相應(yīng)的實驗驗證。

4 展望

總體而言,國內(nèi)外對鮮味肽的研究仍處于起步階段,盡管學(xué)術(shù)界對鮮味肽的制備技術(shù)研發(fā)逐漸加快,但真正實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化、商品化應(yīng)用的仍十分有限。對于鮮味肽呈味機制的研究也相對滯后,盡管分子模擬對接是目前研究鮮味肽與鮮味受體作用過程和原理的主要手段,對于人們認識鮮味肽作用機制具有重要的參考價值,但分子模擬無法代替驗證性實驗,鮮味肽的作用機理只是停留在假設(shè)階段,并未形成嚴謹?shù)目茖W(xué)理論。未來關(guān)于鮮味肽的機理研究可以借助分子模擬計算的手段篩選鮮味肽與鮮味受體的潛在作用位點,通過替換潛在關(guān)鍵氨基酸位點,結(jié)合固相合成手段驗證肽分子的呈味效果差異,或者結(jié)合生理學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)和生物化學(xué)等學(xué)科的研究方法,如細胞膜片鉗技術(shù)、表面等離子共振技術(shù)、等溫滴定微量熱技術(shù)、蛋白晶體衍射技術(shù)、冷凍電鏡技術(shù)等,從鮮味產(chǎn)生的生物學(xué)角度揭示鮮味肽的作用機理,從而明確鮮味肽的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)特征與共性,為鮮味肽的結(jié)構(gòu)理性設(shè)計與定向制備技術(shù)的優(yōu)化提供科學(xué)理論指導(dǎo)。