王建鳳,馮月超,周欣燃,張怡,楚弘宇,王穎,楊志超,劉艷*

(1.北京市科學技術研究院分析測試研究所(北京市理化分析測試中心),北京市食品安全分析測試工程技術研究中心,北京 100089;2.北京農學院 食品科學與工程學院,北京 100096;3.北京建筑大學建筑結構與環(huán)境修復功能材料北京市重點實驗室,北京 100044)

去甲烏藥堿屬于芐基異喹啉類生物堿,是一種天然的生物堿,能夠刺激β受體,常被用作強心劑、利尿劑等,可抑制生物體EGFR/JAK2/c-JUN、TGF-β1/Smad等信號通路[1-3],用于治療心臟病[4],廣泛存在于花椒、胡椒、桂皮、八角等天然植物中,這些植物常被用作調味品,因此可能導致誤食而出現(xiàn)興奮劑陽性事件[5-7]。曲托喹酚具有罌粟堿樣解痙作用,與沙丁胺醇的作用相似。上述兩種物質均因具有擴張血管、改善血液循環(huán)的作用從而使身體進入早期興奮狀態(tài)的特點[8],世界反興奮劑機構明確將二者列入禁用清單。為完善食品安全風險監(jiān)測手段[9-10],開展去甲烏藥堿和曲托喹酚等食源性興奮劑檢測技術研究十分必要。

液相色譜法[11]、液相色譜-串聯(lián)質譜法[12]和衍生化氣相色譜法[13]等分析方法已被應用于香辛料[14-15]、藥材[16-18]及運動員尿液[19-21]、血清[22]、膳食補充劑[23]中去甲烏藥堿的檢測。目前針對去甲烏藥堿和曲托喹酚同時分析的方法很少,僅有Yan等[24]報道了植物源的調味品中運用固相萃取法針對這兩種興奮劑同時測定的檢測方法,但是方法中未提到復合調味料的測定,同時對于含量較高且容易超出線性范圍的樣品的分析未明確樣品制備過程中具體步驟、樣品是否進行稀釋等問題。

通常在調味品中測定的參數(shù)集中于重金屬[25]、真菌毒素[26-27]、毒品[28]以及主效成分[29]等,對于去甲烏藥堿和曲托喹酚在復合調味料中的分析方法未見報道,針對這兩種目標物同時分析的方法缺乏、方法靈敏度有待進一步提升等需求,本研究利用UHPLC-MS/MS開發(fā)單一及復合調味品中去甲烏藥堿和曲托喹酚同時測定的定量分析方法,為避免因誤食而導致興奮劑陽性事件提供了技術和基礎數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

花椒7種、胡椒9種、辣椒4種、八角1種、油辣椒1種、辣醬8種、火鍋底料6種、燒烤料2種、腌制料4種和咖喱粉2種:購于超市和集貿市場。

1.2 試劑

甲醇、乙醇、乙腈(均為色譜純):美國Thermo Fisher Scientific公司;甲酸(色譜純):阿法埃莎(中國)化學有限公司;石墨化碳黑(graphitized carbon black,GCB,120～400 μm)、十八烷基鍵合硅膠(octadecylsilane chemically bonded silica,C18,40～60 μm)、N-丙基乙二胺(primary secondary amine,PSA,40～60 μm)、氨基吸附材料(NH2,40～60 μm):天津博納艾杰爾科技有限公司;中性氧化鋁(Al2O3,100～200目):國藥集團化學試劑有限公司;EMR(1 g,6 mL):美國Waters公司;甲酸銨、乙酸銨(均為色譜純):北京百靈威科技有限公司;去甲烏藥堿(純度99.2%,CAS:5843-65-2):上海安譜實驗科技股份有限公司;曲托喹酚鹽酸鹽(純度99.07%,CAS:18559-59-6):加拿大Toronto Research Chemicals公司;去甲烏藥堿-D4(純度99.1%,100 μg/mL,CAS:2249814-83-1)、曲托喹酚鹽酸鹽-D9(純度99.6%,100 μg/mL,CAS:18559-63-2):天津阿爾塔科技有限公司;實驗室用水:Milli-Q超純水制備系統(tǒng)制備。

1.3 主要儀器與設備

Xevo TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質譜儀、色譜柱Acquity UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、色譜柱Acquity UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、色譜柱Acquity UPLC BEH HILIC(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、色譜柱Acquity UPLC BEH Amide(100 mm×3.0 mm,1.7 μm) 美國Waters公司;GR22GⅢ高速冷凍離心機 日本HITACHI公司;N-EVAPTM 112恒溫水浴氮吹儀 美國Organomation公司;MS200多管渦旋混勻儀 杭州瑞誠儀器有限公司;Vortex-genie 2渦旋混合器 美國Scientific Industries公司;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 標準溶液的配制

分別稱取去甲烏藥堿和曲托喹酚鹽酸鹽標準品10 mg(精確至0.000 01 g),加入甲醇,超聲溶解,定容于10 mL容量瓶中,混勻,得到1 000 mg/L標準儲備液,于-20 ℃保存,分別準確移取兩種標準儲備液適量,用甲醇配制成10 mg/L的混合標準品外標儲備液;準確移取去甲烏藥堿-D4和曲托喹酚鹽酸鹽-D9標準品各1 mL,加入甲醇,超聲溶解,定容于10 mL容量瓶中,混勻,得到10 mg/L混合標準品內標儲備液;準確移取10 mg/L混合標準品內標儲備液1 mL,加入甲醇,超聲溶解,定容于10 mL容量瓶中混勻,得到1 mg/L混合內標工作液。

1.4.2 樣品前處理及測定方法

1.4.2.1 辣椒、辣醬、火鍋底料(含油)、八角

稱取試樣2 g(精確到0.01 g)于50 mL具塞螺旋蓋聚丙烯離心管中,準確加入100 μL 1 mg/L混合內標工作液,加入20 mL含5%甲酸的乙醇溶液,渦旋混勻,振蕩提取30 min,8 000 r/min離心5 min。移取2.0 mL上清液于10 mL凈化管中,加入65 mg GCB、65 mg C18和65 mg EMR,渦旋混合,8 000 r/min離心5 min,移取1.0 mL上清液,氮氣吹至近干,1.0 mL初始流動相復溶,渦旋30 s,用0.22 μm尼龍微孔濾膜過濾,濾液采用基質標準曲線定量。

1.4.2.2 花椒和胡椒

花椒和胡椒中曲托喹酚的分析按照1.4.2.1前處理方法,采用溶劑標準曲線定量。而對于去甲烏藥堿的測定,其前處理步驟與1.4.2.1前處理方法略有不同,樣品經提取離心后,需準確移取0.50 mL上清液至25 mL容量瓶中,加入125 μL 1 mg/L混合內標工作液,用含5%甲酸的乙醇溶液稀釋定容,搖勻,再從容量瓶中移取2.0 mL溶液進行凈化,重復1.4.2.1中后續(xù)步驟,濾液采用溶劑標準曲線定量。

1.4.3 基質空白提取液的制備

取不含被測物的樣品,按照1.4.2操作處理,得到基質空白提取液,用于配制系列標準工作溶液。

1.4.4 儀器條件

1.4.4.1 質譜條件

電噴霧離子源(electrospray ionization,ESI)正離子模式電離,采用多反應監(jiān)測(multiple reaction monitoring,MRM)模式;毛細管電壓3.00 kV;離子源溫度150 ℃;錐孔反吹氣流量50 L/h;脫溶劑氣流量800 L/h;脫溶劑氣溫度500 ℃;碰撞氣氬氣;MRM參數(shù)見表1。

表1 去甲烏藥堿和曲托喹酚的MRM參數(shù)Table 1 MRM parameters of higenamine and tretoquinol

1.4.4.2 色譜條件

ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm,1.8 μm);流動相A:甲醇,流動相B:10 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸),流速:0.3 mL/min;進樣量:5 μL;柱溫:30 ℃,梯度洗脫程序:0～1.5 min,3% A;1.5～5.5 min,3%～95% A;5.5～5.6 min,95%～3% A;5.6～7.5 min,3% A。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優(yōu)化

分別配制質量濃度為100 ng/mL的標準溶液,直接進行質譜分析,一級質譜掃描,去甲烏藥堿和曲托喹酚均在ESI+模式下獲得豐度較高的[M+H]+分子離子峰,優(yōu)化錐孔電壓,獲得最佳檢測條件,以準分子離子峰為母離子進行二級質譜掃描,優(yōu)化碰撞電壓,選擇相對豐度較高的兩個碎片離子作為定量和定性離子,所得的離子對與文獻報道一致[21,30],質譜條件見表1。

2.2 色譜條件的選擇

2.2.1 色譜柱的選擇

由于興奮劑種類較多,選擇一種通用的色譜柱對于將來建立高通量興奮劑檢測技術尤為重要,本研究考察了C18(100 mm×2.1 mm,1.7 μm)、HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)、HILIC (100 mm×2.1 mm,1.7 μm)和Amide(100 mm×3.0 mm,1.7 μm)4種不同極性的超高效液相色譜柱對兩種物質的保留行為。

采用C18色譜柱分離時,去甲烏藥堿和曲托喹酚峰形對稱性和分離效果好;采用極性較強的HILIC色譜柱分離時,兩種物質分離度差,峰形嚴重拖尾;采用Amide色譜柱分離時,曲托喹酚和去甲烏藥堿的色譜峰出現(xiàn)峰展寬現(xiàn)象,且當運用于實際樣品的測定時,物質的色譜峰保留時間會出現(xiàn)前移,懷疑可能是由于樣品中存在部分凈化不完全的極性小分子,在通過色譜柱時與本身具有極性的Amide填料發(fā)生相互作用,短時間范圍內遮擋了填料表面的活性位點,從而減小了待測物與填料的接觸面積,降低了色譜保留行為,進而導致出峰時間提前;而考察HSS T3柱時,兩種物質的色譜峰峰形對稱性好、分離度好,與C18色譜柱比較,該色譜柱對于曲托喹酚和去甲烏藥堿的響應較強,同時對于強極性的化合物也有一定的保留效果,因此,為了與高通量興奮劑的分析方法兼容,本研究選擇了HSS T3(100 mm×2.1 mm,1.8 μm)作為最佳色譜柱。

2.2.2 流動相的選擇

流動相的優(yōu)化對于被測物的峰形以及響應強度有著重要的影響。本研究對流動相進行優(yōu)化,結果見圖1。

當甲醇和乙腈分別作為流動相的有機相時,曲托喹酚和去甲烏藥堿的峰形對稱性較好,但在甲醇中兩種物質的響應明顯增強;緩沖鹽體系作為流動相時,可以改善物質的峰形,而加入酸則可以增強化合物的電離,通過比較甲醇-水溶液體系、甲醇-水(含0.1%甲酸)體系和甲醇-10 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)體系,結果發(fā)現(xiàn),甲醇-10 mmol/L甲酸銨水溶液(含0.1%甲酸)體系下兩種物質的響應最強,峰形最好,在此基礎上優(yōu)化洗脫條件,得到兩種物質的最佳色譜圖,見圖2。

2.2.3 提取溶劑的選擇

待測物的結構式中均含有酚羥基, 酸性條件可以抑制酚羥基的電離, 使化合物呈現(xiàn)分子狀態(tài),更容易被有機物提取出來。分別采用0.5%甲酸-甲醇(FM)、0.5%甲酸-乙醇(FE)、0.5%乙酸-甲醇(HM)、0.5%乙酸-乙腈(HA)、0.5%乙酸-乙醇(HE)5種不同提取溶劑對辣椒中去甲烏藥堿和曲托喹酚進行提取,結果見圖3。5種提取液均能將待測物質提取出來,FE提取溶劑中,曲托喹酚和去甲烏藥堿的提取效率最高,故在后續(xù)實驗中選擇FE為提取溶液。

圖3 提取溶劑對曲托喹酚和去甲烏藥堿回收率的影響(n=3)Fig.3 Effects of extraction solvents on the recovery rates of higenamine and tretoquinol (n=3)

2.2.4 凈化劑的選擇

由于調味品基質較復雜,若樣品不經凈化,提取后的上清液顏色太重,色譜圖基線本底高,方法靈敏度差;相比液液萃取法、固相萃取法,采用分散固相萃取具有分析速度快、綠色環(huán)保、分析成本低等優(yōu)點[24,26]。因此,首先通過單一凈化劑考察法對凈化劑進行優(yōu)化,結果見圖4。

圖4 吸附劑種類對曲托喹酚和去甲烏藥堿回收率的影響(n=3)Fig.4 Effects of sorbent types on the recovery rates of higenamine and tretoquinol (n=3)

由圖4可知,當加入填料200 mg PSA、200 mg NH2和200 mg中性Al2O3分別凈化時,曲托喹酚和去甲烏藥堿均有不同程度的吸附,導致回收率偏低; 而填料200 mg C18、200 mg GCB和200 mg EMR分別進行凈化時,對于兩種化合物的吸附較小。因此,進一步采用以下4種組合方案:GCB 100 mg+C18100 mg; GCB 100 mg+EMR 100 mg;C18100 mg+EMR 100 mg; GCB 65 mg+C1865 mg+EMR 65 mg,結果見圖5。 4種不同組合方案對曲托喹酚和去甲烏藥堿的回收率影響較小,回收率較穩(wěn)定,且均滿足分析的要求?；贑18可以去除樣品中的非極性分子[31],GCB可以去除樣品中的色素[32],EMR可以去除樣品中的脂類[33],三者配合使用可減少基質干擾,延長色譜柱的使用壽命。

圖5 不同凈化劑組合對曲托喹酚和去甲烏藥堿回收率的影響(n=3)Fig.5 Effects of different purificant combinations on the recovery rates of higenamine and tretoquinol (n=3)

2.3 方法學考察

2.3.1 檢出限和定量限

依據(jù)標準GB/T 27417-2017《合格評定 化學分析方法確認和驗證指南》中關于檢出限的規(guī)定,本實驗通過在樣品中添加低濃度目標物,按照1.4.2進行樣品前處理,經儀器測定后,結合儀器測定結果以及被測化合物的信噪比確定方法的檢出限和定量限,見表2。

表2 不同調味品中曲托喹酚和去甲烏藥堿的線性方程、檢出限、定量限和基質效應Table 2 Linear equations, limits of detection, limits of quantification and matrix effects of higenamine and tretoquinol in different condiments

結果表明,曲托喹酚的檢出限和定量限在6類基質中一致,分別為0.03,0.1 μg/kg。而去甲烏藥堿的檢出限和定量限在不同基質中有所不同,在辣椒、辣醬、火鍋底料、八角基質中,去甲烏藥堿的檢出限和定量限分別為0.1,0.5 μg/kg;在花椒和胡椒基質中,去甲烏藥堿的檢出限和定量限分別為5.0,25 μg/kg。

SN/T 5171-2019《出口植物源性食品中去甲烏藥堿的測定 液相色譜-質譜/質譜法》中規(guī)定了白菜、火龍果、橙子、花生、辣椒、川芎中出口植物源食品中去甲烏藥堿殘留量的測定,其檢出限為10.0 μg/kg,定量限為30.0 μg/kg,與國標方法比較,本方法更靈敏;與Yan 等[24]所建立的方法比較,除花椒和胡椒外,本方法的定量限更低。

2.3.2 標準曲線和基質效應

移取適量標準溶液,分別采用初始流動相和空白樣品提取液配制成系列標準工作液,以質量濃度作為橫坐標,外標和內標的定量離子與峰面積之比作為縱坐標,繪制標準曲線,以斜率之比考察6類調味品中的基質效應,在辣椒、辣醬、火鍋底料、八角中,曲托喹酚的基質效應介于86.8%～96.6%之間,基質效應不明顯,去甲烏藥堿的基質效應介于125.2%～241.9%之間,表現(xiàn)出明顯的基質效應,由于兩種物質同時進行分析,因此在后續(xù)實際樣品的測定中,采用基質標準曲線進行定量分析,結果顯示,去甲烏藥堿和曲托喹酚在質量濃度0.05～5.0 ng/mL范圍內線性系數(shù)均大于0.995,線性關系良好。

然而在胡椒和花椒基質中,曲托喹酚的基質效應分別為101.8%和97.8%,基質效應不明顯,可采用溶劑標準曲線定量分析;對于去甲烏藥堿,由于花椒和胡椒中含有內源性去甲烏藥堿,所以空白基質不容易找到,導致用空白提取液配制標準溶液計算基質效應不準確。針對花椒和胡椒樣品中去甲烏藥堿的分析,前處理過程中,樣品提取液被稀釋50倍,稀釋倍數(shù)較大,通過分析花椒、胡椒樣品以及對應的加標樣品中去甲烏藥堿的含量,證明此時基質中本身存在的物質對于去甲烏藥堿的測定基本不存在影響,因此后續(xù)采用溶劑標準曲線定量分析。

2.3.3 回收率和精密度

取空白辣椒、八角、火鍋底料(含油)、辣醬4類樣品,每類樣品中分別加入3個不同濃度水平1.0,2.0,10.0 μg/kg的標準物質;按照上述前處理步驟處理,回收率見表3。

表3 調味品中去甲烏藥堿和曲托喹酚的回收率(n=6)Table 3 Recovery rates of higenamine and tretoquinol in condiments (n=6)

結果表明,4類基質中曲托喹酚的平均回收率介于83.7%～111.9%之間,精密度小于7%;去甲烏藥堿的平均回收率介于94.4%～113.1%之間,精密度小于11%。

取花椒、胡椒兩類樣品,若仍然按上述4類基質中的添加水平添加,則本底值太高,添加效果不明顯,所以選擇去甲烏藥堿的3個添加水平分別為50,100,500 μg/kg,曲托喹酚的添加水平仍為1.0,2.0,10 μg/kg,按照上述前處理步驟處理,曲托喹酚的平均回收率介于84.5%～100.9%之間,精密度小于5%;去甲烏藥堿的平均回收率介于88.8%～118.0%之間,精密度小于16%。

綜上所述,6種基質中所測回收率結果滿足GB/T 27417-2017附錄A中規(guī)定的濃度水平范圍(<0.1 mg/kg),回收率在60%～120%范圍內,濃度在0.1～1 mg/kg范圍內,回收率在80%～110%范圍內;精密度結果基本滿足GB/T 27417-2017附錄B中規(guī)定的被測組分含量為1～1 000 μg/kg(1 mg/kg)時的要求。

2.4 實際樣品的測定

從市場上隨機購買了44種調味品,依照本方法進行實驗,實驗結果表明所有樣品中均未檢出曲托喹酚,70.4%樣品中檢出去甲烏藥堿,結果見表4,含量介于0.56～1 962 μg/kg之間。所測的花椒和胡椒樣品中均有去甲烏藥堿檢出,含量相對較高,其中花椒樣品中去甲烏藥堿含量介于206～1 962 μg/kg之間;胡椒樣品中去甲烏藥堿含量介于24.9～488 μg/kg之間;只測了1個八角樣品,去甲烏藥堿未檢出;所測1個油辣椒中去甲烏藥堿含量為2.51 μg/kg;8個辣醬樣品中,5個未檢出,3個有檢出,含量較低,介于0.56～1.57 μg/kg之間;6個火鍋底料中,1個未檢出,其余5個含量介于0.57～7.82 μg/kg之間;2個燒烤料和咖喱粉中均有檢出,含量介于0.80～2.36 μg/kg之間;4個腌制料中,2個有檢出,含量分別為2.32 μg/kg和3.23 μg/kg。

表4 實際調味品中去甲烏藥堿的含量Table 4 The content of higenamine in actual condiments

3 結論

本研究同時分析去甲烏藥堿和曲托喹酚,并將調味品種類從植物源調味品拓展至復合調味品,針對樣品基質和目標物固有的特性,對方法進行系統(tǒng)的優(yōu)化及開發(fā),建立了不同種類調味品中去甲烏藥堿和曲托喹酚的分析方法。樣品經0.5%甲酸的乙醇提取,C18、GCB和EMR 3種填料混合凈化,UPLC-MS/MS分析,內標法定量。將該方法應用于常見市售的44種調味品中,所有樣品中均未檢出曲托喹酚,部分檢出去甲烏藥堿,結合配料信息,其中花椒和胡椒樣品的去甲烏藥堿含量最高,對于配料表中明確含有花椒、胡椒等成分的調味料樣品,去甲烏藥堿含量其次。所開發(fā)的方法具有靈敏度高、分析速度快、穩(wěn)定性好和通用性強的特點,適合于調味品中去甲烏藥堿和曲托喹酚的分析。鑒于去甲烏藥堿作為部分植物源調味品中的內源性物質,為了避免大型賽事中運動員因誤服造成興奮劑陽性事件,在本研究基礎上,有必要開展對采用含去甲烏藥堿的調味品加工后的食品的監(jiān)控以及不同食品加工工藝對去甲烏藥堿殘留量的研究工作;而對于曲托喹酚,目前還沒有明確的調味品或食品中的相關標準,可進一步將其標準化。