楊 敏, 李清源, 向琮琳,4, 陳寶林,傅 劭, 杜克兵, 張冬林, 許 林*

(1. 武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所, 武漢 430075; 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝林學(xué)學(xué)院, 武漢 430070;3.佐治亞大學(xué)園藝系, 美國 雅典 30602; 4.武漢市江夏區(qū)園林和林業(yè)局, 武漢 430200)

花香是園林植物的重要觀賞性狀之一,有香氣的山茶屬植物花朵極為罕見[1].岳麓連蕊茶(Camelliahandelii)是山茶屬連蕊茶組的常綠灌木,原產(chǎn)于廣西、湖南、湖北、四川等地[2],為我國特有樹種,其花朵密集,具香氣,抗逆性強(qiáng),是山茶屬中少有的香花資源之一,具有廣闊的應(yīng)用前景[3].目前山茶屬僅有少數(shù)香花型種類的香氣成分被鑒定,如揮發(fā)性成分香氣物質(zhì)以順式氧化芳樟醇、水楊酸甲酯、十四烷等為主的‘克瑞墨大牡丹’(C.japonicavar.‘Kramer’s supreme’)[4];以苯乙酮、順式-芳樟醇氧化物和芳樟醇為主的茶梅‘冬星’(C.sasanqua‘Dongxing’)[5]、以芳樟醇、1,8-桉葉素、苯乙醇為香氣主體成分的云南核果茶(PyrenariayunnanensisHu)[6]等.尚未見岳麓連蕊茶香氣研究報(bào)道.

本文以岳麓連蕊茶和單體紅山茶(Camelliauraku(Mak.) Kitamura)為研究對(duì)象,通過感官評(píng)價(jià)分析了兩種茶花的香氣特征及類型,采用頂空固相微萃取技術(shù)(head-space solid-phase microextraction, HS-SPME)結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)的分析方法對(duì)其不同部位在開花過程中的揮發(fā)性成分進(jìn)行了檢測(cè).其中固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)用于分析植物組織中的揮發(fā)性成分[7],其萃取效果佳、簡(jiǎn)單、樣品攝取量少、低成本,可定量[8];GC-MS 技術(shù)則具有較高的靈敏度、分辨率和大量標(biāo)準(zhǔn)譜庫,能夠分析具有揮發(fā)性的小分子代謝物,是目前揮發(fā)性成分的主要分析平臺(tái)之一[9].如今,已應(yīng)用于多種花果香氣的揮發(fā)性成分檢測(cè)中,如玉簪[10]、玫瑰[11]、獼猴桃[12]等.本研究為了解岳麓連蕊茶香氣釋放機(jī)理奠定了基礎(chǔ), 為不同類型的茶花香氣形成提供了技術(shù)參考,并對(duì)進(jìn)一步克隆香氣相關(guān)基因、開展茶花芳香轉(zhuǎn)基因育種具有指導(dǎo)意義.

1 材料與方法

1.1 感官評(píng)價(jià)

采集盛花期的岳麓連蕊茶和單體紅山茶的新鮮枝條插在水中,置于(25±1) ℃室內(nèi)平衡1 h左右,通過30人小組(21女9男)反復(fù)嗅聞茶花,選擇最符合樣品的感官描述詞,如花香(floral)、甜香(sweet)、草香(grassy)、果香(fruity)、青香(green)、脂肪香味(fatty)、苦澀香味(bitter)、辛辣味(spicy)、蠟質(zhì)味(waxy)等[13].另外,采用10分量表對(duì)香氣強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:無氣味0,弱:1～3,中等:4～6,重度:7～10.在數(shù)據(jù)處理之前,對(duì)一致性和重復(fù)性進(jìn)行評(píng)估以剔除異常值,并以平均得分(取整)作為最終結(jié)論.

1.2 研究材料及儀器

研究對(duì)象為武漢市農(nóng)業(yè)科學(xué)院林業(yè)果樹研究所茶花資源圃種植的8年生岳麓連蕊茶、單體紅山茶.氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)(美國 Agilent 公司);65 μm PDMS/DVB SPME萃取頭及SPME手動(dòng)進(jìn)樣器,均產(chǎn)自美國Supelco公司;10 μL N型液相進(jìn)樣針(上海Truelab有限公司);玻璃頂空進(jìn)樣瓶;甲醇試劑;內(nèi)標(biāo)溶液:癸酸乙酯(純度99.99%)(德國CNW科技公司).標(biāo)準(zhǔn)品:C9～C40正構(gòu)烷烴標(biāo)樣(美國Thermo公司).

1.3 GC-MS分析

色譜條件:毛細(xì)管柱 HP-5MS,載氣為高純氦氣(99.999%),流速為 1.0 mL · min-1,進(jìn)樣口溫度 250 ℃;升溫程序:起始溫度 50 ℃保持 2 min,按 3 ℃·min-1升溫至 110 ℃,然后以5 ℃·min-1升溫至 220 ℃,保持 2 min.質(zhì)譜條件:電離源為 EI,其電離能量 70 eV,MS 四級(jí)桿溫度為 260 ℃,離子阱溫度 230 ℃,質(zhì)量掃描范圍 30～500 u.進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣.

選擇岳麓連蕊茶和單體紅山茶的健壯植株,分別于蕾期、初花期、盛花期、末花期4個(gè)開花時(shí)期采集花朵樣品,其中,盛花期的花朵分為花瓣和雄蕊.稱取并記錄單花花朵、雄蕊、花瓣鮮樣質(zhì)量,迅速分別裝入50 mL頂空進(jìn)樣瓶中,使用10 μL平頭微量進(jìn)樣器加入 1 μL(1×10-5體積濃度)的癸酸乙酯內(nèi)標(biāo)(以甲醇為溶劑)并密封.

將老化過的萃取頭(65 μm PDMS/DVB SPME)插入進(jìn)樣瓶中,室溫條件(25±2)℃頂空吸附30 min.隨后將萃取頭插入GC-MS 進(jìn)樣口解析5 min.為避免雜質(zhì)殘留,首次使用的SMPE萃取頭需在GC-MS進(jìn)樣口270 ℃條件下老化30 min.每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù).

1.3 數(shù)據(jù)分析

定性分析:根據(jù)質(zhì)譜圖數(shù)據(jù),使用Xcalibur軟件將峰圖匹配至NIST標(biāo)準(zhǔn)譜圖庫,對(duì)保留時(shí)間、質(zhì)譜峰圖等參數(shù)進(jìn)行分析,結(jié)合保留指數(shù)對(duì)化合物進(jìn)行定性.根據(jù)線性升溫公式計(jì)算各成分的保留指數(shù)(rentention index,RI)[14]:

IR=100Z+100[tR(x)-tR(Z)]/[tR(Z+1)-tR(z)],

式中,Z和Z+1分別表示正構(gòu)烷烴的碳原子數(shù),x表示待分析的化合物,tR(X)為碳原子處于tR(Z)和tR(Z+1)之間的正構(gòu)烷烴的色譜峰的保留時(shí)間.

定量分析:以癸酸乙酯為內(nèi)標(biāo),利用待測(cè)化合物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比,進(jìn)而求得各個(gè)揮發(fā)性成分的含量.揮發(fā)性成分絕對(duì)含量計(jì)算公式如下:揮發(fā)性成分含量(μg · g-1)=(待測(cè)物質(zhì)的峰面積×內(nèi)標(biāo)濃度×內(nèi)標(biāo)體積)/(內(nèi)標(biāo)的峰面積×樣品質(zhì)量).利用Excel和IBM SPSS Statistics 26軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,,組間比較采用單因素方差分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 感官評(píng)價(jià)

兩種茶花的香氣強(qiáng)度和香氣屬性存在明顯差異.岳麓連蕊茶被評(píng)價(jià)為中度的 “草香”、“花香”和“甜香”;而單體紅山茶則為較弱的“花香”(表1).這與 GC-MS 的定量結(jié)果一致,萜類、醇類的化合物具有較高含量.

表1 茶花感官評(píng)價(jià)表

2.2 兩種茶花不同開花時(shí)期及部位的香氣變化規(guī)律分析

2.2.1 不同開花時(shí)期香氣變化規(guī)律分析 經(jīng)GC-MS分析,不同揮發(fā)性成分在兩種茶花不同花期的釋放量存在較大差異.由蕾期至末花期,兩種茶花的香氣釋放量均呈先上升后降低的趨勢(shì).岳麓連蕊茶蕾期揮發(fā)性成分釋放量最少,僅為1.25 μg · g-1,于其盛花期到達(dá)頂峰49.23 μg · g-1(圖1a).相比之下,單體紅山茶各個(gè)時(shí)期的揮發(fā)性成分釋放量均低于前者,盛花期揮發(fā)性成分釋放量最高為15.23 μg · g-1,僅約為岳麓連蕊同期揮發(fā)性成分釋放量的30% .

注:*、**、***、ns分別表示p<0.05,p<0. 01,p<0.001,無顯著差異,下圖同.圖1 兩種茶花各花期及部位的揮發(fā)性物質(zhì)釋放總量分析Fig.1 Analysis of the total aroma release of two kinds of camellia at each flowering periods and tissues

從岳麓連蕊茶4個(gè)采樣時(shí)期的樣品中共檢測(cè)出揮發(fā)性成分50種(表2),而單體紅山茶共檢測(cè)到29種揮發(fā)性成分(表3).還可以看出,在兩種茶花香氣物質(zhì)均釋放量最高的盛花期,揮發(fā)性成分均最多,其中岳麓連蕊茶為34種,單體紅山茶為19種.

表2 岳麓連蕊茶不同花期和部位的揮發(fā)性成分釋放量

表3 單體紅山茶不同花期和組織的揮發(fā)性成分釋放量

就盛花期來看,兩種茶花中相對(duì)含量5% 以上的成分在岳麓連蕊茶中有4種,單體紅山茶中6種.其中岳麓連蕊茶中相對(duì)含量由高到低依次為苯乙醇(43.97%)、α-羅勒烯(24.8%)、芳樟醇氧化物(呋喃類)(6.94%)、芳樟醇(6.50%);單體紅山茶中相對(duì)含量由高到低依次為反式芳樟醇氧化物(呋喃類)(33.23%)、順-3-壬烯-1-醇(16.91%)、苯乙醛(15.1%)、芳樟醇(7.55%)、仲辛酮(6.37%)、四氫-2,2,6-三甲基-6-乙烯基-3-吡喃酮(5.03%).

2.2.2 不同部位的香氣變化規(guī)律分析 揮發(fā)性成分在不同釋香部位中的含量存在較大差異.總體上看,岳麓連蕊茶的花瓣和雄蕊中苯乙醇和α-羅勒烯的相對(duì)含量均明顯高于其它揮發(fā)性成分(表2);而單體紅山茶中,反式芳樟醇氧化物(呋喃類)和順-3-壬烯-1-醇均為其主要揮發(fā)性成分(表3).兩種茶花中,雄蕊的揮發(fā)性成分含量均遠(yuǎn)高于花瓣中的含量(圖1b).岳麓連蕊茶花瓣、雄蕊的香氣釋放量分別為16.06 μg · g-1和42.78 μg · g-1,約為同期單體紅山茶香氣釋放量的6倍(2.73 μg · g-1)和3倍(16.00 μg · g-1).

2.3 兩種茶花不同開花時(shí)期及部位揮發(fā)性成分類別分析

在岳麓連蕊茶與單體紅山茶花朵中均檢測(cè)到7類相同的揮發(fā)性成分,包括苯環(huán)類/苯丙素類、醛類、萜類、醇類、酮類、烴類和酯類(表4).這些成分的釋放量同樣是先增加后減少,于盛花期達(dá)到最大釋放量,表現(xiàn)出與總釋放量相似的變化規(guī)律.

表4 兩種茶花不同花期和釋香部位揮發(fā)性成分分類

兩種茶花釋放的揮發(fā)性成分的成分、含量差異較大.岳麓連蕊茶花朵的主體揮發(fā)性成分以萜類和苯環(huán)類化合物為主.在開花的整個(gè)過程中,萜類化合物的相對(duì)含量均最高,蕾期、初花期、盛花期、末花期中萜類化合物的相對(duì)含量分別為68.89%、90.55%、52.32%、89.98%,其中盛花期的絕對(duì)含量達(dá)到頂峰25.78 μg · g-1.對(duì)于單體紅山茶各時(shí)期的揮發(fā)性成分而言,除酯類化合物主要釋放于蕾期和初花期,其他化合物均主要釋放于盛花期和末花期(以萜類和苯環(huán)類化合物為主).

進(jìn)一步分析兩種茶花的花瓣和雄蕊不同類別揮發(fā)性成分的含量,結(jié)果表明,萜類化合物在岳麓連蕊茶不同部位的含量均為最高, 總釋放含量為35.47 μg · g-1,且花瓣和雄蕊釋放的萜類化合物的含量存在差異;而單體紅山茶的萜類化合物幾乎都來源于雄蕊.此外,苯環(huán)類/苯丙素類化合物在岳麓連蕊茶中的總釋放含量(17.95 μg · g-1)僅次于萜類化合物,單體紅山茶以萜類化合物(5.63 μg · g-1)為主,其次為苯環(huán)類化合物(4.70 μg · g-1).

3 討論

植物花香化合物是植物花朵釋放的次生代謝產(chǎn)物,由許多低分子量、易揮發(fā)的化合物混合而成[15].根據(jù)其結(jié)構(gòu)不同可分為萜烯(terpenoids)、苯丙素/苯環(huán)類(phenylpropanoids/benzenoids)和脂肪酸(fatty acid)三大類[16].不同植物釋放的揮發(fā)性成分差異較大,如在臘梅[17]、濃香型百合[18]中,反式β-羅勒烯和芳樟醇為其主要揮發(fā)性成分;苯乙醇、香茅醇、橙花醇、香葉醇乙酸酯類化合物在玫瑰花中相對(duì)含量較高[19].

本研究中兩種茶花的揮發(fā)性成分物質(zhì),均為萜類化合物占主導(dǎo)地位,與范正琪等[4]對(duì)‘克瑞墨大牡丹’的研究結(jié)果較為一致.但主體成分與已報(bào)道的其它茶花種(品種)不完全相同,如芳樟醇是‘克瑞墨大牡丹’、云南核果茶、茶梅‘冬星’共同的重要揮發(fā)性成分[4-6];苯乙酮、芳樟醇及其氧化物為‘冬玫瑰’、‘小玫瑰’、昭和之榮’等多個(gè)茶梅品種的主要揮發(fā)性成分[20].說明不同茶花之間的揮發(fā)性成分也存在巨大差異.本研究中岳麓連蕊茶中的主體成分為苯乙醇(具有花香[21]),α-羅勒烯(具有草香和橙花香[22]),單體紅山茶中主體成分為反式芳樟醇氧化物(呋喃類)(具有強(qiáng)烈的甜香和花香[23]).因此,推測(cè)α-羅勒烯、反式芳樟醇氧化物(呋喃類)可能分別是岳麓連蕊茶與單體紅山茶的致香成分,而岳麓連蕊茶的萜類化合物釋放量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于單體紅山茶,這可能是兩種茶花香氣嗅覺差異的主要原因.

隨著花朵的開放,其釋放出的揮發(fā)性成分的種類和含量均呈明顯變化.本研究中,兩種茶花的蕾期至末花期,揮發(fā)性成分和釋放量均呈現(xiàn)先增加后減少的變化趨勢(shì),盛花期的揮發(fā)性成分相對(duì)含量最高且物質(zhì)種類最為豐富.這與鼓槌石斛(Dendrobiumchrysotoxum)[24]、東方百合‘西伯利亞’(Lilium‘Siberia’)、亞洲百合‘羅馬廣場(chǎng)’(Lilium‘Novano’)[25]、文心蘭(Oncidiumhybridum)[26]等研究結(jié)果較為一致.

梅花(Prunusmumi)[27]的主要香氣化合物乙酸苯甲酯在花瓣和雄蕊中均有釋放,但主要來源于后者;芍藥‘巧玲’(Paeonialactiflora‘Qiao ling’)[28]在瓣化雄蕊中香氣物質(zhì)釋放量最高,外層花瓣次之,而雌蕊與萼片中較少,其主要揮發(fā)性成分芳樟醇與苯乙醇主要分布在花瓣與瓣化雄蕊中.王潔等[29]認(rèn)為內(nèi)輪花瓣和雄蕊是茶梅‘冬玫瑰’香氣釋放的主要部位.表明花瓣與雄蕊均對(duì)花香的釋放有著同樣重要的貢獻(xiàn).也有一些花朵的主要揮發(fā)性成分釋放于除花瓣和雄蕊以外的花器官.如玉蘭‘飛黃’(Magnoliadenudata‘Feihuaug’)不同輪次花被片中,內(nèi)輪花被片揮發(fā)性成分總量最高[30];雜交蘭[31]花器官不同部位中, 花瓣和萼片主要釋放β-石竹烯,唇瓣主要釋放β-羅勒烯.本研究中,岳麓連蕊茶的花瓣和雄蕊均釋放出大量的揮發(fā)性成分且相對(duì)含量差異不大,而單體紅山茶的雄蕊釋放了主要的揮發(fā)性成分,這與Jullien等[32]對(duì)六種茶花的揮發(fā)性成分研究結(jié)果較為一致,即雄蕊積累的揮發(fā)性成分遠(yuǎn)高于花瓣.有報(bào)道稱植物的香氣通常是由花器官的基本薄壁組織或特化的腺狀表皮細(xì)胞[33]中產(chǎn)生,花器官中花香的釋放取決化學(xué)成分合成區(qū)域膜結(jié)構(gòu)上的某些載體對(duì)其選擇性的釋放特性[34].本研究中岳麓連蕊茶是否因雄蕊和花瓣均含有的產(chǎn)生香氣的細(xì)胞結(jié)構(gòu)而有異于單體紅山茶,還有待進(jìn)一步深入研究分析.

4 結(jié)論

本研究以有香茶花岳麓連蕊茶和無香茶花單體紅山茶為試材,運(yùn)用固相微萃取和氣質(zhì)色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)其不同開花時(shí)期(蕾期、初花期、盛花期、末花期)和部位(花瓣、雄蕊)揮發(fā)性成分和相對(duì)含量進(jìn)行了測(cè)定.在岳麓連蕊茶與單體紅山茶的開花的四個(gè)時(shí)期分別共計(jì)檢測(cè)到50、29種揮發(fā)性成分.揮發(fā)性成分的釋放量隨花朵的開放,呈先上升后下降的趨勢(shì).岳麓連蕊茶的花瓣和雄蕊均為其重要的釋香器官,而單體紅山茶的雄蕊釋放了主要的揮發(fā)性成分.兩種茶花的揮發(fā)性成分均可分為苯環(huán)類/苯丙素類、醛類、萜類、醇類、酮類、烴類和酯類這7類化合物.結(jié)合感官評(píng)價(jià)和定量分析,推測(cè)苯乙醇和α-羅勒烯可能為岳麓連蕊茶的致香成分;反式芳樟醇氧化物(呋喃類)可能為岳麓連蕊茶的致香成分.