王金耀 ，楊 陽(yáng) ，，宋紅賢 ，李 森 ，邢國(guó)明 ，亢秀萍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太谷 030801；2.呂梁學(xué)院生命科學(xué)系，山西 呂梁 033000）

大花耬斗菜（Aquilegia glandulosa）是毛茛科耬斗菜屬的宿根花卉，其花型獨(dú)特如漏斗，花大而繁多，花色亮麗，花期長(zhǎng)且耐寒，有很高的觀(guān)賞價(jià)值[1-2]。耬斗菜展現(xiàn)出廣泛的生態(tài)學(xué)和形態(tài)學(xué)多樣性，保持了較高的種間雜交親和性[3-4]，因經(jīng)，開(kāi)展耬斗菜的生理和形態(tài)的功能遺傳學(xué)分析，對(duì)被子植物進(jìn)化研究具有很大的價(jià)值[5]。此外，退化雄蕊不能產(chǎn)生可育花粉，不能發(fā)揮雄性生殖的作用，但是在進(jìn)化過(guò)程中，一部分退化雄蕊獲得了一些新功能[6]，幫助植物繁殖，研究不同的近緣關(guān)系的物種間退化雄蕊的功能差異，可揭示退化雄蕊在被子植物系統(tǒng)進(jìn)化中的意義[7-8]。

本研究利用常規(guī)石蠟切片技術(shù)，從顯微水平上觀(guān)察了大花耬斗菜低溫春化后雄蕊原基分化及發(fā)育的過(guò)程，掌握大花耬斗菜的生殖發(fā)育規(guī)律，以期為耬斗菜退化雄蕊作用的研究提供借鑒。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為大花耬斗菜（Aquilegia glandulosa），種子購(gòu)買(mǎi)于泛美種子公司。

1.2 試驗(yàn)方法

2015年1月在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)日光溫室苗床播種大花耬斗菜種子，待幼苗長(zhǎng)至12片葉時(shí)，放置于人工氣候箱為5℃低溫春化處理，處理結(jié)束將植株放置在日均溫為20℃的自然條件下生長(zhǎng)，每3 d取材一次。取材后剝?nèi)ネ鈱由徸~，露出小葉包裹的莖尖，立即放入FAA固定液中固定并保存[9]，常規(guī)石蠟切片，采用番紅-固綠雙重染色法[10-11]在低倍顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。

2 結(jié)果與分析

2.1 大花耬斗菜雄蕊的形態(tài)結(jié)構(gòu)

耬斗菜花呈輻射對(duì)稱(chēng)，由外到內(nèi)依次是5枚萼片、5枚花瓣和雄蕊群（圖1-1）。雄蕊多數(shù)，共10輪，每輪有5枚雄蕊，其中5輪雄蕊與萼片對(duì)生，5輪與花瓣對(duì)生，顯示出雄蕊群輪間交互（圖1-2）。雄蕊群外部的花絲短，花藥較大；靠近內(nèi)側(cè)花絲伸長(zhǎng)，花藥逐漸變小。退化雄蕊的花絲最長(zhǎng)，持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)，花藥最小。花絲表皮光滑，圓柱形?；ㄋ幍咨?，呈黃色橢圓形，表面有明顯的分界，分為左右兩半。

2.2 雄蕊原基的發(fā)生與分化

大花耬斗菜的花原基分化出花瓣原基后，頂端分生組織縱向高度隆起呈球狀（圖1-3），在球狀分生組織底部、花瓣原基內(nèi)側(cè)，對(duì)稱(chēng)出現(xiàn)橫向隆起，分化成最外輪雄蕊原基。隆起的組織呈圓柱狀，細(xì)胞小，細(xì)胞大小相同，細(xì)胞質(zhì)濃密（圖1-4）。

最外輪雄蕊原基發(fā)生后，雄蕊原基繼續(xù)橫向分化生長(zhǎng)。其內(nèi)側(cè)的雄蕊原基依次向頂端發(fā)生，可以看出雄蕊原基的發(fā)育順序是由外側(cè)向內(nèi)側(cè)，即最外部雄蕊原基首先分化，然后依次產(chǎn)生其他每一輪雄蕊原基，直到最后一個(gè)退化雄蕊原基出現(xiàn)。先發(fā)育的外側(cè)雄蕊原基最大，依次發(fā)育的內(nèi)側(cè)雄蕊原基逐輪變小，退化雄蕊原基最小（圖1-5、圖1-6）。

2.3 花絲的發(fā)育

大花耬斗菜雄蕊原基分化結(jié)束后，進(jìn)入了雄蕊的發(fā)育階段，每一個(gè)圓柱形的雄蕊原基頂端膨大發(fā)育成花藥，下端發(fā)育成花絲，花絲的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，最外層是一層角質(zhì)化的表皮細(xì)胞，表皮內(nèi)是薄壁細(xì)胞，中央由維管束貫穿（圖2-1），直達(dá)藥隔，為花藥的發(fā)育提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。從雄蕊群的花絲發(fā)育來(lái)看，最頂端的退化雄蕊的花絲生長(zhǎng)發(fā)育早于下端雄蕊的花絲發(fā)育，并且從花絲長(zhǎng)度來(lái)看，上端雄蕊的花絲長(zhǎng)度均長(zhǎng)于下端的雄蕊花絲。退化雄蕊的花絲在發(fā)育最后階段，中央維管束消失，只剩下角質(zhì)化的表皮細(xì)胞，其他功能雄蕊的花絲不存在上述現(xiàn)象。

2.4 花藥的發(fā)育

全部雄蕊原基分化結(jié)束后，頂端即最內(nèi)層雄蕊頂端最先開(kāi)始膨大，最下端及最外層的雄蕊發(fā)育明顯滯后。從切片上可以看出，雄蕊的發(fā)育順序是從頂端至下端，最內(nèi)側(cè)向外側(cè)離心式發(fā)育。圓柱形雄蕊頂端膨大發(fā)育，最后發(fā)育成橢圓形花藥。從花藥的橫切和縱切可以看出，未成熟大花耬斗菜的花藥分為4個(gè)藥室，縱軸長(zhǎng)于橫軸，且花藥中央有很明顯的分界。

雄蕊發(fā)育早期，雄蕊頂端外有一層表皮，表皮層內(nèi)是一群形狀相似、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、分裂活躍的幼嫩細(xì)胞即花藥原始體。從花藥的縱切面看，花藥膨大，花藥中央出現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)較濃，染色較深，呈現(xiàn)一列或數(shù)列排布的孢原細(xì)胞（圖2-2）。孢原細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂和分化，外層細(xì)胞與表皮一起構(gòu)成花粉囊的壁層，內(nèi)層細(xì)胞為造孢細(xì)胞?；ㄋ幹胁考?xì)胞進(jìn)一步分裂、分化，出現(xiàn)了藥隔和長(zhǎng)橢圓形的維管束。

花粉囊最內(nèi)層為絨氈層，大花耬斗菜絨氈層的細(xì)胞比外圍的壁細(xì)胞大，多為長(zhǎng)方形或多邊形，緊密的排列在花粉囊的內(nèi)壁，具有多核現(xiàn)象（圖2-4，5）。隨著花藥的發(fā)育，絨氈層細(xì)胞開(kāi)始分解消失。切片觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，退化雄蕊也會(huì)形成較小的花粉囊，但花粉囊內(nèi)層絨氈層細(xì)胞與正常功能雄蕊不同。

造孢細(xì)胞經(jīng)過(guò)分裂，形成大量小孢子母細(xì)胞，大花耬斗菜小孢子母細(xì)胞為圓球形，細(xì)胞體積大，原生質(zhì)濃厚。小孢子母細(xì)胞進(jìn)一步發(fā)育，形成圓球形小孢子（圖2-6）。

2.5 退化雄蕊

在對(duì)耬斗菜花部結(jié)構(gòu)的分化發(fā)育觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，耬斗菜的退化雄蕊原基位于雄蕊群原基頂端，退化雄蕊是在最后一輪功能雄蕊原基發(fā)生后發(fā)生，之后生長(zhǎng)錐頂端變平，開(kāi)始分化雌蕊原基。說(shuō)明耬斗菜雄蕊群原基的發(fā)生是向心式發(fā)育。但雄蕊原基發(fā)生后，進(jìn)入小孢子發(fā)育時(shí)期，觀(guān)察到退化雄蕊發(fā)育先于下部的功能雄蕊，最后會(huì)形成在顯微鏡下觀(guān)察到的成熟花粉粒。在退化雄蕊發(fā)育過(guò)程中，起初花絲的發(fā)育是正常的，具有正常的結(jié)構(gòu)，但是在發(fā)育中期，維管束和薄壁細(xì)胞停止生長(zhǎng)，并且慢慢消失，花絲結(jié)構(gòu)只剩下最外層的表皮細(xì)胞，花藥中未形成和功能雄蕊一樣的絨氈層結(jié)構(gòu)，同時(shí)花粉母細(xì)胞體積小，花粉囊較小，并在切片中看到形成了小孢子（圖2-3）。

3 結(jié)論與討論

大花耬斗菜花呈輻射對(duì)稱(chēng)，最外層是5片萼片，其次是5片花瓣，內(nèi)側(cè)是雄蕊群，雄蕊多數(shù)，共10輪，每輪有5枚雄蕊，其中5輪雄蕊與萼片對(duì)生，其余5輪與花瓣對(duì)生，從而顯示出雄蕊群輪間的交互[12]。雄蕊原基的發(fā)育順序是由外側(cè)向內(nèi)側(cè)，即最外部雄蕊原基首先發(fā)育，然后依次產(chǎn)生其他每一輪雄蕊原基，直到最后一個(gè)退化雄蕊原基出現(xiàn)[13]。因此，耬斗菜花的雄蕊原基的發(fā)生屬于向心式發(fā)生[14]。從雄蕊群的花絲發(fā)育來(lái)看，最頂端的退化雄蕊的花絲生長(zhǎng)發(fā)育早于下端雄蕊的花絲發(fā)育，并且從花絲長(zhǎng)度來(lái)看，上端雄蕊的花絲長(zhǎng)度均長(zhǎng)于下端的雄蕊花絲[15]。退化雄蕊的花絲在發(fā)育最后階段，中央維管束消失，只剩下角質(zhì)化的表皮細(xì)胞，其他功能雄蕊的花絲不存在上述現(xiàn)象。

雄蕊原基分化結(jié)束后，頂端及最內(nèi)層雄蕊頂端最先開(kāi)始膨大，最下端及最外層的雄蕊發(fā)育明顯滯后。從切片上可以看出，雄蕊的發(fā)育順序是從頂端至下端，及最內(nèi)側(cè)向外側(cè)，離心式發(fā)育[16]。圓柱形雄蕊頂端膨大發(fā)育，最后發(fā)育成橢圓形花藥[17-18]。從花藥的橫切和縱切中可以看出，未成熟大花耬斗菜的花藥分為4個(gè)藥室，縱軸長(zhǎng)于橫軸，且花藥中央有很明顯的分界。

在對(duì)耬斗菜花部結(jié)構(gòu)的分化發(fā)育觀(guān)察中發(fā)現(xiàn)，耬斗菜的退化雄蕊原基位于雄蕊群原基頂端，退化雄蕊是在最后一輪功能雄蕊原基發(fā)生后發(fā)生，之后生長(zhǎng)錐頂端變平，開(kāi)始分化雌蕊原基，可以看出，耬斗菜雄蕊群原基的發(fā)生是向心式發(fā)育。但雄蕊原基發(fā)生后，進(jìn)入小孢子發(fā)育時(shí)期后，觀(guān)察到退化雄蕊發(fā)育先于下部的功能雄蕊，最后會(huì)形成在顯微鏡下觀(guān)察到的成熟花粉粒。在退化雄蕊發(fā)育的過(guò)程中，起初花絲的發(fā)育是正常的，具有正常的結(jié)構(gòu)，但是在發(fā)育中期，維管束和薄壁細(xì)胞停止生長(zhǎng)，并且慢慢消失，花絲結(jié)構(gòu)只剩下最外層的表皮細(xì)胞，花藥中未形成和功能雄蕊一樣的絨氈層結(jié)構(gòu)，同時(shí)花粉母細(xì)胞體積小，花粉囊較小，并在切片中看到形成了小孢子。退化雄蕊是否可以形成正常的花粉粒，且是否有活力，還需進(jìn)一步探索。