楊瀟湘,張 蕾,張重梅,黃小琴,胡孜進,余垚穎,鄧 越,鮮赟曦,周西全,劉 勇*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所,成都 610066;2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南作物有害生物綜合治理重點實驗室,成都 610066)

蘋果(Malusdomestica)屬于薔薇科蘋果亞科蘋果屬,營養(yǎng)價值高,維生素、礦物質(zhì)含量豐富。鹽源蘋果作為鹽源縣主導(dǎo)產(chǎn)業(yè),果皮薄而肉嫩、口感香甜脆,果大色鮮味美,近年來在市場上有著無限潛力[1]。目前來看,蘋果樹腐爛病[2]、重茬病[3]、早期落葉病,特別是早期落葉病是影響蘋果樹抗性和蘋果質(zhì)量的重大病害。

早期落葉病是一種由真菌引發(fā)的病害,易發(fā)生于高溫高濕的環(huán)境下。真菌可通過分生孢子或以菌絲體的形式盤在去年的落葉上越冬,翌年春雨后菌絲體產(chǎn)生分生孢子,孢子可利用雨水等傳播。蘋果樹葉片在感染此類疾病之后,造成蘋果葉片在前期大批量掉落,消減樹勢,并且引發(fā)二次開花、越冬芽萌發(fā),對翌年蘋果的產(chǎn)量和品質(zhì)影響極大,部分還會造成苗木損傷,降低苗木對病害的抗性。蘋果早期落葉病在我國西北黃土高原產(chǎn)區(qū)、渤海灣產(chǎn)區(qū)、黃河故道和秦嶺北麓產(chǎn)區(qū)、西南冷涼高地產(chǎn)區(qū)均有發(fā)生。

我國對蘋果早期落葉病十分重視。肖猛等[4]、楊文淵等[5]都做過早期落葉病的相關(guān)調(diào)查并提出了防治措施。與蘋果落葉病相關(guān)的探究也比較多,但關(guān)于鹽源蘋果落葉病的報道較少。所以該試驗對鹽源蘋果早期落葉病的病原菌展開探究,以期找到更多更細致的關(guān)于病原菌的信息,為蘋果早期落葉病的防治提供更多依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

PDA(馬鈴薯葡萄糖瓊脂)培養(yǎng)基(去皮馬鈴薯200g,葡萄糖20g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL);Czapek培養(yǎng)基(NaNO33.0g,K2HPO41.0g,MgSO4.7H2O 0.5g,KCl 0.5g,FeSO40.01g,蔗糖30g,瓊脂20g,蒸餾水1000mL)。

蘋果病葉采自四川省涼山彝族自治州鹽源縣。

1.2 病原菌的分離與純化

將收集回來的病斑葉子拍照記錄并進行處理,剪取病斑與健康部分交界處,分成5mm×5mm的小塊,放在75%的酒精中消毒30s,消毒后用滅菌過的蒸餾水漂洗3次,然后放于滅菌的濾紙上擦干水分,轉(zhuǎn)到加了氨芐青霉素的PDA培養(yǎng)基上,置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[6]。待病菌長出來后,及時將病菌挑出來轉(zhuǎn)到新的培養(yǎng)基上培養(yǎng),直到培養(yǎng)出純凈的病菌。把純化過后的病原菌接到準(zhǔn)備好的10mL PDA試管斜面里面,放到4℃的冰箱中進行菌種保存。

1.3 病原菌形態(tài)觀察

用直徑為5.0mm的打孔器在菌落邊緣取菌塊,接種于PDA培養(yǎng)基,置25℃恒溫培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)。待菌落長出來后,記錄菌落形態(tài)、色澤等數(shù)據(jù),并在顯微鏡下觀察孢子的類型、大小等特征。

1.4 病原菌的DNA鑒定和rDNA-ITS序列分析

在得到純凈的病原菌后,就進行病原菌的DNA鑒定。使用M5 Fungal Genomic DNA kit試劑盒進行DNA提取,隨后進行rDNA-ITS序列分析,使用真菌通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)進行PCR擴增[7],25μL PCR反應(yīng)體系為:ITS1和ITS4各1.0μL,2×PCR HeroTMMix12.5μL,ddH2O 9.5μL,病原菌DNA 1.0μL。PCR程序如下:94℃下預(yù)變性3min,94℃下變性20s、57℃下退火20s、72℃下延伸30s,共35個循環(huán),最后72℃下延伸5min[8]。得到的PCR原液送到成都擎科生物技術(shù)公司進行序列測定,把測得的序列放到NCBI官網(wǎng)上進行BLAST序列比對。

1.5 生物學(xué)特性研究

把冰箱里放的病原菌進行菌種活化,從試管中挑一個菌塊放到PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7d[9]。病原菌生長7d后,開展生物學(xué)特性研究實驗,探究不同溫度、不同碳源、不同氮源、不同光照對病原菌的生長影響。

1.5.1 不同溫度對病原菌生長的影響 將剛滅菌的PDA培養(yǎng)基倒入直徑為9cm的培養(yǎng)皿中,待凝固后,在菌落邊緣取5.0mm的菌塊,倒放在新的培養(yǎng)基中央。放入溫度設(shè)置為5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的恒溫培養(yǎng)箱中,每個處理3個重復(fù)。每天記錄病菌生長狀況并用直尺使用十字交叉法量菌塊生長的總直徑[10],結(jié)果取用兩次量取的平均值。7d后,進行數(shù)據(jù)整理。

1.5.2 不同碳源對病原菌生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基為樣,將蔗糖替換成相同質(zhì)量的果糖、葡萄糖、淀粉,對照組則加2g/L的NaCl,除此不添加其他碳源。

1.5.3 不同氮源對病原菌生長的影響 以Czapek培養(yǎng)基為樣,將NaNO3替換成相同質(zhì)量的KNO3、NH4NO3、牛肉膏,對照組不加任何氮源,加2g/L的NaCl。

1.5.4 不同光照對病原菌生長的影響 在菌落邊緣取直徑為5.0mm的菌塊,倒放在新的PDA培養(yǎng)基中央。每組3個重復(fù),分別放入恒溫為25℃的24h光照、24h黑暗和12h光照12h黑暗的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng),按照1.4.1的方法來測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 早期落葉病的癥狀

通過對鹽源蘋果早期落葉病的調(diào)查發(fā)現(xiàn),葉子在患病之后,先會出現(xiàn)紫紅色或者黑色斑點。隨著時間增長,斑點變大,斑點中間葉片開始干枯泛白或長出細小的黑斑,葉片此時也會隨之枯黃并大量掉落,少數(shù)葉柄上還會覆蓋一層白毛。

2.2 病原菌的形態(tài)鑒定

通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定,共分離出37株鹽源蘋果早期落葉病的病菌,主要有鏈格孢菌(Alternariaspp.)(86.48%)、雅致放射毛霉(Actinomucorelgans)(5.41%)、稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)(5.41%)和黒附球菌(Epicoccumnigrum)(2.70%)等,從中選取具有代表性的鏈格孢菌菌株AL47、雅致反射毛霉菌株AL91、稻黑孢菌菌株AL77、黒附球菌菌株AL21來進行形態(tài)描述與生物學(xué)實驗。

鏈格孢菌AL47菌株生長初期,菌絲為白色,生長緩慢,菌絲均勻的向四周生長呈圓形,生長到中后期時,菌絲逐漸由白色變成灰黑色,整體呈顯為絨毛狀,菌落背面為均勻的黑褐色。其分生孢子為倒棒狀或喙柱狀,顏色為灰黑色或淡褐色,有6～10個橫隔,0～4個縱隔。

雅致反射毛霉菌AL91生長初期長出的是灰褐色菌絲,生長較慢,均勻向四周鋪開呈圓形,菌落的背面則是為灰褐色,分生孢子為球形。

圖3 雅致反射毛霉菌AL91的形態(tài)特征

稻黑孢菌AL77生長初期菌絲大多為半透明的白色且細長,生長較快,頂端菌絲長得極快且不均勻,生長到后期,菌落質(zhì)地疏松呈絮狀,菌落背面為黑褐色。分生孢子呈黑色圓形,表面光滑。

圖4 稻黑孢菌菌AL77形態(tài)特征

黒附球菌AL21生長初期,菌絲為白色,生長較慢,隨著生長菌絲變成橙黃色,菌落背面是橙黃色。分生孢子球形網(wǎng)格狀,無色或淡褐色,從分生孢子梗頂端膨大處生出。

圖5 黒附球菌AL21的形態(tài)特征

2.3 不同溫度對病原菌生長的影響

4種病原菌在不同溫度下培養(yǎng)7d后,記錄的菌落生長總直徑如表1所示。4種病原菌在溫度為5℃時,菌絲生長都極不明顯,幾乎處于休眠不生長狀態(tài),在10～35℃都能生長。

表1 不同溫度對病原菌生長的影響

鏈格孢菌生長的最適溫度為30℃,平均直徑為8.5cm;雅致放射毛霉在30℃和25℃生長均比較快,平均直徑分別為7.2cm和7.1cm;稻黑孢菌在10～25℃時均較宜生長,最適溫度為25℃;黒附球菌生長的最適溫度為25℃,平均直徑為6.4cm。

2.4 不同碳源對病原菌生長的影響

4種病原菌在不同碳源環(huán)境中培養(yǎng)7d天后,所得到的的菌落生長總直徑如表2所示。4種菌在不同碳源環(huán)境中都能生長,在沒有碳源的情況下也能生長,但是菌絲比較纖細呈半透明色,分布十分稀疏。

表2 不同碳源對病原菌生長的影響

蕓苔鏈格孢、稻黑孢菌在碳源為葡萄糖的情況下生長最快,在第7d時平均直徑8.5cm。雅致放射毛霉在碳源為淀粉時,菌絲生長速度最快,其平均直徑7.2cm。黒附球菌在碳源是果糖的環(huán)境下時,菌絲生長最快,平均直徑7.8cm。

2.5 不同氮源對病原菌生長的影響

4種病原菌經(jīng)7d培養(yǎng),其在不同氮源環(huán)境下的生長直徑如表3所示。牛肉膏是4種病原菌的最適氮源。在氮源來源不同和沒有氮源的情況下,病原菌都能夠生長,但在沒有氮源的情況下,菌絲極細且不均勻,雅致放射毛霉在氮源為NH4NO3時,生長較慢,但是菌絲濃密,菌落形狀規(guī)則為圓形。

表3 不同氮源對病原菌生長的影響

2.6 不同光照對病原菌生長的影響

經(jīng)過7d的培養(yǎng),4個病原菌在不同光照條件下生長總直徑數(shù)據(jù)如表4所示。蕓苔鏈格孢在24h光照的條件下生長最好,平均直徑為7.7cm。雅致放射毛霉在光照12h黑暗12h的條件下生長最迅速,平均直徑為6cm。稻黑孢菌在各光照條件下均生長較好,但在全黑條件下的菌絲最濃密均勻。黒附球菌在24h黑暗條件下生長最迅速,平均直徑為5.7cm。

表4 不同光照對病原菌生長的影響

3 討論與結(jié)論

對患病葉子的病原菌進行組織分離提純與鑒定得出,引起鹽源蘋果早期落葉病的病原菌較多,主要有鏈格孢菌、雅致放射毛霉、稻黑孢菌、黒附球菌等。生物學(xué)特性研究試驗進一步探究了4種病原菌在不同環(huán)境下的生長狀態(tài),為進一步控制早期落葉病奠定了理論基礎(chǔ)。

由生物學(xué)特性研究試驗可知,4種病原菌在10～35℃都能正常生長。除雅致放射毛霉最合適的溫度為30℃外,其余3種病原菌的最適溫度為25℃。通過不同碳源試驗可知,蕓苔鏈格孢和稻黑孢菌在碳源為葡萄糖的情況下生長最好;雅致放射毛霉在淀粉為碳源時,生長最好;黒附球菌的最適碳源為果糖。牛肉膏是4種病原菌的最適氮源,表明4種菌在對氮源的要求上存在相似性。光照試驗表明,4種病原菌更適應(yīng)黑暗的壞境,在光照條件少的情況下生長更加旺盛。由以上試驗結(jié)果可知,病原菌能正常生長,對周圍環(huán)境條件的要求是多樣的。在后期研究中,可根據(jù)病原菌的生物學(xué)特性,來進行相關(guān)的抑制防治試驗。

綜上,研究確定了引起鹽源蘋果早期落葉病的病菌主要有蕓苔鏈格孢、雅致放射毛霉、稻黑孢菌和黒附球菌等,并初步明確這些病原的生物學(xué)特性。