房慶 唐柳 謝原利 張怡靜 石雪 黃文坤 彭煥 彭德良蘭阿峰 孔令安

（1. 陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，漢中 723000；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所 植物病蟲害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100193；3. 湖北省植物保護(hù)總站，武漢 430070）

鐮孢菌（Fusariumspp.）是一類重要的真菌，具有種類多、易變異、種內(nèi)生理分化明顯等特點(diǎn)，一直以來都被認(rèn)為是最難鑒定的真菌類群之一。鐮孢菌具有重要的經(jīng)濟(jì)意義，廣泛分布于自然界中，以兼性寄生或腐生方式生活。有些鐮孢菌可侵染多種植物引起病害，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的危害。據(jù)美國(guó)植物病理學(xué)會(huì)對(duì)101種重要經(jīng)濟(jì)作物病害的報(bào)道，至少有一種鐮孢菌病害的作物達(dá)到81種以上；對(duì)巴拿馬香蕉生產(chǎn)造成了毀滅性災(zāi)害的香蕉萎蔫病由尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）引起［1］；由尖孢鐮孢菌與大豆孢囊線蟲（Heterodera glycines）復(fù)合侵染引起的大豆枯萎病對(duì)大豆的危害也日漸嚴(yán)重［2］，可見鐮孢菌病害對(duì)植物危害的嚴(yán)重性。此外，有些鐮孢菌屬真菌可直接侵染人和動(dòng)物，引起疾病的嚴(yán)重發(fā)生，尤其是在動(dòng)物體免疫系統(tǒng)低下的情況下，如食道癌患者和艾滋病患者更易于遭受鐮孢菌的侵染；更為重要的是，禾谷鐮孢菌（F. graminearum）和黃色鐮孢菌（F. culmorum）等多種鐮孢菌屬真菌在生長(zhǎng)過程產(chǎn)生脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和雪腐鐮刀菌烯醇（Nivalenol，NIV）等毒素，引起人畜癌癥和生長(zhǎng)缺陷疾病，甚至危及人和動(dòng)物的生命安全［3］。

但有些鐮孢菌屬真菌對(duì)人類是非常有益的，如有的鐮孢菌菌株可作為生防菌，如非致病性尖孢鐮孢菌npfo和CS-20［4-5］菌株在防治番茄、西瓜等作物枯萎病中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用；有的鐮孢菌可分解自然界中的纖維素，降解有機(jī)物；有的鐮孢菌還能分泌可促進(jìn)動(dòng)植物生長(zhǎng)的促進(jìn)劑［6-7］?？梢姡犳呔鷮僬婢谵r(nóng)業(yè)生產(chǎn)、生防、環(huán)保、工業(yè)生產(chǎn)等領(lǐng)域的重要作用。

在我國(guó)，人們非常重視鐮孢菌種類鑒定及其引起的植物病害研究，同時(shí)也開展了篩選鑒定潛在的生防鐮孢菌的相關(guān)工作。人們對(duì)山西鐮孢菌進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，從罹病植株、不同類型土壤和自然保護(hù)區(qū)土壤中分離鑒定了鐮孢菌300余株，并進(jìn)行了系統(tǒng)分類［8］。本研究針對(duì)湖北省13個(gè)地級(jí)市蔬菜產(chǎn)區(qū)的蔬菜根際土壤樣品，進(jìn)行鐮孢菌的分離與鑒定，以明確湖北省蔬菜產(chǎn)區(qū)的鐮孢菌種類和分布規(guī)律，旨為蔬菜鐮孢菌病害的科學(xué)防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土樣采集 于2017夏季-2018年夏季從湖北省13個(gè)地級(jí)市蔬菜產(chǎn)區(qū)隨機(jī)采集根際土壤（涵蓋不同種植方式、不同蔬菜種類、不同種植年限），采用5點(diǎn)取樣法，采集時(shí)先用菜田土壤擦拭采樣工具，然后撥去地表枯葉，用抖落法從種植期作物根部附近2 mm內(nèi)取樣，每個(gè)取樣點(diǎn)的5份土樣混在一起，充分混勻，取約2.5 kg裝入采樣布袋，記錄采樣地點(diǎn)、時(shí)間、前后茬蔬菜種類（大棚蔬菜記錄棚齡）等信息［9］。

1.1.2 真菌分離 采用稀釋涂布法和單菌落挑取法進(jìn)行分離和純化［10］。（1）馬鈴薯-蔗糖培養(yǎng)基（PSA）平板的制備，配制氯霉素（抑制革蘭氏陽性菌）和鏈霉素（抑制革蘭氏陰性菌）母液，濃度分別為40 mg/mL和300 mg/mL；將兩種抗生素母液按1∶1的比例混勻備用；待PSA培養(yǎng)基溫度降至50℃時(shí)，按1∶1 000比例將混合抗生素加入PSA培養(yǎng)基內(nèi)，搖勻，制作PSA平板。（2）最佳稀釋倍數(shù)的摸索：稱取土壤樣品10 g，置入400 mL燒杯中，加入90 mL無菌水，充分?jǐn)嚢?，制備土壤懸浮液母液，然后制?00倍、400倍、1 000倍稀釋液，依次吸取200 μL梯度稀釋液，分別涂布于PSA平板，置于26℃恒溫培養(yǎng)箱，第4天開始調(diào)查記錄菌落數(shù)，確定最佳稀釋倍數(shù)；（3）土樣中真菌的分離：如前所述，制備土壤懸浮液母液，稀釋到最佳稀釋倍數(shù)，吸取200 μL土壤稀釋液涂布于PSA平板，置于26℃培養(yǎng)箱，待菌落長(zhǎng)出，及時(shí)挑菌于PSA平板，進(jìn)行真菌的分離、純化培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 真菌基因組DNA的微量提取 參考CTAB法［11］。收集20 mg新鮮菌絲至2 mL離心管中，加入650 μL 2% CTAB，充分研磨樣品，65℃水浴30 min；12 000-13 000 r/min離心10 min，吸取上清，加入等體積的氯仿-異戊醇（24∶1），混勻，12 000-13 000 r/min離心10 min；吸取350 μL上清，加入700 μL（兩倍體積）無水乙醇，12 000-13 000 r/min離心5 min；棄上清，沉淀用75%酒精洗滌2次，充分晾干；加入100 μL滅菌水，待沉淀溶解，放在-20℃保存或者4℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 鐮孢菌的分子鑒定

1.2.2.1 分子鑒定引物 本研究所用的通用引物和特異性引物序列見表1［9-12］。

表1 引物序列及相關(guān)信息

1.2.2.2 PCR 擴(kuò) 增 PCR 擴(kuò) 增 體 系（50 μL）：10×Buffer 5 μL、2.5 mol/L dNTP 4 μL、正向引物（10 μmol/L）和反向引物（10 μmol/L）各 1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板 2 μL，用滅菌水補(bǔ)足至 50 μL。試劑均購(gòu)自TaKaRa公司。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性30 s，56-62℃（退火溫度依據(jù)引物決定）退火30 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法：取8 μL產(chǎn)物，在1%瓊脂糖凝膠內(nèi)100 V電泳30 min，用紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.2.2.3 測(cè)序 使用TEF1αF/TEF1αR對(duì)目標(biāo)鐮孢菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增；使用DNA回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物回收純化（天根，DP209）；回收產(chǎn)物送中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI進(jìn)行BLAST分析。

1.2.3 與尖孢鐮孢菌的拮抗測(cè)試 將分離純化的菌株，接種至PSA平板，與病原菌尖孢鐮孢菌番茄?；停‵. oxysporumf. sp. lycopersici）菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)。第3 天開始觀察靶標(biāo)菌株對(duì)尖孢鐮孢菌番茄?；途甑霓卓剐Ч?/p>

2 結(jié)果

2.1 最佳稀釋倍數(shù)確定

將200倍、400倍和1 000倍的土樣懸浮液分別涂布PSA平板，第4天和第5天，涂布200倍稀釋液的PSA平板上的菌落過密無法計(jì)數(shù)，不適宜挑取單菌落；涂布400倍稀釋液的PSA平板上的單菌落約為30個(gè)，單菌落數(shù)量適中適宜挑取；而涂布1 000倍稀釋液的PSA平板上的單菌落約為20個(gè)，單菌落數(shù)量略少。由此確定最佳稀釋倍數(shù)為400倍（圖1、表2）。

圖1 第5 d時(shí)不同稀釋倍數(shù)土樣懸浮液涂布PSA平板的菌落

2.2 鐮孢菌分離、鑒定

按照400倍稀釋濃度，對(duì)55份土樣進(jìn)行分離真菌，共獲得1 388株菌株（表3），使用鐮孢菌通用引物F 1和F 2進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)其中271株菌株能夠檢測(cè)到1 000 bp左右的特異性目標(biāo)條帶（圖2），表明鑒定到鐮孢菌271株，占分離菌株總數(shù)19.5%。

2.3 測(cè)序鑒定鐮孢菌的種類

對(duì)271株候選鐮孢菌，通過鐮孢菌測(cè)序通用引物TEF1αF/TEF1αR進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序鑒定。分析測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中118株為尖孢鐮孢菌、46株為木賊鐮孢菌（F. equiseti）、45株為共享鐮孢菌（F. commune）、31株為茄病鐮孢菌（F.solani）、11株為藤倉(cāng)鐮孢菌（F. fujikuroi）、6株為鐮孢霉菌（F. delphinoides）、5株為輪紋鐮孢菌（F.concentricum）、3株為三線鐮孢菌（F.tricinctum）、6株為鐮孢菌屬（Fusariumspp.）（表4）。

表3 湖北省13個(gè)地區(qū)土樣采集的蔬菜種類及真菌分離數(shù)量

為進(jìn)一步驗(yàn)證TEF1αF/TEF1αR測(cè)序結(jié)果的可靠性，用鐮孢菌種特異性引物進(jìn)行驗(yàn)證。隨機(jī)挑選測(cè)序鑒定為尖孢鐮孢菌25株、茄病鐮孢菌14株進(jìn)行驗(yàn)證，使用尖孢鐮孢菌種特異性引物FO 1和FO 2，茄病鐮孢菌種特異性引物FS 1和FS 2分別進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增，分別檢測(cè)到約700 bp和300 bp的特異性目標(biāo)條帶（圖3），與通用引物TEF1αF/TEF1αR測(cè)序鑒定結(jié)果一致，一致率100%。

圖2 鐮孢菌通用引物特異性篩選

圖3 尖孢鐮孢菌和茄病鐮孢菌特異性PCR擴(kuò)增

2.4 鐮孢菌的分離頻率

通過對(duì)271株鐮孢菌測(cè)序結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，得出各類鐮孢菌的分離頻率，其中尖孢鐮孢菌占分離菌株43.6%；木賊鐮孢菌占17.0%；共享鐮孢菌占16.6%；茄病鐮孢菌占11.4%；藤倉(cāng)鐮孢菌占4.1%；鐮孢霉菌占2.2%；輪紋鐮孢菌占1.8%；三線鐮孢菌占1.1%；鐮孢菌屬占2.2%；其中尖孢鐮孢菌分離頻率最高，為43.6%（表4），接近分離鐮孢菌菌株總數(shù)的一半；結(jié)果表明尖孢鐮孢菌是湖北省蔬菜產(chǎn)區(qū)的優(yōu)勢(shì)鐮孢菌。

2.5 拮抗鐮孢菌的篩選

將分離純化的鐮孢菌菌株與尖孢鐮孢菌番茄?；途赀M(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與尖孢鐮孢菌番茄?；途贽卓沟溺犳呔灿?6株，其中尖孢鐮孢菌和茄病鐮孢菌均為4株；輪紋鐮孢菌和三線鐮孢菌均為3株；木賊孢菌和藤倉(cāng)鐮孢菌均為1株（圖 4）。

表4 湖北省13個(gè)地級(jí)市土樣中分離鐮孢菌的種類和數(shù)量

圖4 與尖孢鐮孢菌番茄?；途贽卓沟溺犳呔?/p>

2.6 作物種類與鐮孢菌種群

通過分析11種蔬菜的根際土壤與271株鐮孢菌的鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)不同種類蔬菜的根際土壤中檢測(cè)到鐮孢菌種群數(shù)量差異明顯（表5），其中番茄根際土壤中檢測(cè)到9種鐮孢菌；黃瓜根際土壤中檢測(cè)到7種鐮孢菌；辣椒根際土壤中檢測(cè)到5種鐮孢菌；菜臺(tái)、蘿卜、絲瓜根際土壤中均檢測(cè)到4種鐮孢菌；青菜根際土壤中檢測(cè)到3種鐮孢菌；豆角根際土壤中檢測(cè)到2種鐮孢菌；白菜、茄子和小白菜根際土壤中均只檢測(cè)到1種鐮孢菌。

表5 作物種類與分離菌株的種類和數(shù)量

3 討論

首次比較系統(tǒng)研究了湖北省蔬菜產(chǎn)區(qū)鐮孢菌的種類及分布特征，發(fā)現(xiàn)鐮孢菌至少分為9個(gè)種，其中尖孢鐮孢菌是湖北省蔬菜產(chǎn)區(qū)鐮孢菌中的優(yōu)勢(shì)種，表明湖北省境內(nèi)鐮孢菌種群豐富。俞大紱［13］、李明遠(yuǎn)［14］、張汝洋［15］、藍(lán)江林［16］和費(fèi)諾亞等［17］分別從不同作物中鑒定出的病原菌多為鐮孢菌，表明鐮孢菌已經(jīng)成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的重要病原菌之一；吳安忠等［18］研究發(fā)現(xiàn)共享鐮孢菌是引起福建省三明市主要煙區(qū)煙草根腐病的主要病原菌；曾莉莎等［19］研究發(fā)現(xiàn)我國(guó)香蕉上存在豐富的鐮孢菌種類，已分離的枯萎病病原菌廣泛分布在3個(gè)尖孢鐮孢菌譜系中；荸薺枯萎病和荷花腐敗病病原菌為共享鐮孢菌［20］；北京南口甘藍(lán)枯萎病的病原菌為尖孢鐮孢黏團(tuán)?；停‵. oxysporumf. sp. conglutinans）［14］；黑龍江和安徽大豆根腐病的優(yōu)勢(shì)種為茄病鐮孢菌［14，21］；我國(guó)遭受毀滅性病害的各個(gè)西瓜產(chǎn)區(qū)，其病原菌以尖孢鐮孢西瓜?；停‵. oxysporumf. sp. niveum）為優(yōu)勢(shì)種［16］。眾多研究結(jié)果表明鐮孢菌的危害范圍日趨增大，危害程度愈發(fā)嚴(yán)重。

從湖北省13個(gè)地級(jí)市蔬菜根際土壤中分離的鐮孢菌中的優(yōu)勢(shì)種為尖孢鐮孢菌，但不同市區(qū)的優(yōu)勢(shì)菌種存在差異。武漢市、襄陽市的優(yōu)勢(shì)菌種為尖孢鐮孢菌；隨州市優(yōu)勢(shì)菌種為共享鐮孢菌；荊門市優(yōu)勢(shì)菌種為木賊鐮孢菌。造成這些差異的原因可能是：不同地區(qū)的溫度、濕度等氣候差異影響鐮孢菌種類的生長(zhǎng)［22］；不同分離培養(yǎng)基（通用培養(yǎng)基或選擇性培養(yǎng)基）、分離方法等其他因素［23］。同時(shí)，各地區(qū)鐮孢菌種群組成不同，說明鐮孢菌的分布也具有一定的地域性。

本次研究發(fā)現(xiàn)不同種類蔬菜的根際土壤中分離出的鐮孢菌種類及豐富度存在差異，同時(shí)，相同地區(qū)不同田塊鐮孢菌的種群也有差異。造成這些差異的原因可能是（1）土樣品質(zhì)不同［24］，研究發(fā)現(xiàn)從相鄰田塊采集的沙土和水田里的土樣中分離到的鐮孢菌種類存在差異；（2）作物品種不同，各地區(qū)推廣種植的作物品種不同，對(duì)鐮孢菌的選擇壓力不同，導(dǎo)致鐮孢菌的變異速度不同［25-26］；（3）田間的耕作制度不同［25］等。

本研究明確了湖北省13個(gè)地級(jí)市蔬菜地區(qū)鐮孢菌的種群類別和分別特征，篩選出部分與致病菌尖孢鐮刀菌專化型的拮抗菌株，研究結(jié)果為蔬菜鐮孢菌病害的防治提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

從湖北省13 個(gè)地級(jí)市蔬菜產(chǎn)區(qū)采集根際土壤樣品55 份中分離獲得271 株鐮孢菌（Fusariumspp.）菌株；通過鐮孢菌特異性引物擴(kuò)增、測(cè)序等分子生物學(xué)技術(shù)，鑒定出118株尖孢鐮孢菌（F.oxysporum），46 株木賊孢菌（F. equiseti），45 株共享鐮孢菌（F. commune），31株茄病鐮孢菌（F.solani），11 株 藤 倉(cāng) 鐮 孢 菌（F. fujikuroi） ，6 株 鐮孢霉菌（F. delphinoides），5 株輪紋鐮孢菌（F.concentricum），3 株三線鐮孢菌（F. tricinctum）和6株鐮孢菌屬（Fusariumspp.）菌株，明確了湖北蔬菜產(chǎn)區(qū)鐮孢菌（Fusariumspp.）的優(yōu)勢(shì)種為尖孢鐮孢菌（F. oxysporum）；通過與致病菌尖孢鐮孢菌番茄?；停‵. oxysporumf. sp.lycopersici）菌株進(jìn)行對(duì)峙培養(yǎng)，篩選出拮抗鐮孢菌16 株。

致謝：本研究所用尖孢鐮孢菌番茄?；途暧芍袊?guó)農(nóng)科院蔬菜花卉研究所茆振川老師提供，特此表示感謝。