葉爾那扎爾·努爾吐熱 邱麗芬 張富春 張茂祥

（1. 廣州中醫(yī)藥大學華南針灸研究中心，廣州 510000；2. 新疆大學生命科學與技術學院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，烏魯木齊 830046）

自1972年雜交瘤技術問世以來，治療性單克隆抗體的開發(fā)成為醫(yī)學和科學研究的熱點［1］。DNA免疫技術從1990年開始，主要應用于針對流感病毒感染引起的傳染性疾病的疫苗研發(fā)［2-5］。DNA免疫技術與傳統的蛋白免疫最大區(qū)別在于目的抗原的表達方式，即蛋白質免疫首先在體外合成和純化抗原，然后將蛋白質轉入動物體內產生免疫應答反應，而DNA免疫將帶有目的基因序列的質粒DNA轉入動物體內，因此外源基因序列在宿主細胞內得以表達并誘導機體免疫應答［6］。靶向抗原的表達方式對于誘導產生高滴度、高親和力的抗體至關重要，多項研究表明DNA免疫誘發(fā)產生的單克隆抗體的專一性和穩(wěn)定性明顯高于傳統的蛋白質免疫。

DNA免疫在宿主細胞內表達目的基因并誘導機體免疫應答至少有3種機制，包括直接轉染體細胞、直接轉染專職抗原遞呈細胞（Antigen presenting cells，APCs）和類似凋亡機制（圖1）。直接轉染體細胞：將外源DNA分子直接轉入到動物體內，肌肉細胞被激活產生MHC I類分子，從而誘導機體免疫應答，然而研究表明直接轉染體細胞誘導產生的免疫應答反應中并非肌細胞起主導作用，交叉激活專制抗原遞呈細胞（Antigen presenting cells，APCs）才是誘導機體免疫應答的關鍵。直接轉染專職APCs是指少量的專職 APCs可在注射部位直接被轉染，產生內源性蛋白，經MHC I和MHC II分子完成內源性抗原的遞呈，其中樹突狀細胞（Dendritic cells，DC）在肌肉注射質粒DNA所引起的免疫應答中發(fā)揮重要作用，一方面未成熟的樹突狀細胞（Immatured dendritic cells，iDC）識別外源DNA分子被激活，從而能夠將MHC I 類復合體直接遞送到細胞表面，同時表達免疫細胞協同刺激分子CD80/86，成熟的樹突狀細胞（Matured dendritic cells，mDC）能夠激活CD8+T 細胞免疫應答反應；另一方面將外源質粒DNA激活樹突狀細胞促使它捕獲細胞間隙的多肽片段復合物，進而經內化后形成 MHC II類復合體遞送到細胞表面，從而激活CD4+T細胞，同時在不同細胞因子的協同作用下誘導機體體液免疫或細胞免疫反應。類似凋亡機制是指目的抗原或者表達目的抗原的重組質粒序列本身具有轉導特性，但是目前這些蛋白的轉導作用機制尚不清楚［7-9］。

DNA 免疫技術在制備抗體中的應用，尤其是對高效治療性單克隆抗體的開發(fā)具有重要意義，與傳統蛋白質或多肽免疫方式相比較，DNA 免疫具有諸多優(yōu)勢。本文根據前人的研究成果，對DNA 免疫表達載體的構建、提高DNA免疫效率的優(yōu)化方案、質粒DNA的傳遞方式及其優(yōu)點和發(fā)展前景進行論述。

1 DNA免疫的構建

1.1 抗原的設計

DNA 免疫抗原的設計需要根據抗原本身的特性而靈活使用，因此根據抗原的特性和自身實際需要，在設計引物和表達載體時對蛋白質原始序列和特征進行改造和優(yōu)化，獲得符合實際需要的重組質粒DNA，但在設計抗原時要保持抗原的免疫原性和原有的生物學功能，以便最終得到能夠識別天然抗原表位的高特異性的單克隆抗體（表1）。

圖1 DNA免疫在體內誘導產生免疫應答的3種機制

一般來說，將編碼蛋白的全長基因序列插入到表達載體上，獲得高特異性單克隆抗體通常適用于大多數蛋白，尤其是可分泌蛋白或細胞表面膜蛋白［10-19］，包括人促甲狀腺激素受體（Human thyrotropin receptor，hTSHR）、柯薩奇病毒和腺病毒受體（Coxsackievirus and adenovirus receptor，CAR）、前列腺特異性抗原（Prostate specific antigen，PSA）等。如果靶向抗原是單次跨膜蛋白，我們可以選擇性地將編碼細胞外或者細胞內蛋白區(qū)域的質粒片段插入到表達載體上，可以誘導產生針對跨膜蛋白細胞外或者細胞內區(qū)域的單克隆抗體［23-27］。對于細菌毒素的靶點，改造更具有其優(yōu)越性。例如，研究者將艱難梭狀芽胞桿菌毒素A，幽門螺桿菌空泡細胞毒素等細菌毒素作為靶向抗原，選擇性地去除具有毒性的功能區(qū)域而不改變蛋白質的免疫原性，經過如此修飾而得到的單克隆抗體，不僅對機體沒有毒害作用，而且能夠有效地預防和診斷由細菌感染引起的毒素侵害［28-29］。Puttikhunt等［30］報道使用膜蛋白錨定序列將登革熱病毒NS1的跨膜區(qū)域轉換成膜蛋白。

表1 免疫原設計

1.2 表達載體中啟動子的選擇和功能優(yōu)化

DNA 免疫載體設計中高效啟動子對于提高目的抗原在宿主細胞內的表達起到很重要的作用［6］。Hazen等［33］利用編碼多重穿膜轉運蛋白（Multidrug resistance associated protein 4，MRP4）的 cDNA 免疫動物，通過檢測熒光素酶的活性對于DNA載體中巨細胞病毒（Cytomegalovirus，CMV）啟動子和人工合成的高效啟動子CAG對誘發(fā)免疫應答和產生抗體的激活能力進行了比較，結果表明帶CAG啟動子的質粒能夠誘導長期穩(wěn)定的MRP4蛋白的表達而且增強了抗MRP4的特異性免疫應答反應。Bates 等［20］通過熒光素酶報告基因比較了CMV 啟動子和人類泛素C啟動子對靶向抗原在宿主細胞內表達水平的效率，結果表明帶兩種啟動子的表達載體都能誘導產生高特異性的單克隆抗體，在單次DNA 免疫情況下，泛素啟動子C的抗原的半衰期和滴度都比CMV啟動子誘導產生的抗體明顯，而在多次DNA 免疫的情況下，二者均能誘導生成高滴度的抗體。載體中其它相關調控序列也對增強啟動子的功能有影響，Wang等［34］報道密碼子的優(yōu)化，病毒啟動子功能的增強和前導序列的選擇等策略都在一定程度上提高抗原在宿主細胞內的表達效率及增強抗原的免疫原性。

2 使用不同佐劑對DNA免疫效果的影響

2.1 使用基因佐劑-CpG寡聚核苷酸對DNA免疫效

果的影響

CpG寡居核苷酸是從一種桿菌中提取的DNA片段，具有抗腫瘤、增強機體非特異性免疫應答等生物活性，人工合成的CpG寡居核苷酸具有與桿菌DNA類似的免疫刺激效應，能夠促進B細胞前體的發(fā)育與成熟，從而增強DNA免疫在體內產生抗體的效率［35］。Gomis 等［36］對 CpG 寡聚核苷酸免疫保護作用進行了探討，他們用人工合成CpG寡聚核苷酸免疫被大腸桿菌感染的雞，病理學和微生物學檢測結果表明，與對照組相比，接受含CpG寡聚核苷酸的雞，不管是皮下免疫還是肌肉免疫都顯著提高了存活率。因此，CpG寡聚核苷酸對細胞外細菌感染的動物起到有效的免疫保護作用。Qiu 等［37］報道在乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）DNA 疫苗試驗中，包含CpG寡聚核苷酸序列的陽離子脂質體作為DNA 免疫的佐劑顯著提高了DNA 疫苗的免疫原性且誘導免疫類型的轉變，從而有效地將乙型肝炎病毒DNA 疫苗導入皮膚，在機體內誘導有效的預防性免疫應答。

2.2 使用傳統佐劑對DNA 免疫效果的影響

粒細胞巨噬細胞集落刺激生長因子（Granulocyte macrophage colony stimulating growth factor，GM-CSF）作為DNA免疫的分子佐劑，有助于提高DNA免疫在體內誘發(fā)產生抗體的效率。例如，Hazen 等［33］報道聯合使用兩種分子佐劑，即編碼胎兒酪氨酸激酶3配體（Fetal tyrosine kinase 3 ligand，FLT3L）和粒細胞巨噬細胞集落刺激生長因子（GM-CSF）的質粒DNA，顯著提高了機體免疫反應，從而成功地誘導出識別靶向抗原12個跨膜蛋白（MRP4）的細胞外抗原表位的高特異性單克隆抗體。

分子伴侶是DNA 免疫的一類很重要的分子佐劑，在誘導產生針對G蛋白偶聯受體（G proteincoupled receptor，GPCR）等具有復雜結構的特異性單克隆抗體中起到了較高的佐劑效應。Fujimoto等［38］報道了將大腸桿菌熱休克蛋白作為DNA 免疫的分子佐劑，構建了編碼內皮素受體A（Endothelin A receptor，ETAR）的重組質粒ETAR-GroEL，免疫動物后產生了針對天然靶向抗原的特異性抗原，而不含分子佐劑的編碼靶向抗原的質粒免疫之后未產生特異性抗原。Takatsuka等［39］也將分子伴侶作為DNA 免疫的分子佐劑誘導產生了有效識別趨化因子（ChemoCentryx chemokine receptor，CCX-CKR）細胞表面的單克隆抗體。

細胞因子是機體細胞產生的一類具有廣泛生物學活性的異質性肽類調節(jié)因子，使免疫活性細胞在體內被激活，從而參與機體特異性免疫應答的產生和調節(jié)過程。近年來有大量文獻報道細胞因子能作為DNA 免疫的佐劑，通過誘導機體特異性免疫應答而增強DNA 免疫的效果，然而各種各樣的細胞因子以不同的免疫調節(jié)方式在DNA免疫中發(fā)揮各自不同的免疫調節(jié)活性［40］。例如，Chow等［41］發(fā)現在乙型肝炎病毒DNA 疫苗中，白介素-2（IL- 2）和丙型干擾素（INF-γ）顯著增強了輔助性T細胞1（Th1）的活性以及提高了抗-HBV的IgG2a抗體的產生，而且顯著增強了由HBV疫苗誘導的細胞毒性T細胞（Cytotoxic T lymphocytes，CTL）反應，同時顯著抑制了輔助性T細胞2（Th2）的活性以及減弱了IgG1抗體的產生。然而，白介素-4（IL- 4）表現出與之相反的調節(jié)活性。Cui 等［42］研究發(fā)現將編碼IL- 12、IL- 15、IL- 18 或 IL- 21的質粒DNA 與編碼生殖器單純皰疹病毒（Herpes simplex virus，HSV）糖蛋白B的質粒DNA 共免疫生殖器單純皰疹病毒感染小鼠時都顯著提高了小鼠的存活率，結果表明了這些細胞因子通過同時誘導機體的體液和細胞免疫應答，能夠在DNA免疫中起到有效的調節(jié)作用。

2.3 使用免疫調節(jié)佐劑對DNA免疫效果的影響

異源性DNA初免-蛋白質加強免疫（Heterologous DNA prime-protein boost）的免疫策略顯著提高了DNA免疫的效率，主要程序是：首先用攜帶目的基因序列的重組DNA質粒免疫動物，隨后再隔一段時間注射一定量的抗原蛋白作為加強免疫［43-44］。Wang 等［45］報道利用異源型DNA 初免-蛋白質加強的免疫策略誘發(fā)人免疫應答反應，從而獲得抗人類免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）包膜抗原的高特異性抗體。已有不少研究證實異源性DNA初免-蛋白質加強免疫策略比多次注射同一類型的免疫原更有效，能夠誘導產生穩(wěn)定的保護性單克隆抗體［46-50］。Vaine 等［51］采用了 DNA 單獨免疫、蛋白質單獨免疫和異源型DNA 初免-蛋白質加強等不同免疫策略，驗證了其中DNA 初免-蛋白質加強的免疫策略誘導產生的單抗可以有效阻止HIV-1 包膜糖蛋白與 CD4 受體的結合（表2）。

表2 免疫加強的選擇

3 DNA免疫的遞送方式

DNA 免疫的遞送方式是體內誘導產生高效、穩(wěn)定的單克隆抗體的關鍵一步，目前已有多種遞送方式，其中最具代表性的有傳統針管方式注射DNA 質粒所屬的化學傳遞方式以及基因槍方法、電穿孔的方法、水動力尾靜脈注射法等方法所屬的物理傳遞方式（表3）。

表3 DNA免疫的傳遞方式

3.1 傳統的針管注射法

傳統的針管注射法，一般根據抗原特異性和實際需要選擇不同的注射部位，包括肌肉注射、皮下注射、靜脈注射等。研究表明用傳統的針管注射法免疫動物，雖然操作簡便且經濟，但注射少量的質粒DNA在動物體內很難得到高效價的抗體，所以此方法經常以附加佐劑或者DNA初免-蛋白質加強免疫等方法來提高DNA 免疫的效率。DNA 免疫傳遞方式在動物體內誘導產生靶點特異性單克隆抗體都有成功的報道，而且該技術在不斷地改進和完善［9］。

3.2 基因槍技術

基因槍技術是指用化學性質較穩(wěn)定的金或鎢作為金顆粒，將帶有目的基因序列的質粒DNA吸附在金顆粒上，然后通過沖擊力將質粒DNA導入到靶向細胞內開始表達。與傳統的針管注射相比較，基因槍技術是一種DNA免疫的高效傳遞方式，有效提高了外源基因在宿主細胞內的表達效率，然而基因槍技術具有操作難度較大且成本高等局限性，降低了其實際應用價值［31-32，52-54］。

3.3 電脈沖技術

電脈沖技術是首先用傳統的針管注射法在動物肌肉或者皮下注射質粒DNA，隨后在對應的注射處用電脈沖刺激，使細胞膜通透性瞬時增大，從而促進外源大分子導入到靶向細胞內得以高效表達。電脈沖技術具有效果顯著、應用方便經濟等優(yōu)點，是最理想的DNA免疫的傳遞方式［21-22］。

3.4 水動力尾靜脈注射法

另外一種特殊傳遞方式是通過水動力尾靜脈注射（Hydrodynamic tail vein injection，HTV）。已有文獻報道，利用這一傳遞DNA 免疫的方法成功誘導產生了針對細胞毒等跨膜蛋白的單克隆抗體［20，33］。由于需要特殊經驗和設置，這種方法還沒有得到廣泛的應用。

對以上不同的DNA免疫的傳遞方式進行了比較，即與傳統的裸DNA質粒注射比較，電脈沖和基因槍技術通過物理刺激的輔助作用有效的提高了外源DNA分子在宿主細胞內的表達水平［55］。例如，Alexandrenne等［56］將朊病毒蛋白（Prion protein，PrP）作為靶向抗原，通過不同DNA 免疫策略，對外源基因在宿主細胞內的表達效率進行了比較，結果表明經過DNA 免疫之后電脈沖刺激的傳遞方式比傳統的裸DNA 質粒直接注射更有效，由此方法產生的單克隆抗體能有效識別朊病毒蛋白天然的抗原表位。Wang 等［57］將編碼血細胞凝集素（Hemagglutinin，HA）的質粒DNA 通過肌肉注射免疫動物，同時用基因槍和電脈沖刺激的不同傳遞方式免疫動物，結果表明，與單獨肌肉注射相比較，基因槍和電脈沖刺激更有效，誘導產生了高特異性的抗血細胞凝集素的單克隆抗體。

4 利用 DNA 免疫技術誘導生產高效單克隆抗體的優(yōu)點

利用DNA免疫誘導產生高特異性的單克隆抗體的優(yōu)勢主要表現在以下幾個方面：首先，DNA免疫同時刺激體液免疫和細胞免疫，加快抗原特異性B淋巴細胞的成熟，從而可以誘導產生有效識別靶點抗原表位的高特異性抗體。其次，DNA免疫無需在體外合成和純化抗原，而是將目的基因直接導入到宿主細胞內得以表達，因此可以避免蛋白質天然構象和免疫原性因外界因素的干擾而受到影響。換言之，在宿主細胞內表達目的蛋白可以維持蛋白質空間構象更接近于其天然構象，而且還保證了原始多肽在真核細胞內的轉錄和修飾，如此就能提高針對靶向抗原的抗體的專一性和穩(wěn)定性。再次，DNA免疫技術具有潛在的創(chuàng)新性和可選性，科研工作者在應用過程中按照自己的實際需要可以設計多種不同的免疫策略，也可以選擇符合靶點抗原特異性的候選方案。最后，DNA免疫策略比傳統的免疫方法更安全、操作簡便、經濟且可靠，為制備高質量單克隆抗體提供良好的技術平臺［6-9］。

5 結語

作為一種新型簡便的免疫技術，DNA 免疫的概念從剛被發(fā)現就受到了極大的重視，尤其是針對傳染性疾病的DNA 疫苗的開發(fā)和應用［2-5］。在針對艾滋病病毒和流感病毒疫苗的開發(fā)和研究工作中，DNA免疫技術已成為了決定其成功與否的關鍵一步［58-60］。隨著種類繁多的保護性或者治療性單克隆抗體的應用和開發(fā)，DNA免疫技術在高特異性單克隆抗體研發(fā)中的地位也在不斷上升，尤其是針對G蛋白偶聯受體（GPCR）、跨膜蛋白的特異性單克隆抗體的開發(fā)中占絕對優(yōu)勢［33，51］。

總之，DNA免疫技術在高特異性單克隆抗體的開發(fā)中具有誘人的發(fā)展前景。首先，DNA免疫不需要在實驗室合成和純化抗原，而是在宿主細胞內表達插入基因序列，這樣可以最大程度地維持蛋白質天然構象和免疫原性，這對于后續(xù)產生有效識別原始抗原表位的高親和性抗體至關重要。最后，雖然單一DNA免疫在機體內很難生成高滴度的抗體，但隨著DNA免疫技術的不斷完善，已有了不少提高DNA免疫效率的免疫策略，顯著提升了DNA免疫的免疫原性和實用性。由此可見，DNA免疫將在高質量的治療性或診斷性單克隆抗體的研發(fā)中具有更廣闊的應用前景［61-63］。