王巧梅　王子杰　操義恒　王曉蘭　周霞　吳潔　孫志華　王震　張輝

摘要：目的 為了解生鮮乳中大腸桿菌生物特性及流行特點(diǎn)，本研究采集新疆北疆3個(gè)地區(qū)6個(gè)規(guī)?；?chǎng)生鮮乳。方法 采用分離純化、16S rRNA基因測(cè)序和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)等方法對(duì)大腸桿菌進(jìn)行分離鑒定；通過(guò)PCR 方法對(duì)分離株進(jìn)行多位點(diǎn)序列分型（MLST）和8種耐藥基因分析，利用微量肉湯稀釋法和結(jié)晶紫染色法檢測(cè)分離株對(duì)13種抗生素的耐藥性和生物被膜形成能力，小鼠感染試驗(yàn)分析其致病性。結(jié)果 共分離鑒定了7株大腸桿菌，分離率38.9%，且具有不同程度致病性；7株大腸桿菌分3個(gè)ST型，分別為ST183（57.1%）、ST58（28.6%）、ST49（14.3%）；分離株對(duì)頭孢曲松鈉、頭孢吡肟耐藥率為85.7%，對(duì)阿米卡星、慶大霉素、氧氟沙星耐藥率分別為71.4%、42.9%、14.3%；100%分離株攜帶β-內(nèi)酰胺類blaTEM，71.4% 菌株攜帶喹諾酮類aac（6′）-Ib基因，42.8%的菌株攜帶gyrA，71.4%的菌株攜帶四環(huán)素類Tet（B）基因；KT株具有強(qiáng)生物被膜形成形成能力，SHZ1-1、SHZ2、SHZ3、SHZ4、YL為中等生物被膜形成菌株，SHZ1-2為弱成膜菌株。結(jié)論 表明分離于生鮮乳大腸桿菌具有多重耐藥特點(diǎn)，并攜帶多種耐藥基因，能形成較強(qiáng)生物被膜，該結(jié)果為評(píng)估新疆部分地區(qū)生鮮乳中大腸桿菌特點(diǎn)和臨床用藥提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：生鮮乳；大腸桿菌；MLST分型；耐藥性；生物被膜

中圖分類號(hào)：S852.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

Study on multilocus sequence typing analysis and drug resistance of row milk

E. coli in partial scale cattle farm in North Xinjiang

WANG Qiaomei1，WANG? Zijie1，CAO? Yiheng1，WANG? Xiaolan1，ZHOU? Xia1*，WU? Jie2，

SUN? Zhihua1，WANG? Zhen1，ZHANG? Hui1

（1 College of Animal Science and Technology， Shihezi University，Shihezi，Xinjiang 832003，China; 2 Animal Husbandry and Veterinary

Workstation of the Eighth Division of Xinjiang Production and Construction Corps，Shihezi，Xinjiang 832003， China）

Abstract：? Objective In order to understand the characteristics and prevalence of E. coli in raw milk， E. coli in raw milk from 6 large scale cattle farms in 3 regions of northern Xinjiang were identified by conventional separation and purification combined with 16S rRNA sequence analysis. Methods The PCR method was used to analyzed MLST type and the resistance genes of isolates. The resistance phenotypes to 13 antibiotics of isolates were detected by microbroth dilution method. The micro broth dilution method and crystal violet staining method were used to detect the resistance and biofilm formation ability of isolated strains to 13 antibiotics， and the pathogenicity was analyzed through mouse infection test. Conclusion 7 strains of E. coli were isolated， with an isolation rate of 38.9% and with different degrees of pathogenicity. There were 3 ST types in 7 E. coli， namely ST183 （57.1%）， ST58 （28.6%） and ST49 （14.3%）. The resistance rates of isolates to ceftriaxone sodium and cefepime were 85.7% and to amikacin， gentamicin， gentamicin and ofloxacin were 71.4%， 42.9% and 14.3%. 100% of the isolates carried β -lactam blaTEM gene， 71.4% carried quinolone aac（6′）-Ib gene， 42.8% carried gyrA， and 71.4% carried tetracycline Tet（B） gene. KT strain had strong biofilm formation ability. SHZ1-1， SHZ2， SHZ3， SHZ4， YL were medium biofilm forming strains and SHZ1-2 was weak film－forming strain. Results Indicated that E. coli isolated from row milk had multidrug resistance and carried multiple drug resistance genes， which could form strong biofilm. The results provide a theoretical basis for evaluating the characteristics and clinical medication use of E. coli in raw milk in some areas of Xinjiang.

Key words： raw milk;E. coli;MLST typing;drug resistance;biofilm

大腸桿菌是重要的食源性致病菌，也是危害養(yǎng)殖業(yè)重要的細(xì)菌之一，在獸醫(yī)臨床可引起犢牛腹瀉、奶牛子宮內(nèi)膜炎、食物中毒等疾?。?］。研究表明大腸桿菌廣泛存在于環(huán)境中，是引起奶牛乳房炎的第二大病原菌，可通過(guò)奶牛本身、加工過(guò)程、運(yùn)輸過(guò)程等途徑引起乳品質(zhì)量下降［2］。

規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)生鮮乳大腸桿菌的存在也是評(píng)價(jià)其質(zhì)量的重要標(biāo)準(zhǔn)之一［3-5］。奶牛乳房炎主要采用抗生素治療，抗生素的廣泛長(zhǎng)期使用，導(dǎo)致大腸桿菌具有耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣以及復(fù)雜的耐藥機(jī)制的特點(diǎn)［6-7］，同時(shí)部分細(xì)菌形成的生物被膜也會(huì)影響細(xì)菌感染能力和耐藥特性［8-9］。不同地區(qū)大腸桿菌基因組受環(huán)境選擇壓力和隨機(jī)突變的共同作用具有一定差異性，多位點(diǎn)序列分型MLST可通過(guò)序列變化反映菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，適用于多地域微生物的流行病學(xué)研究［10-11］。

為了解新疆規(guī)?；?chǎng)生鮮乳中大腸桿菌的遺傳進(jìn)化特性及耐藥性等生物學(xué)特性，本文以新疆北疆3個(gè)地區(qū)6個(gè)規(guī)?；?chǎng)生鮮乳為研究對(duì)象，利用傳統(tǒng)方法分結(jié)合16S rRNA基因序列分析鑒定大腸桿菌，分析MLST分型、耐藥表型與耐藥基因等方面特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 采集樣品

生鮮乳樣品采樣于2022年9月北疆伊犁（1個(gè)）、石河子（4個(gè)）、奎屯（1個(gè)）共6個(gè)規(guī)?；膛?chǎng)全自動(dòng)擠奶廳大缸奶樣，每牛場(chǎng)采集3個(gè)平行樣品（5mL·個(gè)-1）。

1.2 主要試劑

BHI培養(yǎng)基、LB肉湯購(gòu)自青島海博生物有限公司；2×Es Taq PCR MasterMix購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker購(gòu)自天根生化科技公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；抗生素購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

昆明系小鼠，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定

無(wú)菌采集奶樣用PBS溶液稀釋放入37 ℃恒溫箱培養(yǎng)12～16 h后涂布在BHI培養(yǎng)基上培養(yǎng)12～18 h，挑疑似菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢，提取疑似細(xì)菌DNA，采用PCR擴(kuò)增16S rRNA基因通用引物進(jìn)行菌種鑒定，上游引物為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物5′-GGTTACCTTACGACTT-3′，目的基因片段大小1 500 bp［12］。PCR反應(yīng)體系20 μL：2×Es Taq PCR MasterMix 10 μL，DNA模板2 μL，上、下游引物（10 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O 6 μL，退火溫度56 ℃。將PCR產(chǎn)物送往公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性分析。

1.4.2 分離株多位點(diǎn)序列分型（MLST）

根據(jù)PubMLST網(wǎng)站（https：//pubmlst.org/）將大腸桿菌7對(duì)管家基因合成引物［13］（表1），PCR反應(yīng)體系同1.4.1，退火溫度見(jiàn)表1。PCR產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果提交至PubMLST網(wǎng)站（https：//pubmlst.org/）比對(duì)序列得到7個(gè)管家基因等位基因序列號(hào)可得到分離株相應(yīng)的ST型。

1.4.3 分離株耐藥表型檢測(cè)

按CLSI微量肉湯稀釋法標(biāo)準(zhǔn)［14］，檢測(cè)分離株對(duì) 13種抗菌藥的敏感性，選取常見(jiàn)臨床藥物。頭孢類：頭孢西丁（FOX）、頭孢噻肟（CTX）、頭孢曲松鈉（CRO）、頭孢吡肟（FEP）；β-內(nèi)酰胺類：阿莫西林（AMX）；酰氨醇類：氟苯尼考（FFC）；喹諾酮類：氧氟沙星（OFLX）、環(huán)丙沙星（CIP）、恩諾沙星（ENR）；氨基糖苷類：阿米卡星（AMK）、卡那霉素（KAN）、慶大霉素（GEN）；大環(huán)內(nèi)酯類：阿奇霉素（AZM）。每種抗菌藥物用MH肉湯按照倍比稀釋法進(jìn)行11個(gè)梯度稀釋，藥物濃度由高到低分別為128，64，32，16，8，4，2，1，0.5，0.25，0.125 μg·mL-1加入孔中，第12孔作為陽(yáng)性對(duì)照。取100 μL制備的菌液加入至96孔板中，放置37℃培養(yǎng)箱16～20 h后觀察結(jié)果。計(jì)算每種抗菌藥的最低抑菌濃度（包括中介菌株），耐藥R、中介I、敏感S判定范圍標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表2。

1.4.4 分離株耐藥基因檢測(cè)

以分離株DNA為模板，采取PCR擴(kuò)增方法，選取大腸桿菌常見(jiàn)8種耐藥基因［15］包括：β內(nèi)酰胺類blaTEM（719 bp）、blaSHV（502 bp）、喹諾酮類aac（6′）-Ib（482 bp）、gyrA（810 bp）磺胺類sul2（793 bp）、sul3（443 bp）、四環(huán)素類Tet（A）（210 bp）、Tet（B）（659 bp）進(jìn)行檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系同1.4.1，退火溫度見(jiàn)表3。

1.4.5 分離株生物被膜檢測(cè)

采用96孔微量板法，挑取單個(gè)菌落接種于新鮮LB肉湯37 ℃培養(yǎng)至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，吸取200 μL菌液至96孔板37 ℃分別培養(yǎng)6、12、24、36、48、60、72 h，結(jié)晶紫染色20 min，95%乙醇脫色25 min，最后酶標(biāo)儀測(cè)定OD600值，用GraphPad prism軟件繪制菌株BF生長(zhǎng)曲線。以對(duì)照孔（未接種細(xì)菌）的平均 OD+3×SD 的值（ODc）進(jìn)行判斷，菌株可分為以下幾類［12］：無(wú) BF 產(chǎn)生（OD≤ODc），弱 BF 產(chǎn)生（ODc

1.4.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

將40只雌雄各半的小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組和對(duì)照組，每組5只。按0.2 mL·只-1（1.07×1011CFU/mL）劑量腹腔注射菌液，對(duì)照組腹腔注射等量滅菌PBS。觀察小鼠狀態(tài)和死亡情況。

1.4.7 病理組織學(xué)切片觀察

無(wú)菌采集死亡小鼠心、肝、脾、肺、腎等組織用4% 福爾馬林液固定24 h，制作石蠟切片并進(jìn)行蘇木精-伊紅染色（HE染色），觀察組織病理變化。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與鑒定結(jié)果

18份樣品分離得到7株大腸桿菌，分離率38.9%，圖1顯示1株來(lái)自奎屯某牛場(chǎng)（KT）、1株來(lái)自伊犁某牛場(chǎng)（YL）、5株來(lái)自石河子某牛場(chǎng)（SHZ1-1、SHZ1-2、SHZ2、SHZ3、SHZ4），SHZ1牛場(chǎng)分離率最高，為66%（2/3）。7株菌PCR產(chǎn)物電泳得到1 500 bp目的條帶（圖2），通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)不同來(lái)源大腸桿菌與本實(shí)驗(yàn)分離株同源對(duì)比繪制的進(jìn)化樹(shù)，SHZ3、YL同源性最相近，SHZ2菌株與豬源大腸桿菌CP046009同源性高達(dá)100%（圖3）。

2.2 分離株MLST結(jié)果

MLST結(jié)果表明，7株大腸桿菌分為3種ST型，分別為ST183（57.1%）、ST58（28.6%）、ST49（14.3%），其中SHZ1-1、SHZ2、YL、SHZ1-2為ST183；SHZ3、SHZ4為ST58；KT為ST49。

2.3 分離株耐藥表型檢測(cè)結(jié)果

利用微量肉湯稀釋法檢測(cè)7株大腸桿菌對(duì)13種抗菌藥的MIC，表4為MIC檢測(cè)結(jié)果，其中大腸桿菌對(duì)頭孢曲松鈉、頭孢吡肟耐藥率為85.7%，對(duì)阿米卡星耐藥率為71.4%，對(duì)慶大霉素耐藥率為42.9%，大部分菌株對(duì)3種以上抗菌藥耐藥，均為多重耐藥菌。

2.4 耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

7株大腸桿菌中β-內(nèi)酰胺類中blaTEM基因攜帶率為100%，喹諾酮類aac（6′）-Ib基因攜帶率71.4%，分別為KT、SHZ1-1、SHZ3、SHZ4、YL；gyrA基因基因攜帶率為42.8%，分別為KT、SHZ3、SHZ1-2。四環(huán)素類Tet（B）基因攜帶率為71.4%，分別為KT、YL、SHZ2、SHZ3、SHZ1-2，部分檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖4。

未檢測(cè)到β-內(nèi)酰胺類中blaSHV基因、磺胺類sul1、sul3基因和四環(huán)素類Tet（A）基因。

2.5 大腸桿菌生物被膜的測(cè)定

對(duì)分離株生物被膜形成能力檢測(cè)顯示分離7株菌株中KT為強(qiáng)成膜菌株。SHZ1-1、SHZ2、SHZ3、SHZ4、YL菌株為中等成膜菌株；SHZ1-2為弱成膜株。將不同時(shí)間段測(cè)定菌株OD600值繪制BF生長(zhǎng)曲線（圖5），該圖顯示分離株0～36h處于上升階段，6～12h上升迅速，并在24h達(dá)到最大值。48h之后迅速下降，60～72h時(shí)趨于平緩。

2.6 動(dòng)物致病性試驗(yàn)

試驗(yàn)組小鼠感染后部分表現(xiàn)為精神萎靡、行為變緩、被毛蓬松、呼吸急促、眼周圍腫脹。7株分離株中KT、SHZ1-1、SHZ1-2在24h內(nèi)小鼠全部死亡；SHZ2、SHZ3、SHZ4、CJ在7 d中小鼠死亡數(shù)分別為3、4、2、2；對(duì)照組小鼠無(wú)死亡。試驗(yàn)組小鼠解剖后表現(xiàn)為腦水腫，肺臟、脾臟、肝臟和心臟有不同程度的腫大和出血，腸黏膜腫脹充氣。在發(fā)病死亡小鼠肝、肺、脾等臟器中均分離到感染細(xì)菌。

2.7 病理組織學(xué)切片觀察

小鼠感染試驗(yàn)結(jié)果：眼觀發(fā)現(xiàn)肝、脾腫大充血呈暗紅色，肝邊緣呈黑色；肺腫大明顯、伴有出血點(diǎn)。圖6顯示試驗(yàn)組A圖腎小球萎縮變小，腎小管結(jié)構(gòu)組織被破壞；D圖為腎組織空白組；B圖為肝細(xì)胞模糊不清，肝細(xì)胞腫大，胞質(zhì)為淡紅色、渾濁，充滿炎性細(xì)胞；E圖為肝組織空白組；C組肺泡管壁充血水腫，肺泡壁結(jié)構(gòu)被破壞，有大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；F圖為肺空白組。

3 討論

生鮮乳中富含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及水分為微生物創(chuàng)造了快速繁殖生長(zhǎng)的條件，研究顯示生鮮乳中常分離到的致病菌有鏈球菌、葡萄球菌以及大腸桿菌等［16］。付宇［17］、許丹丹等［18］分別從東北地區(qū)、新疆石河子地區(qū)牛奶中分離鑒定出大腸桿菌，可見(jiàn)生鮮乳中存在大腸桿菌比較普遍。本研究在新疆北疆地區(qū)6個(gè)規(guī)模化奶牛場(chǎng)生鮮乳共分離到17株6種不同的細(xì)菌，其中7株為大腸桿菌，KT牛場(chǎng)有5株，SHZ4牛場(chǎng)分離到1株，SHZ1牛場(chǎng)分離2株，且表現(xiàn)出不同程度的致病性。

MLST 序列數(shù)據(jù)可用于病原分型，也廣泛用于細(xì)菌分子流行病學(xué)以及系統(tǒng)發(fā)育的分析。研究顯示某一特定的ST型與某些特定疾病相關(guān)，例如ST131被認(rèn)為是腸外致病性大腸桿菌流行序列型［14］。Shafiq［19］等報(bào)道在浙江、江蘇和上海地區(qū)奶牛乳房炎大腸桿菌分離株的優(yōu)勢(shì)ST型為ST58。葉菊蓮等［20］報(bào)道的浙江省不同動(dòng)物糞便源致病大腸桿菌優(yōu)勢(shì)序列型為ST-284，江婉琳［13］等報(bào)道的新疆克拉瑪依市奶牛糞便分離的多株致病性大腸桿菌ST型ST-154，本研究中分離的大腸桿菌優(yōu)勢(shì)序列型ST183（57.1%），SHZ3、SHZ4 ST型為ST58。提示不同地區(qū)、不同來(lái)源大腸桿菌ST型具有多樣性，其優(yōu)勢(shì)序列也可表現(xiàn)大腸桿菌特征。

大腸桿菌的耐藥現(xiàn)象普遍，不同國(guó)家研究者發(fā)現(xiàn)存在于生鮮乳大腸桿菌具有明顯的耐藥性，且多數(shù)細(xì)菌表現(xiàn)為多重耐藥［21-24］。本試驗(yàn)分離株對(duì)慶大霉素（42.9%），阿米卡星（71.4%），頭孢曲松鈉（85.7%），頭孢吡肟（85.7%）等抗生素表現(xiàn)為多重耐藥的特點(diǎn)與張鵬飛等［3］、吳明光［23］報(bào)道的乳房炎牛奶中分離的大腸桿菌耐藥性類似，分離株SHZ2與攜帶抗生素耐藥基因人源大腸桿菌同源性為99%。頭孢類藥物耐藥率高于慶大霉素耐藥率，提示SHZ牛場(chǎng)可能在臨床治療中使用頭孢類抗生素次數(shù)更多。本研究分離株100%攜帶 blaTEM基因，42.8%的菌株攜帶gyrA基因，對(duì)gyrA基因進(jìn)行測(cè)序未發(fā)現(xiàn)其突變，因此分離株攜帶的喹諾酮類耐藥基因與耐藥表型一致。苑曉萌等［25］在山東地區(qū)乳房炎牛奶分離到的大腸桿菌中blaTEM基因攜帶率為100%，于偉偉等［26］在新疆地區(qū)奶牛乳房炎分離的大腸桿菌中有66.1%的菌株攜帶blaTEM基因。張金寶等［27］研究顯示寧夏地區(qū)奶牛乳房炎197株大腸桿菌中喹諾酮類耐藥基因gyrA檢出率為97.46%情況相同，表明本實(shí)驗(yàn)分離株具有一定的耐藥性，其中分離株對(duì)β-內(nèi)酰胺類的抗生素表現(xiàn)與攜帶β-內(nèi)酰胺類blaTEM耐藥基因情況一致。生物被膜具有復(fù)雜的功能和結(jié)構(gòu)，能夠減少藥物滲透，是造成病原菌耐藥性的重要原因之一［24］。本試驗(yàn)分菌株均能形成明顯的生物被膜，其中KT為強(qiáng)成膜株耐藥性較強(qiáng)，SHZ1-2為弱成膜株耐藥性較弱，表明它們耐藥表型也可能受到影響。blaTEM基因是大腸桿菌中常見(jiàn)的β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，本研究結(jié)果顯示來(lái)自健康奶牛生鮮乳的大腸桿菌分離株具有攜帶多種耐藥基因、對(duì)多種抗生素耐藥且具有形成生物被膜的生物學(xué)特點(diǎn)，再次提示應(yīng)更加關(guān)注規(guī)模化牛場(chǎng)生鮮乳存在的風(fēng)險(xiǎn)因素。

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（責(zé)任編輯：編輯唐慧）

收稿日期：2022-11-14

基金項(xiàng)目：新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（2021AB012，2019AB029），新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)重點(diǎn)領(lǐng)域科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目（）

作者簡(jiǎn)介：王巧梅（1997—），女，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)閯?dòng)物群發(fā)性疾病防控。

*通信作者：周霞（1968—）， 女， 教授， 從事人畜共患病致病機(jī)制與防控方向研究，e－mail： 32123004@qq.com。