楊小催，郭凱欣，李燕芳，唐 慧，張慶業(yè)，潘海華，鄭麗思，柯雪紅△

（1. 廣東省清遠(yuǎn)市中醫(yī)院，廣東清遠(yuǎn) 511500； 2. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東廣州 510405； 3. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東廣州 510405）

五指毛桃為?？浦参锪颜崎臚icus simplicissimaLour. 的干燥根，有廣東人參之美稱，分布于廣東、福建、廣西等地。有五爪龍、土北芪、五指香等別名，為嶺南地區(qū)少數(shù)民族特別是瑤族、壯族的常用藥［1］，最早記載于《生草藥性備要》，具有健脾補(bǔ)肺、行氣利濕、舒筋活絡(luò)之功效，主治脾虛浮腫、食少腹脹、肢倦無(wú)力、肺虛痰喘、帶下、盜汗、水腫、風(fēng)濕痹痛、產(chǎn)后無(wú)乳、跌打損傷等［2-3］。五指毛桃以五爪龍之稱收載于我國(guó)1977 年版《中國(guó)藥典（一部）》，是現(xiàn)行《中國(guó)藥典》品種宮炎平片處方中包含的主要藥材之一［4］，并收錄于2013 年版《廣西壯族自治區(qū)瑤藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（第一卷）》［5］。廣東省清遠(yuǎn)市地處粵北山區(qū)，是我國(guó)瑤族一大聚居區(qū)。五指毛桃作為道地瑤藥材被廣泛研究與應(yīng)用，其資源以野生為主，隨著土地資源的減少和過(guò)度開(kāi)采，導(dǎo)致五指毛桃的野生資源量下降，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求，故其栽培品逐漸增多［6］。目前，尚未見(jiàn)野生與栽培五指毛桃藥材指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別的研究，限制了五指毛桃的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制訂及開(kāi)發(fā)應(yīng)用。本研究中收集廣東省清遠(yuǎn)市不同地區(qū)（連山、連南、英德、清城）的21批野生五指毛桃藥材及市售不同品牌的10 批栽培五指毛桃藥材，采用高效液相色譜（HPLC）法［7-8］構(gòu)建指紋圖譜并測(cè)定其中補(bǔ)骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素的含量，同時(shí)采用層次聚類分析（HCA）［9-10］、主成分分析（PCA）、偏最小二乘法判別分析（PLS-DA）進(jìn)行化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)，為五指毛桃藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），包括Empower2 色譜工作站、Waters2996 二極管陣列檢測(cè)器；XS105 DualRange 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司，精度為十萬(wàn)分之一）；SK3310LHC 型超聲波清洗器（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司，功率為180～350 W，頻率為35/ 53 kHz）；Thermo Legend Micro 17R型離心機(jī)（德國(guó)Thermo公司）。

1.2 試藥

補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)為110739-201918，純度為99.6%），芹菜素對(duì)照品（批號(hào)為111901-202004，純度為99.4%），5-甲氧基補(bǔ)骨脂素對(duì)照品（批號(hào)為520036-201401，純度為99.2%），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇（色譜純，德國(guó)Merck 公司）；水為超純水；五指毛桃藥材經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院袁小紅教授鑒定均為正品，其藥材樣品信息見(jiàn)表1。

表1 栽培與野生五指毛桃藥材樣品信息Tab.1 Sample information of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil ODS2柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）- 水（B），梯度洗脫（0～10 min 時(shí)5%A →10%A，10～50 min 時(shí)10%A →30%A，50～65 min 時(shí)30%A →45%A，65～85 min 時(shí)45%A →90%A，85～87 min 時(shí)90%A →5%A，87～92 min 時(shí)5%A）；流速：1.0 mL/ min；運(yùn)行時(shí)間：92 min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 溶液制備

取補(bǔ)骨脂素、芹菜素、5 - 甲氧基補(bǔ)骨脂素對(duì)照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解，配制成每1 mL 含補(bǔ)骨脂素0.050 4 mg、芹菜素0.016 18 mg、5 - 甲氧基補(bǔ)骨脂素0.050 2 mg的混合對(duì)照品溶液。

取五指毛桃藥材樣品粉末0.2 g，精密稱定，置5 mL容量瓶中，加3 mL 50%甲醇，靜置4～5 h，超聲（功率為350 W，頻率為35 kHz）提取30 min，用50%甲醇定容至5 mL，離心（轉(zhuǎn)速為13 000 r/min）10 min，取上清液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄色譜圖。以13 號(hào)峰（補(bǔ)骨脂素）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別低于1%和2.6%（n= 6）；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）計(jì)算的相似度均大于0.99，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以13 號(hào)峰（補(bǔ)骨脂素）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別低于2.4%和3.0%；采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）計(jì)算的相似度均大于0.99，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末適量，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以13 號(hào)峰（補(bǔ)骨脂素）為參照峰，計(jì)算得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD分別低于1%和2.4%（n= 6），采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）計(jì)算的相似度均大于0.99，表明方法重復(fù)性良好。

2.4 五指毛桃指紋圖譜建立

特征峰及主要色譜峰指認(rèn)：通過(guò)對(duì)10 批栽培五指毛桃HPLC 色譜圖的考察與比較，最終標(biāo)定19 個(gè)共有峰，其峰面積占總峰面積的比例超過(guò)90%。與對(duì)照品比對(duì)，可指認(rèn)3 個(gè)色譜峰，其中13 號(hào)峰、15 號(hào)峰、16 號(hào)峰分別為補(bǔ)骨脂素、芹菜素和5-甲氧基補(bǔ)骨脂素，對(duì)應(yīng)保留時(shí)間分別為43.16，48.25，52.84 min。詳見(jiàn)圖1。其中，13 號(hào)峰（補(bǔ)骨脂素）未與其他峰重疊，即分離度較好，峰強(qiáng)度較其他峰高，故以此峰作為參照峰。

圖1 五指毛桃供試品溶液與混合對(duì)照品溶液高效液相色譜圖13.Psoralen 15.Apigenin 16.5-MethoxypsoralenA.Test solution of Cultivate Fici Simplicissimae Radix B.Test solution of Wild Fici Simplicissimae Radix C.Mixed reference solutionFig.1 HPLC chromatograms of the test solution and mixed reference solution of Fici Simplicissimae Radix

HPLC 指紋圖譜對(duì)比：采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）計(jì)算的相似度均大于0.99，對(duì)10 批栽培五指毛桃藥材樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用多點(diǎn)校正后進(jìn)行自動(dòng)匹配，以10 批栽培五指毛桃藥材樣品均數(shù)為共有模式，建立10 批栽培五指毛桃與21 批五指毛桃對(duì)照?qǐng)D譜。對(duì)照?qǐng)D譜中有3 個(gè)特征峰群，1～12 號(hào)為特征峰群A，保留時(shí)間在0～37 min，其中，1～4 號(hào)峰峰面積逐漸增大，5～12 號(hào)峰峰面積較小且大小接近，12 個(gè)峰占總色譜峰峰面積的12%；13～16 號(hào)為特征峰群B，保留時(shí)間在43～54 min，13號(hào)峰較大，14～16號(hào)峰逐漸增大，4 個(gè)峰占色譜峰峰面積的75%；17～19 號(hào)為特征峰群C，保留時(shí)間在69～78 min，且3 個(gè)峰的峰面積接近。將獲得的10 批栽培五指毛桃與21 批野生五指毛桃共有模式進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，野生五指毛桃無(wú)特征峰群A 的2，10，11，12 號(hào)峰，特征峰群B 和C 是兩者共有的，但峰面積比例差異較大。詳見(jiàn)圖2至圖3。

圖2 栽培與野生五指毛桃高效液相色譜疊加指紋圖譜A.Cultivated Fici Simplicissimae Radix（sample numbers S22-S31）B.Wild Fici Simplicissimae Radix（sample numbers S1-S21）Fig.2 HPLC overlay fingerprints of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

圖3 野生（M1）與栽培（M2）五指毛桃對(duì)照?qǐng)D譜Fig.3 Reference chromatogram of wild Fici Simplicissimae Radix（sample number M1）and cultivated Fici Simplicissimae Radix（sample number M2）

共有峰面積比較：比較栽培五指毛桃與野生五指毛桃的共有峰面積，結(jié)果顯示兩者峰面積差異較明顯，主要表現(xiàn)在野生五指毛桃特征峰群A的2，8，10，11，12號(hào)峰；特征峰群B 和C 為兩者共有，特征峰群B 峰面積所占比例差異較大，在特征峰群B 中13，14，15，16號(hào)峰野生五指毛桃與栽培五指毛桃的比例分別為47∶1∶3∶13和33∶1∶1∶33。

相似度評(píng)價(jià)：根據(jù)10批栽培五指毛桃指紋圖譜測(cè)定結(jié)果，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004 A版）計(jì)算不同批次栽培五指毛桃的相似度，結(jié)果為0.847～0.947。對(duì)21 批野生五指毛桃進(jìn)行內(nèi)部相似度分析，結(jié)果指紋圖譜相似度為0.982～0.998，表明內(nèi)部相似度結(jié)果良好。以栽培五指毛桃的共有模式作為21 批野生五指毛桃的對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算得野生五指毛桃的相似度為0.503～0.594，相似度結(jié)果較低。詳見(jiàn)表2。

表2 野生與栽培五指毛桃指紋圖譜相似度Tab.2 Similarity of HPLC fingerprints of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

2.5 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

HCA：采用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版）將10批栽培五指毛桃與21批野生五指毛桃的指紋圖譜進(jìn)行處理，獲得HPLC 色譜峰峰面積數(shù)據(jù)（量化指紋特征）。采用IBM SPSS Statistics 26 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，將變量設(shè)為峰面積進(jìn)行HCA，在得到的31批五指毛桃樣品指紋圖譜中采用13號(hào)峰（補(bǔ)骨脂素）為對(duì)照的19個(gè)色譜峰相對(duì)峰面積，以歐氏距離平方為聚類統(tǒng)計(jì)量、橫坐標(biāo)為樣品編號(hào)、縱坐標(biāo)為臨界值（不同類別之間的距離），獲得31 批五指毛桃樣品HCA 圖（圖4）。臨界值越小，譜圖相似度越高。結(jié)果顯示，當(dāng)臨界值為25時(shí)，31批樣品可聚為兩大類，編號(hào)為S1 - S21（均為野生五指毛桃）的樣品聚為一類，編號(hào)為S22 - S31（均為栽培五指毛桃）的樣品聚為一類；當(dāng)臨界值為1時(shí)，編號(hào)為S1-S3（產(chǎn)地為清遠(yuǎn)連山）的樣品聚為一類；編號(hào)為S22、S30、S31（金綠生品牌）的樣品聚為一類；當(dāng)臨界值為2時(shí)，編號(hào)為S23、S26、S28（仙逸堂品牌）的樣品聚為一類。聚類結(jié)果較理想，可有效地將栽培五指毛桃與野生五指毛桃2 個(gè)品種區(qū)分，還能將不同野生產(chǎn)地及不同飲片加工品牌進(jìn)行區(qū)分。

圖4 栽培與野生五指毛桃藥材樣品的層次聚類分析樹(shù)狀圖Fig.4 Dendrogram of hierarchical cluster analysis of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

PCA：采用SIMCA-P14.0 軟件［11］，以10 批栽培五指毛桃與21 批野生五指毛桃樣品的19 個(gè)共有峰的峰面積為X變量、樣品批次為Y變量進(jìn)行無(wú)監(jiān)督的PCA。結(jié)果顯示，PCA 圖中大部分野生五指毛桃樣本群與栽培五指毛桃樣本群被分成不同的空間聚落，區(qū)分效果明顯。栽培五指毛桃聚落分布較緊湊；野生五指毛桃聚落分布較分散，離散度大于栽培五指毛桃樣本。詳見(jiàn)圖5。

圖5 栽培與野生五指毛桃藥材樣品主成分分析得分圖Fig.5 Scattered plots of PCA of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

PLS-DA：在PCA結(jié)果的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步做有監(jiān)督的PLS-DA，結(jié)果識(shí)別模型的解釋度（R2X）為0.66，模型的預(yù)測(cè)度（Q2）為0.794。對(duì)栽培五指毛桃與野生五指毛桃進(jìn)行分組比較（圖6），區(qū)分效果明顯，此結(jié)果與PCA 的結(jié)果相吻合。根據(jù)分組的貢獻(xiàn)率（VIP）進(jìn)行排序（圖7）。其中，峰15（芹菜素）、峰13（補(bǔ)骨脂素）、峰16（5-甲氧基補(bǔ)骨脂素）、峰3、峰12、峰8 的VIP 值均大于1.0，表明這6 個(gè)組分可能為栽培五指毛桃與野生五指毛桃的質(zhì)量差異標(biāo)志物，即以上6個(gè)化學(xué)組分在栽培五指毛桃與野生五指毛桃中顯示一定差異性。

圖6 栽培與野生五指毛桃藥材樣品PLS-DA得分圖Fig.6 PLS-DA score plot of cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix

圖7 19個(gè)共有峰對(duì)分組的貢獻(xiàn)值（VIP值）Fig.7 Variable importance of projection（VIP）of the 19 common peaks for grouping

2.6 含量測(cè)定

2.6.1 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2，4，8，12，16，20μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以含量（X，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 補(bǔ)骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素線性關(guān)系考察結(jié)果Tab.3 Results of the linear relation test of psoralen，apigenin and 5-methoxypsoralen

精密度試驗(yàn)：精密量取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，按2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果補(bǔ)骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為0.56%，0.58%，0.56%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末0.2 g，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，20，24 h 時(shí)按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果補(bǔ)骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素峰面積的RSD分別為0.87%，1.12%，0.96%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末0.2 g，精密稱定，按2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6 份，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果補(bǔ)骨脂素、芹菜素、5 - 甲氧基補(bǔ)骨脂素的平均含量分別為每100 g藥材含0.065 7，0.007 5，0.022 5 g，RSD分別為1.24%，1.32%，1.27%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取樣品（編號(hào)為S1）粉末0.1 g，精密稱定，置5 mL 容量瓶中，分別加入一定量的補(bǔ)骨脂素、芹菜素、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素，平行6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.4 Results of the recovery test（n=6）

2.6.2 樣品含量測(cè)定

取栽培五指毛桃與野生五指毛桃藥材樣品，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算各成分的含量，比較野生五指毛桃與栽培五指毛桃兩者的差異［12-13］。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 栽培與野生五指毛桃中3種成分含量測(cè)定結(jié)果（g/100 g，n=3）Tab.5 Results of the content determination of the three components in cultivated Fici Simplicissimae Radix and wild Fici Simplicissimae Radix（g/100 g，n=3）

3 討論

3.1 指紋圖譜共有模式選擇

相似度評(píng)價(jià)采用中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A版），共有模式按平均值法生成。本研究中將10批栽培五指毛桃和21批野生五指毛桃數(shù)據(jù)同時(shí)導(dǎo)入軟件建立共有模式，因兩者雖有部分共有峰，但峰面積及峰面積比例差異明顯，生成的共有模式融合了兩者的特征。以10 批栽培五指毛桃的色譜圖生成的對(duì)照?qǐng)D譜作為共有模式，結(jié)果顯示，10 批栽培五指毛桃相似度均高于0.84，表明各批栽培五指毛桃的化學(xué)成分種類及性質(zhì)相似。21 批野生五指毛桃相似度均低于0.6，表明以栽培五指毛桃指紋圖譜為共有模式能有效區(qū)分栽培五指毛桃與野生五指毛桃。

3.2 色譜條件選擇

預(yù)試驗(yàn)中，分別考察甲醇-水、乙腈-水溶液流動(dòng)相體系進(jìn)行等度洗脫的效果，結(jié)果在以乙腈- 水得到的指紋圖譜中能較完整地將主要色譜峰分離，并得到較平穩(wěn)的基線，有利于采集指紋圖譜的數(shù)據(jù)，進(jìn)一步保障了數(shù)據(jù)的可重復(fù)性；選擇230，250，270，320 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，結(jié)果于不同波長(zhǎng)處各色譜峰有較大差異，綜合考慮，選定于320 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定，色譜峰數(shù)量較多，各峰之間分離度較好，基線較平穩(wěn)。

3.3 含量測(cè)定指標(biāo)成分選擇

由圖7 可知，VIP 值排序居前3 的成分分別為芹菜素（峰15）、補(bǔ)骨脂素（峰13）、5-甲氧基補(bǔ)骨脂素（峰16），五指毛桃主要有效成分為補(bǔ)骨脂素、芹菜素等香豆素及黃酮類成分［14-16］。本研究結(jié)果顯示，10 批栽培五指毛桃3 種化學(xué)成分的平均含量分別為每100 g 藥材含0.090 3，0.007 7，0.022 9 g，而21 批野生五指毛桃的平均含量分別為每100 g 藥材含0.092 1，0.000 8，0.022 0 g。栽培五指毛桃的芹菜素含量明顯高于野生五指毛桃，與藥材品種、產(chǎn)地、采收季節(jié)等有關(guān)。故選用上述最具代表性的3個(gè)成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中采用指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)方法構(gòu)建質(zhì)控模式［17-20］，可將栽培五指毛桃與野生五指毛桃有效區(qū)分，體現(xiàn)出品種之間的量化差異。HCA 和PCA 結(jié)果基本一致，且與實(shí)際相符，說(shuō)表明本研究中建立的識(shí)別模式直觀、合理、可行，可作為五指毛桃質(zhì)量評(píng)價(jià)主要依據(jù)。但因藥材取樣的局限性，本研究結(jié)果不能完全代表各產(chǎn)地栽培五指毛桃與野生五指毛桃的質(zhì)量差異，應(yīng)進(jìn)一步擴(kuò)大藥材樣品收集范圍或進(jìn)行其他方面的深入分析，以提高其研究的科學(xué)性。