趙振理,胡少華,萬(wàn)智盛,卜威振,陳松強(qiáng),韓天紅,陸毅群

(1.海南省婦女兒童醫(yī)學(xué)中心,海南 ?？?570206;2.復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院,上海 201102)

不孕癥是世界范圍內(nèi)育齡夫婦常見的公共衛(wèi)生問題之一。研究[1]指出,全球8%～12%的育齡夫婦受此問題困擾。在不孕的育齡夫婦中,男性因素占50%左右,因無(wú)精癥所導(dǎo)致的不育占10%～50%[2-4]。通過(guò)對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取精子細(xì)胞可以使男性不育患者成功生育具有自身遺傳物質(zhì)的后代。由于誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(iPSCs)具有分化為體內(nèi)所有類型細(xì)胞的可能,所以它向生殖細(xì)胞的轉(zhuǎn)化成為了研究熱點(diǎn)。本研究擬通過(guò)對(duì)小鼠iPSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),從而獲取原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞(PGCLCs),探討其向生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化的潛能,并為后續(xù)精子細(xì)胞的獲得奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠iPSCs細(xì)胞株

小鼠iPSCs細(xì)胞株購(gòu)買于美國(guó)賽默飛世爾科技公司。

1.1.2 主要試劑與儀器

高糖型改良依格爾(DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清(SH30070.03)(Hyclone,北美);白血病抑制因子(LIF)(美國(guó)默克);睪酮(T5411)(美國(guó)Sigma);彩色預(yù)染蛋白標(biāo)記(10-200 kDa)(M227-01)(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物公司);蛋白印跡膜再生液(ZN1923,北京博奧通公司);PCR引物均由上海生工合成;RNA提取試劑(日本Takara);iScript cDNA合成試劑盒(1708891EDU)(美國(guó)伯樂);3K15型低溫高速離心機(jī)(Sigma公司);蛋白質(zhì)印跡系統(tǒng)(型號(hào):CriterionTM電泳槽,Trans-Blot@轉(zhuǎn)印槽)(美國(guó)伯樂公司);ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 iPSCs細(xì)胞傳代培養(yǎng)

在高糖DMEM培養(yǎng)基中對(duì)小鼠iPSCs進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合至90%時(shí),棄去舊培養(yǎng)基,用2 mL磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌細(xì)胞2次,棄去PBS后加入2 mL 0.25%胰蛋白酶-0.02%乙二胺四乙酸(EDTA)混合消化液,置顯微鏡下觀察,約30 s,當(dāng)細(xì)胞變圓后迅速加入2 mL完全培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹打,收集細(xì)胞。用胰蛋白酶-EDTA消化后,將約1×106個(gè)iPSCs細(xì)胞轉(zhuǎn)移到10 cm培養(yǎng)皿中,添加含有10 mL不含LIF的培養(yǎng)基孵育。在第5天換含睪酮(1 μmol/L)的完全培養(yǎng)基繼續(xù)孵育,48 h后更換培養(yǎng)基,每2天更換一次培養(yǎng)基,將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周。

1.2.2 蛋白質(zhì)印跡法

采用蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)對(duì)蛋白水平進(jìn)行鑒定。細(xì)胞總蛋白提取:將制備的細(xì)胞懸液接種于6孔板中,待細(xì)胞融合至90%時(shí),棄上清,用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞樣本后加入1 mL細(xì)胞組織快速裂解液(RIPA)充分裂解、離心,吸取上清至一預(yù)冷的Eppendorf管中,即為抽提得到的細(xì)胞蛋白。通過(guò)二辛可酸法(BCA)進(jìn)行蛋白定量。凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜:根據(jù)待測(cè)蛋白分子量的不同配制壓縮膠,灌制十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)。將細(xì)胞內(nèi)總蛋白加入泳道進(jìn)行電泳,放入轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡后恒壓轉(zhuǎn)膜,觀察膜上蛋白。顯影:用三羥甲基氨基甲烷鹽緩沖液(TBST)清洗膜上殘余液體,加入一抗(一抗及稀釋比見表1),封口過(guò)夜后加入適當(dāng)濃度二抗(二抗及稀釋比見表1),封口孵育。蛋白表達(dá)量使用Image Pro Plus 6.0軟件對(duì)光密度值進(jìn)行分析,蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白灰度值/內(nèi)參蛋白灰度值。

表1 抗體及稀釋比

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR

將制備的細(xì)胞懸液接種于6孔板中,每孔細(xì)胞數(shù)為5×105,待細(xì)胞融合至90%時(shí),棄上清,每孔加入0.5 mL總RNA提取劑(Trizol),反復(fù)吹打至澄清,并轉(zhuǎn)移至Eppendorf管。用焦碳酸二乙酯水(DEPC)10 μL溶解RNA,吹打混勻,得到總RNA溶液,取2 μL樣品,使用Nanodrop 2000測(cè)定mRNA濃度和純度。cDNA合成及實(shí)時(shí)定量PCR采用20 μL體系,擴(kuò)增后結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算,所用引物見下表2。

表2 RT-PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 Western blot對(duì)iPSCs鑒定結(jié)果

Western blot結(jié)果顯示,由iPSCs體外誘導(dǎo)分化獲得的生殖細(xì)胞樣細(xì)胞特異性表達(dá)Oct-4和C-ki蛋白(見圖1)。

圖1 Western blot檢測(cè)iPSCs細(xì)胞Oct-4和C-ki蛋白的表達(dá)

2.2 實(shí)時(shí)定量PCR對(duì)iPSCs進(jìn)行鑒定

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示,由iPSCs體外誘導(dǎo)分化獲得的生殖細(xì)胞樣細(xì)胞特異性表達(dá)Mvh和Fragilis及Stella mRNA(見圖2)。

Relative mRNA levels為mRNA相對(duì)表達(dá)水平

3 討 論

生殖健康是人類社會(huì)持續(xù)發(fā)展的重要因素,在不孕癥中占主要因素的男性不育是急需解決的一大問題。遺傳疾病、泌尿生殖道感染、性腺功能減退、隱睪、精索靜脈曲張、射精障礙、免疫因素和全身性疾病等均可導(dǎo)致男性不育[5]。無(wú)精癥分為梗阻性無(wú)精癥和非梗阻性無(wú)精癥,其中非梗阻性無(wú)精癥患者占所有男性不育癥患者的10%～15%[6]。目前梗阻性無(wú)精癥患者通過(guò)外科手術(shù)治療可以獲得成熟精子并成功受孕,非梗阻性無(wú)精癥患者無(wú)法通過(guò)手術(shù)治療,而需采用供精人工授精或供精試管嬰兒技術(shù),但所生育的后代中不含有父親自身的遺傳物質(zhì),大部分患者不能接受。如何解決這一難題,目前仍處于實(shí)驗(yàn)階段。近年來(lái),新興的干細(xì)胞治療領(lǐng)域迅速成為再生醫(yī)學(xué)的新時(shí)代,干細(xì)胞的多種潛能成為各個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重點(diǎn)[7]。干細(xì)胞在不孕癥方面的相關(guān)研究主要集中在通過(guò)對(duì)干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)而獲取精子細(xì)胞,并采用卵泡漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)(ICSI)獲得胚胎,此方式可以成功獲得具有父親自身遺傳物質(zhì)的后代[8-9]。

在人體組織發(fā)現(xiàn)的幾種類型的干細(xì)胞中,骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)因其具有多系分化潛能、低免疫原性等受到了較多的關(guān)注。Nayernia等[10]于2006年提取小鼠的BMSC并對(duì)其進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)部分BMSC表達(dá)有PGCLCs的標(biāo)志物。首次證實(shí)了BMSC可以分化為生殖細(xì)胞,但并未進(jìn)一步分化為精母細(xì)胞和精子細(xì)胞。有學(xué)者[11-13]同樣發(fā)現(xiàn),對(duì)BMSC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),雖然可以獲得表達(dá)生殖細(xì)胞標(biāo)志物的干細(xì)胞,但最終無(wú)法成功獲得單倍體精子細(xì)胞,而且隨著年齡的增長(zhǎng),BMSC的數(shù)量、分化潛能和生存能力會(huì)逐漸降低。根據(jù)現(xiàn)有研究結(jié)果,通過(guò)對(duì)BMSC進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)可能無(wú)法獲得單倍體的精子細(xì)胞,而BMSC主要存在于骨髓中,獲取比較困難,進(jìn)一步限制了它在向生殖細(xì)胞轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用。

多能干細(xì)胞(PSCs)包括胚胎干細(xì)胞(ESCs)和iPSCs,它具有分化為成體內(nèi)所有類型細(xì)胞的可能。但臨床上非梗阻性不育患者自身的ESCs已不可能重新獲得,并且ESCs的應(yīng)用存在相關(guān)倫理問題,因此無(wú)法通過(guò)患者自身ESCs誘導(dǎo)培養(yǎng)獲取成熟精子。

Takahashi等[14-15]于2006年將四種轉(zhuǎn)錄因子(OCT3/4,c-MYC,SOX2和KLF4)誘導(dǎo)到小鼠成纖維細(xì)胞中,首次產(chǎn)生了小鼠iPSCs,并于第二年使用同樣的轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)產(chǎn)生了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs),轉(zhuǎn)化效率為0.01%～0.02%。隨著技術(shù)的發(fā)展,目前iPSC可以通過(guò)多種方法從多種細(xì)胞來(lái)源高效生成[16-18]。通過(guò)不同來(lái)源的細(xì)胞誘導(dǎo)分化而來(lái)的iPSCs同樣具有ESCs的特性,并且可分化為不同類型的細(xì)胞[19-21]。由于iPSCs具有無(wú)限增殖和分化為三個(gè)胚層的能力,Eguizabal等[22]體外誘導(dǎo)培養(yǎng)hiPSCs,結(jié)果顯示其具有完整和強(qiáng)大的減數(shù)分裂能力,但需要進(jìn)一步的分析來(lái)評(píng)估減數(shù)分裂細(xì)胞的發(fā)育能力。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)小鼠來(lái)源的iPSCs進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),對(duì)獲得的細(xì)胞進(jìn)行Western blot鑒定發(fā)現(xiàn)其可特異性表達(dá)Oct-4及C-kit蛋白;另外,通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR鑒定發(fā)現(xiàn)其可特異性表達(dá)Mvh,Fragilis及Stella mRNA。結(jié)果提示通過(guò)對(duì)小鼠iPSCs的誘導(dǎo)培養(yǎng),成功獲得了PGCLCs,這為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ)。