余亮亮 李朋

浙江省麗水市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江麗水 323000

研究顯示，育齡期夫婦的不孕不育癥發(fā)病率約為10%～15%，其中30%是由男性因素所引起，少精癥、弱精癥是導(dǎo)致男性不育的主要原因[1,2]。由于精液的異質(zhì)性，多數(shù)少精癥、弱精癥患者的發(fā)病機(jī)制尚不明確[3]。精子中約有90%的基因處于活躍的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)，微小核糖核酸是一類內(nèi)源性的非編碼RNA，大小約19～26 個(gè)核苷酸，參與人體多種生理過(guò)程，在精原干細(xì)胞自我更新、分裂繁殖及精子的生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用[4]。微小核糖核酸-34c（miR-34c）是miRNAs 家族的重要成員，有研究顯示，miR-34c對(duì)正常睪丸功能、調(diào)節(jié)精子成熟和功能發(fā)揮重要作用[5]，故推測(cè)miR-34c 可能與少精癥、弱精癥患者的精液質(zhì)量有一定的關(guān)系。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)精漿miR-34c 表達(dá)水平，探討其與少精癥、弱精癥患者精液質(zhì)量的關(guān)系，為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020 年1 月至2022 年3 月浙江省麗水市人民醫(yī)院收治的135 例少精癥患者為少精癥組，156例弱精癥患者為弱精癥組，同期選取150 例育齡期健康男性為對(duì)照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①少精癥組、弱精癥組患者均符合世界衛(wèi)生組織相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；②年齡22～40 歲；③少精癥組、弱精癥組受試者的夫妻性生活正常且未采取避孕措施2 年以上而未能生育者；④配偶婦科檢查結(jié)果正常；⑤對(duì)照組經(jīng)精液標(biāo)本檢查結(jié)果正常；⑥受試者依從性好；⑦受試者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①泌尿生殖系統(tǒng)感染；②其他原因?qū)е碌哪行圆辉腥珉[睪、染色體異常、化療等；③采樣期間吸煙、酗酒等；④合并其他慢性疾??；⑤造血系統(tǒng)疾?。虎蘧窦膊』颊?；⑦射精障礙者。少精癥組受試者年齡 24～40 歲，平均（33.15±6.32）歲；體質(zhì)量指數(shù)21～29kg/m2，平均（25.48±2.67）kg/m2；弱精癥組受試者年齡22～39歲，平均（31.86±6.89）歲；體質(zhì)量指數(shù)20～29kg/m2，平均（26.04±2.54）kg/m2；對(duì)照組受試者年齡22～40 歲，平均（32.85±5.36）歲；體質(zhì)量指數(shù)22～29kg/m2，平均（25.77±2.47）kg/m2。三組受試者的年齡、體質(zhì)量指數(shù)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。本研究經(jīng)浙江省麗水市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批件號(hào)：201912-003）。

1.2 研究方法

1.2.1 精子樣本采集與制備 樣本采集前禁欲1 周，采用手淫法取精液于無(wú)菌取精杯中，于37℃恒溫箱中靜置30min，至完全液化后進(jìn)行常規(guī)精液檢查，以1500 轉(zhuǎn)/min 離心10min，12000 轉(zhuǎn)/min 離心5min，取精漿2～3ml，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 常規(guī)精液質(zhì)量檢查 采用RT-S100 精子質(zhì)量分析儀（深圳市瑞圖生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行精液量、精子正常形態(tài)率、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比（a 級(jí)為精子運(yùn)動(dòng)狀況極好，呈快速直線前向運(yùn)動(dòng)；b 級(jí)為精子運(yùn)動(dòng)狀況很好，呈前向的曲線運(yùn)動(dòng)；a+b 級(jí)>50%為精子活力正常）及精子前向運(yùn)動(dòng)率檢查。

1.2.3 精漿miR-34c表達(dá)水平檢測(cè) 使用Trizol試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司）提取精漿總RNA，取200μl預(yù)處理的精漿樣本，加入1ml Trizol 混勻，倒入裝有氯仿、異丙醇和95%乙醇的離心管中，獲得總RNA；用cDNA 合成試劑盒（北京天根生化科技公司）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，加入SYBR Premix ExTap，使用MA-6000 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀（蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃，30s；95℃，15s；60℃，60s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，以焦碳酸二乙酯處理過(guò)的雙蒸水為陰性對(duì)照，以U6 為內(nèi)參，各引物擴(kuò)增序列見(jiàn)表1。

表1 引物擴(kuò)增序列

1.3 觀察指標(biāo)

比較三組的精漿miR-34c 表達(dá)水平、精液質(zhì)量（包括精液量、精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比、精子前向運(yùn)動(dòng)率），并分析少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析，計(jì)量資料均行正態(tài)性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多樣本比較采用單因素方差分析和SNK-q 檢驗(yàn)；采用Pearson 相關(guān)性分析少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達(dá)與精液質(zhì)量的關(guān)系，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組的精漿miR-34c 表達(dá)水平比較

三組的精漿miR-34c 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），少精癥組、弱精癥組的miR-34c表達(dá)水平均低于對(duì)照組（P<0.05），少精癥組與弱精癥組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)表2。

表2 三組的精漿miR-34c 表達(dá)水平比較（ ）

表2 三組的精漿miR-34c 表達(dá)水平比較（ ）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05

2.2 三組的精液質(zhì)量參數(shù)比較

三組的精液量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；三組的精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比、精子前向運(yùn)動(dòng)率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；少精癥組、弱精癥組的上述指標(biāo)均低于對(duì)照組（P<0.05），少精癥組的精子總數(shù)、精子濃度低于弱精癥組（P<0.05），少精癥組的精子活力a+b 級(jí)百分比、精子前向運(yùn)動(dòng)率高于弱精癥組（P<0.05），見(jiàn)表3。

表3 三組的精液質(zhì)量參數(shù)比較（ ）

表3 三組的精液質(zhì)量參數(shù)比較（ ）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與弱精癥組比較，#P<0.05

2.3 少精癥組的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，少精癥組的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精液量無(wú)相關(guān)性（P>0.05），與精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比及精子前向運(yùn)動(dòng)率呈正相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表4。

表4 少精癥組的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

2.4 弱精癥組的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

Pearson 相關(guān)分析結(jié)果顯示，弱精癥組的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精液量無(wú)相關(guān)性（P>0.05），與精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比及精子前向運(yùn)動(dòng)率呈正相關(guān)（P<0.05），見(jiàn)表5。

表5 弱精癥組的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精液質(zhì)量的相關(guān)性

3 討論

少精癥、弱精癥是導(dǎo)致男性不育的常見(jiàn)原因，好發(fā)于精索靜脈曲張、內(nèi)分泌異常、生殖道感染者[7,8]，其精液質(zhì)量如精子總數(shù)、精子濃度、精子活力等降低，不僅影響不育者的身體健康，還帶來(lái)嚴(yán)重的心理壓力。本研究中少精癥組、弱精癥組的精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比、精子前向運(yùn)動(dòng)率均低于對(duì)照組，提示少精癥、弱精癥患者的精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比、精子前向運(yùn)動(dòng)率均低于正常水平，與于忠英等[9]的研究一致。另外，少精癥組的精子總數(shù)、精子濃度低于弱精癥組，但少精癥組的精子活力a+b 級(jí)百分比、精子前向運(yùn)動(dòng)率高于弱精癥組，提示少精癥患者的精子總數(shù)、精子濃度更低，弱精癥患者的精子活力a+b級(jí)百分比、精子前向運(yùn)動(dòng)率更低。少精癥又稱作精子減少癥，主要表現(xiàn)為精子減少，但同時(shí)精子活力較正常水平減弱；弱精癥主要表現(xiàn)為精子活動(dòng)力低下，但同時(shí)精子數(shù)量較正常水平減少[10-12]。

本研究結(jié)果顯示，少精癥組、弱精癥組的miR-34c表達(dá)水平均低于對(duì)照組，少精癥組與弱精癥組間無(wú)明顯差異，提示少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c表達(dá)水平低于健康育齡期男性，推測(cè)miR-34c 可能參與少精癥、弱精癥的病理過(guò)程。miR-34c 是miR-34家族成員，miR-34 家族在進(jìn)化中是一類保守的miRNA 家族，成熟的miR-34c 序列位于同一主基因原初轉(zhuǎn)錄本的外顯子內(nèi)[13,14]。Dorostghoal等[15]研究顯示，不育者的精子miR-34c-5p 含量顯著低于可育對(duì)照者，本研究結(jié)果與之一致，證實(shí)miR-34c 與男性不育的發(fā)生密切相關(guān)[16]。

本研究進(jìn)一步相關(guān)性分析miR-34c 表達(dá)水平與精漿質(zhì)量的關(guān)系，結(jié)果顯示，少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達(dá)水平與精子總數(shù)、精子濃度、精子活力a+b 級(jí)百分比及精子前向運(yùn)動(dòng)率呈正相關(guān)，提示miR-34c 表達(dá)水平與少精癥、弱精癥患者的精液質(zhì)量存在緊密聯(lián)系。王凡等[17]研究顯示，MicroRNA-34b/c 位點(diǎn)rs4938723 與男性不育相關(guān)。Momeni等[18]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34b/c 啟動(dòng)子區(qū)域的高甲基化可引起miR-34 家族異常低表達(dá)，進(jìn)而影響精液質(zhì)量。另有相關(guān)研究報(bào)道，miR-34c 具有相似或相同的種子序列，能夠與3’-UTR 區(qū)域結(jié)合，從而對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生影響，同時(shí)調(diào)節(jié)患者的免疫系統(tǒng)，在精子的生成中發(fā)揮作用[19]。Welponer等[20]研究發(fā)現(xiàn)，miR-34a 和miR-34b/c 的啟動(dòng)子區(qū)域存在p53 結(jié)合位點(diǎn)，p53 能夠直接調(diào)節(jié)miR-34 家族成員的表達(dá)進(jìn)而影響生精細(xì)胞的凋亡、精母細(xì)胞的分裂等過(guò)程?；谝陨涎芯坎聹y(cè)miR-34c 的表達(dá)水平能夠影響精子質(zhì)量，臨床可嘗試通過(guò)調(diào)控miR-34c 的表達(dá)治療少精癥、弱精癥。

綜上，少精癥、弱精癥患者的精漿miR-34c 表達(dá)水平低于正常水平，且與精液質(zhì)量呈正相關(guān)，miR-34c的異常表達(dá)可能是影響少精癥、弱精癥患者精液質(zhì)量的原因之一。