王靜藝，鄒勇，漆正堂*

（1.華東師范大學(xué) “青少年健康評價與運(yùn)動干預(yù)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200241；2.華東師范大學(xué) 體育與健康學(xué)院，上海 200241）

腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）屬于絲/蘇氨酸蛋白激酶，幾乎存在于哺乳動物所有組織中，其活性受一磷酸腺苷（adenosine monophosphate，AMP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）、AMP/ATP、AMPK激酶、蛋白磷酸酶、活性氧等多重因素調(diào)節(jié)。AMPK一旦被激活，可磷酸化100多種蛋白質(zhì)，以促進(jìn)ATP生成的分解代謝，抑制ATP消耗的合成代謝，從而維持能量穩(wěn)態(tài)（Townsend et al.，2023）。AMPK通過磷酸化下游底物參與細(xì)胞生長、衰老與凋亡、細(xì)胞自噬、線粒體生物合成等幾乎所有的生命活動。磷酸化是蛋白質(zhì)活性的一種調(diào)節(jié)方式，而這種調(diào)節(jié)大多是以AMPK激活為前提的。AMPK的蛋白結(jié)構(gòu)包含多個磷酸化位點(diǎn)，以及泛素化、SUMO化、乙?；?、甲基化和氧化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的修飾大部分是可逆和可組合的，使AMPK能以多種形態(tài)靈活應(yīng)對復(fù)雜的生理情境（Ovens et al.，2021）。

AMPK是細(xì)胞感受能量應(yīng)激狀態(tài)并將其“翻譯”成細(xì)胞信號的重要激酶，其底物的廣泛性及其活性的可調(diào)節(jié)性，讓AMPK一直是運(yùn)動與代謝研究的焦點(diǎn)。在能量應(yīng)激狀態(tài)下，急性運(yùn)動導(dǎo)致AMPK迅速激活，動員細(xì)胞產(chǎn)生ATP滿足運(yùn)動需要。長期訓(xùn)練會提高安靜狀態(tài)下AMPK的活性，讓機(jī)體處于代謝活躍狀態(tài)，但也導(dǎo)致機(jī)體對運(yùn)動的應(yīng)激反應(yīng)減弱，表現(xiàn)為AMPK瞬時激活不明顯。關(guān)于AMPK與運(yùn)動的研究已持續(xù)數(shù)十年，并達(dá)成共識：AMPK是能量代謝的核心調(diào)控因子，運(yùn)動激活A(yù)MPK改善細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，產(chǎn)生健康效應(yīng)（Spaulding et al.，2022）。然而這依舊是籠統(tǒng)而宏觀的概念。AMPK在復(fù)雜運(yùn)動情境中的應(yīng)答形態(tài)是怎樣的？在細(xì)胞和動物實(shí)驗(yàn)中很難捕捉AMPK蛋白復(fù)合物的實(shí)時變化和多位點(diǎn)結(jié)構(gòu)修飾，因此對這一問題很難回答。綜合結(jié)構(gòu)生物學(xué)的方法和新的研究證據(jù)，本綜述進(jìn)一步解析運(yùn)動情境對AMPK的多位點(diǎn)修飾過程，以及AMPK不同活性形態(tài)對運(yùn)動能力和健康維持的不同意義。

1 AMPK的識別基序及其底物選擇性

1973年研究發(fā)現(xiàn)，大鼠肝臟中有一個組分具有激酶活性，可以磷酸化并抑制乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶（3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase，HMGCR）這兩個脂質(zhì)合成關(guān)鍵酶的活性（Beg et al.，1973； Carlson et al.，1973）。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，該組分能被AMP激活，因此，在1988年被確定為AMPK而非蛋白激酶A（Sim et al.，1988）。隨后的研究發(fā)現(xiàn)，AMPK的AMP結(jié)合域和催化域位于一個63 kDa的多肽上，磷酸化底物的共識別序列包含絲氨酸殘基、N端（即-1處）一個疏水殘基，在-2、-3或-4處至少有一個精氨酸殘基（Carling et al.，1989a，1989b）。哺乳動物AMPK與酵母Snf1蛋白激酶的催化結(jié)構(gòu)域具有結(jié)構(gòu)和功能同源性，識別底物所需的基序?yàn)镸/V/L/I-（R/K/H，X，X）-X-S/T-X-X-X-M/V/L/I，其中M、V、L、I為可以相互替代的疏水殘基，R、K、H為可以相互替代的堿性殘基，X為任意殘基，逗號表示括號中殘基的順序不重要。S/T表示Ser、Thr磷酸化位點(diǎn)（Mitchelhill et al.，1994）。這種基序決定了AMPK對底物選擇性并不高，許多蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)都包含這種基序（表1）。同時，也決定了AMPK在生物進(jìn)化中的保守性和物種間的相似性。

表1 AMPK常見底物蛋白的磷酸化位點(diǎn)及其基序Table 1 Phosphorylation Sites and Motifs of Common Substrate Proteins of AMPK

AMPK激活通過靶向固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1C（sterol regulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（carbohydrate response element binding protein，ChREBP）、哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin，mTOR）和ACC1/2的不同磷酸化位點(diǎn)抑制脂肪和蛋白質(zhì)合成。AMPK還通過磷酸化組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase 5，HDAC5）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α （peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator-1α，PGC-1α）和UNC-51樣激酶（unc-51-like kinase，ULK）增強(qiáng)葡萄糖攝取、線粒體代謝和細(xì)胞自噬等（Ke et al.，2018）。總之，AMPK通過底物蛋白的磷酸化，促進(jìn)營養(yǎng)物的攝取和分解，并抑制合成代謝。很多蛋白在氨基酸序列上保留了AMPK的識別位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)，即表1中的紅色小寫字母），AMPK激活對細(xì)胞或機(jī)體代謝具有整體調(diào)控能力（圖1）。這也是AMPK作為能量代謝核心調(diào)控因子的前提。

圖1 AMPK激活對細(xì)胞或機(jī)體代謝的整體調(diào)控路徑Figure 1.A Holistic Pathway that AMPK Activation Regulates Cellular or Body Metabolism

2 AMPK亞基的結(jié)構(gòu)生物學(xué)解析

AMPK是由一個催化亞基α（α1和α2兩種亞型）、兩個調(diào)節(jié)亞基β（β1和β2兩種亞型）和γ（γ1、γ2和γ3三種亞型）組成的異源三聚體（Cheung et al.，2000）（圖2）。每個亞基的所有亞型都能以1∶1∶1的比例結(jié)合，從而產(chǎn)生12種可能的AMPK復(fù)合物，分布在細(xì)胞的特定隔間中，如細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、線粒體、溶酶體或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等。不同組織中AMPK復(fù)合物的組成存在差異，在嚙齒類動物的肝臟中，α1和α2的表達(dá)水平相似，β1和γ1是主要的調(diào)節(jié)亞基，意味著嚙齒類動物肝臟主要表達(dá)α1β1γ1和α2β1γ1兩種復(fù)合物，而在骨骼肌中，α2、β2和γ3是主要亞基，因此含有α2β2γ3的異源三聚體占主導(dǎo)地位（Steinberg et al.，2019）。研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼肌（主要在白肌，糖酵解Ⅱ型纖維）中表達(dá)的α2β2γ3復(fù)合物優(yōu)先被短時間高強(qiáng)度運(yùn)動激活（Birk et al.，2006），可能是急性運(yùn)動激活A(yù)MPK的表現(xiàn)；而不局限于骨骼肌表達(dá)的α1β2γ1和α2β2γl復(fù)合物則更多是在紅肌、氧化型I型骨骼肌纖維中被長時間的耐力運(yùn)動激活（Kjobsted et al.，2018），這可能是長期訓(xùn)練導(dǎo)致AMPK活性提高的主要表現(xiàn)。這表明AMPK復(fù)合物具有組合多變的激活形式，以備不同的運(yùn)動情境選擇性激活。

圖2 AMPK復(fù)合物的蛋白結(jié)構(gòu)域及其能量-信號轉(zhuǎn)換域(引自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫)Figure 2.The Protein Domain and Its Energy Signal Conversion Domain of AMPK Complex

α亞基是激酶活性亞基，主要由N端的激酶結(jié)構(gòu)域（kinase domain，KD）、自抑制結(jié)構(gòu)域（autoinhibitory domain，AID）、α連接體（α-linker）和C端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）組成。AID會抑制KD的激酶活性。在KD的C端α螺旋上存在Thr172位點(diǎn)（α1與α2相應(yīng)的位點(diǎn)不同，為方便描述，以下統(tǒng)一為α-Thr172），可被肝激酶B1（liver kinase B1，LKB1）、鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶激酶2（calcium/calmodulin dependent protein kinase kinase 2，CAMKK2）等上游激酶磷酸化，以解除AID對KD的抑制作用，進(jìn)而激活A(yù)MPK （Chen et al.，2009）。α-linker包含兩個調(diào)節(jié)性亞基相互作用基序（α-regulatory subunit interacting motif，α-RIM），即α-RIM1和α-RIM2，可與γ亞基相互作用。在人體實(shí)驗(yàn)中，AMPK α2的激活是運(yùn)動強(qiáng)度依賴性的，而AMPK α1不易被激活（Fujii et al.，2000；Wojtaszewski et al.，2000），提示含α2的AMPK復(fù)合物，而不是α1，參與骨骼肌對運(yùn)動的代謝反應(yīng)。然而后來研究發(fā)現(xiàn)，含α1的AMPK復(fù)合物也參與運(yùn)動的代謝反應(yīng)（Kjobsted et al.，2018），結(jié)果不一致的原因可能是運(yùn)動情境不同。因此，骨骼肌AMPK備有多種激活形態(tài)應(yīng)對運(yùn)動刺激，進(jìn)而介導(dǎo)不同的代謝反應(yīng)，這導(dǎo)致不同運(yùn)動情境在分子水平不具有可比性。

β亞基包括N端肉豆蔻酰化位點(diǎn)和糖原結(jié)合域（carbohydrate-binding module，CBM）。α-Thr172磷酸化在AMP、ADP與γ亞基的胱硫醚-β-合成酶（cystathionine-β-synthase，CBS）結(jié)構(gòu)域的1和3位點(diǎn)結(jié)合時增強(qiáng)，前提是N端第2位甘氨酸位點(diǎn)是肉豆蔻?；摹Ｒ坏│?Thr172磷酸化，AMP的直接激活和對不被去磷酸化的保護(hù)都不需要β亞基的肉豆蔻?；∣akhill et al.，2010，2011）。糖原通過與CBM結(jié)合以抑制AMPK活性。在α亞基KD和β亞基CBM之間存在一個獨(dú)特的口袋結(jié)構(gòu)域，是變構(gòu)藥物和代謝物（allosteric drug and metabolite，ADaM）位點(diǎn)，是AMPK與小分子激活劑（如A769662、長鏈脂酰輔酶A、991、水楊酸、PF-739、MT63-78、GSK621、MK-8722、SC4等）結(jié)合的主要位點(diǎn)（Trefts et al.，2021）。β-Ser108磷酸化誘導(dǎo)β亞基形成α-螺旋，與KD的C-螺旋相互作用，導(dǎo)致KD向穩(wěn)固的活性構(gòu)象轉(zhuǎn)變，防止α-Thr172去磷酸化，并增加底物親和力。β亞基還有幾個調(diào)節(jié)性磷酸化位點(diǎn)，與AMPK核定位（Ser24、Ser25）和催化活性（Ser182）有關(guān)（Calabrese et al.，2014）。因此，β亞基的變構(gòu)與磷酸化修飾讓AMPK的活性形態(tài)更加復(fù)雜。

γ亞基具有可變的N端和4個保守的CBS結(jié)構(gòu)域，其中γ2、γ3的N端比γ1更長。N端的差異調(diào)節(jié)γ亞基對化合物991的激活反應(yīng)，也能調(diào)節(jié)AMPK對其他激活劑的特異性反應(yīng)（Willows et al.，2017）。使得AMPK對不同激活劑可能有不同的激活程度，這在動物研究中難以準(zhǔn)確定量。AMPK通過CBS1、CBS3與AMP/ADP/ATP的競爭性結(jié)合，感知細(xì)胞能量狀態(tài)。CBS4以非交換方式結(jié)合AMP，CBS2缺乏關(guān)鍵的天冬氨酸殘基，不能結(jié)合AMP（Xiao et al.，2011）。由于AMP結(jié)合在γ亞基，而激酶結(jié)構(gòu)域位于α亞基，因此當(dāng)切換到激活狀態(tài)時，必須進(jìn)行亞基間通信。晶體結(jié)構(gòu)顯示，這種構(gòu)象開關(guān)由α亞基AID、α-linker與γ亞基上的可交換AMP結(jié)合位點(diǎn)相互作用而實(shí)現(xiàn)，為AMP變構(gòu)調(diào)節(jié)和α-Thr172磷酸化提供信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制（Hardie et al.，2016）。運(yùn)動時ATP水解生成AMP，γ亞基將能量代謝與AMPK激活及下游信號偶聯(lián)，AMP作為ATP水解的直接產(chǎn)物還兼任重要信號分子角色。

3 AMPK的激活機(jī)制及其蛋白結(jié)構(gòu)分析

AMPK的核心功能是對多種底物蛋白進(jìn)行磷酸化修飾。AMPK從非活性狀態(tài)過渡到能夠磷酸化底物的催化活性狀態(tài)，這一過程涉及多種激活機(jī)制，包括變構(gòu)調(diào)節(jié)、磷酸化調(diào)節(jié)、去磷酸化調(diào)節(jié)和氧化還原調(diào)節(jié)等。

3.1 變構(gòu)調(diào)節(jié)

變構(gòu)激活是AMPK最迅速的激活方式。AMP可直接激活A(yù)MPK（Oakhill et al.，2011）。在機(jī)體處于應(yīng)激或能量代謝緊張的情況下（如運(yùn)動），AMP/ATP和ADP/ATP比率增加，AMP與γ亞基CBS3位點(diǎn)結(jié)合，α-RIM1和α-RIM2的一些氨基酸分別與CBS2和CBS3形成穩(wěn)固的相互作用。一方面使得α-linker和AID在催化模塊（包含α-KD和β-CBM）和核苷酸結(jié)合模塊（包含α、β亞基的C端結(jié)構(gòu)域和γ亞基）之間形成柔性鉸鏈，保護(hù)α-Thr172不被去磷酸化；另一方面，導(dǎo)致α-linker將AID從KD的抑制性相互作用中拉開，從而導(dǎo)致AMPK的變構(gòu)激活（Hardie，2018）。當(dāng)ADP結(jié)合CBS3時，也會保護(hù)α-Thr172不被去磷酸化，因此，在某些情況下ADP可能也是AMPK激活信號。相反，當(dāng)ATP與CBS3位點(diǎn)結(jié)合時，α-linker與γ亞基解離，使AID旋轉(zhuǎn)回到KD后面的抑制位置，引起催化模塊和核苷酸結(jié)合模塊的分離，這導(dǎo)致蛋白磷酸酶可以靠近α-Thr172，并解除AMP、ADP對α-Thr172不被去磷酸化的保護(hù)作用（Ross et al.，2016）?？傊?，AMP、ATP對CBS3位點(diǎn)的爭奪并非單純的蛋白質(zhì)變構(gòu)調(diào)節(jié)，而是直接牽連α-Thr172磷酸化。

以前有研究認(rèn)為，AICAR作為AMP模擬劑能夠激活A(yù)MPK，并產(chǎn)生運(yùn)動激活A(yù)MPK的類似效應(yīng)（Fan et al.，2017）。但從結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析，外源性AMPK激活劑一般結(jié)合ADaM位點(diǎn)，與AMP的結(jié)合位點(diǎn)完全不同，很難體現(xiàn)運(yùn)動的“類似效應(yīng)”。如A-769662、水楊酸、MT47-100只對β1亞基的AMPK特異性激活，MK-8722、MSG011能激活所有12種可能的AMPK復(fù)合物。這些變構(gòu)激活劑誘導(dǎo)的強(qiáng)大AMPK信號并沒有伴隨α-Thr172磷酸化或AMP/ATP比值的變化。因此，運(yùn)動激活A(yù)MPK很難被激動劑模擬。鑒于大多數(shù)ADaM位點(diǎn)激活劑以類似的方式對接AMPK，很可能在結(jié)合位置的近端和遠(yuǎn)端，ADaM口袋周圍的結(jié)構(gòu)變化，有助于調(diào)節(jié)AMPK異構(gòu)體的特異性和效力。這并非完全是結(jié)構(gòu)生物學(xué)的預(yù)測。來自實(shí)驗(yàn)室的數(shù)據(jù)也表明，在MSG011及其類似物MSG012、MK-8722、PF-739的激活作用下，AMPK活性是連續(xù)遞增的，并在某個特定的濃度區(qū)間呈現(xiàn)指數(shù)級遞增（Ovens et al.，2022）。該研究提示，AMPK在變構(gòu)調(diào)節(jié)水平并非簡單的“開”和“關(guān)”，AMPK活性調(diào)節(jié)是一種連續(xù)態(tài)。在體內(nèi)環(huán)境下，很難對AMP濃度與AMPK活性進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測，所以這種連續(xù)性只能在體外實(shí)驗(yàn)中被觀測到。

然而，值得注意的是AMPK過度激活可能會導(dǎo)致疾病預(yù)后不良，如亨廷頓舞蹈病就是一種AMPK過度激活有關(guān)的神經(jīng)退行性疾?。℉ua et al.，2022）。目前可用的AMPK小分子抑制劑非常有限。其中，應(yīng)用最廣泛的化合物C是一種ATP競爭性抑制劑，與高度保守的活性位點(diǎn)結(jié)合，其選擇性較差。SBI-0206965作為一種直接的AMPK抑制劑，抑制效力是化合物C的40倍，激酶選擇性更高，但是沒有降低α-Thr172磷酸化水平，其與AMPK α2激酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的晶體結(jié)構(gòu)表明，該藥物占據(jù)了部分ADaM位點(diǎn)（Dite et al.，2018）。這些研究表明，α-Thr172磷酸化作為AMPK的活性標(biāo)記是不妥當(dāng)?shù)?，AMPK具有不依賴α-Thr172磷酸化的變構(gòu)激活方式，并且其活性調(diào)節(jié)范圍可能更廣。在體內(nèi)尤其在不同運(yùn)動情境中，是否有運(yùn)動產(chǎn)生的代謝物結(jié)合ADaM位點(diǎn)，目前并不清楚。但根據(jù)結(jié)構(gòu)生物學(xué)判斷，一旦有類似代謝物出現(xiàn)，AMPK的活性調(diào)節(jié)可能是一種連續(xù)態(tài)，并且不依賴α-Thr172磷酸化。這可以解釋為什么急性運(yùn)動能夠迅速激活A(yù)MPK。

3.2 磷酸化調(diào)節(jié)

磷酸化對酶活性的影響取決于被磷酸化的殘基。α-Thr172磷酸化被認(rèn)為是AMPK的關(guān)鍵調(diào)節(jié)位點(diǎn)，并且α1、α2亞基都包含這個位點(diǎn)，但AMPK上游激酶一直到2003年才被發(fā)現(xiàn)。LKB1在與小鼠蛋白25（mouse protein 25，MO25）和Ste20相關(guān)銜接蛋白（ste20-related adaptor protein，STRAD）結(jié)合后，通過磷酸化α-Thr172激活A(yù)MPK（Hawley et al.，2003），是肝臟和骨骼肌AMPK的主要上游激酶（Townsend et al.，2023）。在能量供應(yīng)緊張時，LKB1-Lys178的SUMO1修飾（指SUMO1蛋白與Lys共價結(jié)合）促進(jìn)LKB1對α-Thr172的磷酸化。LKB1的K178R突變使得AMPK信號和線粒體功能缺陷，最終導(dǎo)致能量剝奪、細(xì)胞死亡（Ritho et al.，2015）。此外，葡萄糖饑餓時溶酶體AMPK可被激活，這是因?yàn)槠咸烟撬较陆狄鸸?1，6-二磷酸（fructose-1，6-bisphosphate，F(xiàn)BP）下降，醛縮酶和囊泡型腺苷三磷酸酶（vacuolar-type adenosine triphosphatase，v-ATPase）之間的相互作用發(fā)生了改變；LKB1將AMPK結(jié)合配體Axis抑制蛋白（Axis inhibition protein，AXIN）募集到溶酶體，在溶酶體胞內(nèi)囊泡表面形成復(fù)合物，以不依賴AMP的方式激活A(yù)MPK。并且，醛縮酶感應(yīng)FBP濃度激活A(yù)MPK，比AMP/ATP激活通路閾值更低，靈敏度更高。如果細(xì)胞ATP供應(yīng)持續(xù)緊張，還會啟動AMP依賴的AMPK激活途徑（Zhang et al.，2017）。這些研究表明，LKB1作為上游激酶磷酸化α-Thr172以應(yīng)對能量應(yīng)激，并且AMPK激活不是簡單的“開”和“關(guān)”狀態(tài)，而是根據(jù)能量緊張狀態(tài)的多層次、連續(xù)性激活，至少包括AMP依賴型和非依賴型。

AMPK還有不依賴LKB1的α-Thr172磷酸化方式。CaMKK2也是AMPK上游激酶，能被胞內(nèi)鈣離子激活，從而磷酸化α-Thr172（Hawley et al.，2005），并在神經(jīng)組織中占主導(dǎo)地位。AMPK以鈣離子和CaMKK2依賴的方式在細(xì)胞核中被特異性激活（Vara-Ciruelos et al.，2018）。轉(zhuǎn)化生長因子-β激活激酶1（transforming growth factor-β-activated kinase 1，TAK1）在溶酶體受損時，也能夠磷酸化α-Thr172（Jia et al.，2020）。此外，混合連接激酶3（mixed lineage kinase 3，MLK3）和牛痘相關(guān)激酶1（vaccinia related kinase 1，VRK1）也可以磷酸化α-Thr172，但該實(shí)驗(yàn)結(jié)果是通過重組α亞基，而不是通過完整的AMPK異源三聚體觀測到的（Luo et al.，2015；Park et al.，2020）。這種α-Thr172磷酸化不代表AMPK激活，只能顯示α-Thr172連接了一個磷酸基團(tuán)。因此，MLK3和VRK1是否作為AMPK上游激酶需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

除了α-Thr172，還存在其他磷酸化位點(diǎn)調(diào)控AMPK活性。α1-Ser175/α2-Ser173、α1-Ser347/α2-Ser345、α1-Ser485/α2-Ser491可分別被蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）（Djouder et al.，2010）、周期蛋白依賴激酶4（cyclin-dependent kinase 4，CDK4）（Lopez-Mejia et al.，2017）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）（Valentine et al.，2014）磷酸化，進(jìn)而抑制AMPK活性。而α2-Ser377、β1/2-Ser108、γ1-Thr284可分別被mTORC1（Needham et al.，2022）、AMPK（Mitchelhill et al.，1997）、DNA依賴性蛋白激酶（DNA-dependent protein kinase，DNA-PK）（Puustinen et al.，2020）磷酸化，從而增強(qiáng)AMPK活性。其中，β1/2-Ser108可被AMPK自磷酸化，這表明AMPK復(fù)合物之間存在交互激活，以正反饋或鏈?zhǔn)椒磻?yīng)方式迅速增強(qiáng)AMPK的活性，這對急性運(yùn)動而言意義重大。但在以往的研究中沒有足夠關(guān)注。此外，體外研究還發(fā)現(xiàn)了α1-Ser178/α2-Ser176（Hornbeck et al.，2015）、β1-Ser101（Woods et al.，2003）、γ1-Ser261/Thr263（Dite et al.，2017；Loffler et al.，2011）這些磷酸化位點(diǎn)，其作用還不清楚?？傊?，AMPK磷酸化修飾的位點(diǎn)很多，對應(yīng)的上游激酶和刺激因子也不盡相同，導(dǎo)致AMPK的活性調(diào)節(jié)十分復(fù)雜。AMPK活性調(diào)節(jié)的復(fù)雜性使得AMPK有充足的應(yīng)答狀態(tài)應(yīng)對復(fù)雜的體外環(huán)境，這對于維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)十分重要。

3.3 去磷酸化調(diào)節(jié)

蛋白磷酸酶（protein phosphatase，PP）是一類以蛋白質(zhì)為底物使其去磷酸化的酶，與蛋白激酶的磷酸化作用剛好相反，二者共同調(diào)節(jié)和維持蛋白的磷酸化水平。已知的蛋白磷酸酶種類比蛋白激酶少，對底物選擇性也較低。AMPK的α-Thr172磷酸化可通過蛋白磷酸酶PP1、PP2A、PP2C、Ppm1E或PHLPP2脫磷酸而失活（Martin et al.，2010；Park et al.，2013； Yan et al.，2021）。這些蛋白磷酸酶并不僅僅靶向α-Thr172，許多其他磷酸化位點(diǎn)都是它們的作用對象。此外，在缺氧條件下，一種靶向脯氨酸-谷氨酸-絲氨酸-蘇氨酸基序的蛋白酪氨酸磷酸酶（protein tyrosine phosphatase with proline-glutamine- serine-threonine-rich motifs，PTP-PEST），通過α-Tyr436去磷酸化可以誘導(dǎo)α-RIM的構(gòu)象變化，解除AID的抑制作用。這能促進(jìn)上游激酶磷酸化α-Thr172以激活A(yù)MPK，從而使內(nèi)皮細(xì)胞自噬和血管生成增加（Chandel et al.，2021）。

3.4 氧化還原調(diào)節(jié)

活性氧（reactive oxygen species，ROS），特別是過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2），能夠可逆地氧化靶蛋白的半胱氨酸殘基（Cys）。氧化修飾可以控制許多酶和轉(zhuǎn)錄因子的生物活性，以及它們的細(xì)胞定位或與蛋白之間的相互作用（Lennicke et al.，2021）。AMPK也是ROS的靶蛋白之一，而且對氧化應(yīng)激高度敏感（Garcia et al.，2017）。ROS可以誘導(dǎo)AMP/ATP的增加間接激活A(yù)MPK，也可以通過直接的氧化修飾來調(diào)節(jié)AMPK活性（Choi et al.，2001）。在HEK293細(xì)胞和肺細(xì)胞中，H2O2可誘導(dǎo)α1-Cys299/Cys304的氧化和巰基SH-谷胱甘肽化，從而激活A(yù)MPK（Zmijewski et al.，2010）。但在心肌細(xì)胞中，H2O2誘導(dǎo)α2-Cys130/Cys174的氧化和分子間二硫鍵形成，造成AMPK聚集，阻止上游激酶對其磷酸化激活?？梢?，H2O2誘導(dǎo)Cys的氧化位點(diǎn)不同，對AMPK活性的調(diào)控也不同，這可以解釋以往許多研究中的矛盾（包括運(yùn)動情境），因?yàn)檫@些研究中沒有對Cys的氧化位點(diǎn)作深入分析。ROS對AMPK的調(diào)節(jié)取決于細(xì)胞的抗氧化能力，能量應(yīng)激誘導(dǎo)AMPK的Cys氧化和失活可被抗氧化酶硫氧還蛋白-1（thioredoxin-1，TRX1）的表達(dá)所逆轉(zhuǎn)（Shao et al.，2014）。

急性運(yùn)動誘導(dǎo)ROS產(chǎn)生而引發(fā)氧化應(yīng)激，與AMPK的激活幾乎是同步的（Trewin et al.，2018）。除了AMP和α-Thr172磷酸化，Cys氧化可能也是AMPK迅速激活的原因之一。長期訓(xùn)練適應(yīng)增強(qiáng)內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，導(dǎo)致AMPK的α-Cys不再容易受到H2O2的氧化（Bouviere et al.，2021； Steinbacher et al.，2015）。這可以解釋為什么長期訓(xùn)練后AMPK對急性運(yùn)動不再敏感。還有研究發(fā)現(xiàn)，適度運(yùn)動產(chǎn)生的ROS促進(jìn)肝臟AMPK谷胱甘肽化（氧化）的激活。然而，過度運(yùn)動使線粒體功能受損，增加氧化損傷，抑制AMPK的活性和表達(dá)。該研究提出，AMPK的激活結(jié)合氧化損傷的指標(biāo)，可以作為運(yùn)動干預(yù)時氧化還原狀態(tài)變化的“前哨”標(biāo)志物，用于判別適度和過度運(yùn)動（Wu et al.，2022）。從結(jié)構(gòu)生物學(xué)角度分析，適度和過度運(yùn)動的差別還可能體現(xiàn)在Cys氧化位點(diǎn)不同，及其對AMPK各亞基結(jié)構(gòu)域的影響。這些都有待進(jìn)一步研究。

總之，AMPK的激活態(tài)并非特指AMPK在某一位點(diǎn)修飾后的蛋白結(jié)構(gòu)，而是多個位點(diǎn)修飾的組合狀態(tài)。AMPK的活性調(diào)節(jié)總是與細(xì)胞能量應(yīng)激狀態(tài)對應(yīng)的。變構(gòu)調(diào)節(jié)發(fā)揮迅速的代謝響應(yīng)，Thr172位點(diǎn)與其他位點(diǎn)的磷酸化與去磷酸化調(diào)節(jié)、α-Cys的氧化還原調(diào)節(jié)等則維持AMPK處于適宜活性水平。變構(gòu)調(diào)節(jié)也會影響AMPK的磷酸化，這與AMPK的調(diào)節(jié)亞基與變構(gòu)劑的物理結(jié)合狀態(tài)有關(guān)。此外，AMPK的泛素化、SUMO化、乙酰化、甲基化等修飾也相繼被發(fā)現(xiàn)，與變構(gòu)調(diào)節(jié)可能疊加形成更加復(fù)雜和更有柔性的AMPK復(fù)合物，這是難以用簡單的激活態(tài)或失活態(tài)進(jìn)行描述的。

4 AMPK的運(yùn)動“鈍化”現(xiàn)象

運(yùn)動與AMPK的研究已經(jīng)積累很多。近來的觀點(diǎn)認(rèn)為，運(yùn)動誘導(dǎo)的各種組織和器官的適應(yīng)可以促進(jìn)健康和預(yù)防疾病，AMPK的激活在其中發(fā)揮關(guān)鍵作用。這些組織包括骨骼肌、心臟、肝臟、脂肪、大腦等。運(yùn)動和AMPK激活劑可以促進(jìn)分解代謝和細(xì)胞適應(yīng)，從而改善能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)（Spaulding et al.，2022）。然而，這一解釋在理論上依舊是抽象的，只是用新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)復(fù)述了以往的觀點(diǎn)——AMPK是核心代謝調(diào)節(jié)因子（Hardie，2004； Jorgensen et al.，2006），并且有傾向性強(qiáng)調(diào)AMPK激活的重要性?？v觀AMPK的研究，根據(jù)運(yùn)動情境不同，AMPK的活性調(diào)控存在以下3種結(jié)果：

1）急性運(yùn)動激活A(yù)MPK。一次中等強(qiáng)度運(yùn)動可以使肌肉能量失衡，游離AMP、AMP/ATP比值、AMPKα1、α2和上游激酶活性、ACC磷酸化、葡萄糖攝取均顯著增加；高強(qiáng)度運(yùn)動時除AMPKα1和上游激酶活性不再增加外，其余進(jìn)一步增加。運(yùn)動期間AMP的增加對AMPK起變構(gòu)作用，使上游激酶更容易磷酸化Thr172。AMPK活性依賴于運(yùn)動強(qiáng)度，與α1相比，α2對運(yùn)動的反應(yīng)更強(qiáng)烈（Chen et al.，2003）。此外，未經(jīng)訓(xùn)練的骨骼肌AMPKα2活性、α2-Thr172和ACC-Ser222磷酸化在一次中等強(qiáng)度耐力運(yùn)動后即刻顯著增加，在運(yùn)動后3 h、24 h都恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，而相應(yīng)蛋白的表達(dá)并沒有改變。表明一次急性耐力運(yùn)動會引起AMPK信號的短暫增加，但不足以誘導(dǎo)AMPK信號或蛋白表達(dá)的持續(xù)增加（Lee-Young et al.，2008）。很多類似研究都發(fā)現(xiàn)同樣的結(jié)果?？傊?，急性運(yùn)動引起的能量應(yīng)激狀態(tài)，都會以AMP為激活劑變構(gòu)激活A(yù)MPK，并且增加α-Thr172的磷酸化。AMPK的這種激活態(tài)屬于瞬時性爆發(fā)，其活性增加幅度較大。

2）長期訓(xùn)練提升安靜狀態(tài)AMPK活性。12周中等強(qiáng)度訓(xùn)練顯著增加安靜時骨骼肌、脂肪和肝臟AMPKα-Thr172和ACC Ser79的磷酸化、AMPKα1和α2的表達(dá)水平（Mortensen et al.，2013； Takekoshi et al.，2006）。在這里，ACC Ser79的磷酸化比α-Thr172的磷酸化更能體現(xiàn)AMPK的激活，因?yàn)锳CC Ser79是AMPK發(fā)揮激酶活性的重要位點(diǎn)。55周中等強(qiáng)度訓(xùn)練激活A(yù)MPK/PGC-1α信號通路，該研究把蛋白印跡實(shí)驗(yàn)的p-AMPK Thr172/ AMPK比值定義為AMPK激活（Liang et al.，2021）。類似研究很多，α-Thr172磷酸化經(jīng)常被作為AMPK激活的生物標(biāo)記，但生物組織都是在安靜狀態(tài)取材，細(xì)胞內(nèi)AMP濃度低、ATP充足，AMPK的激活態(tài)可能不是因AMP變構(gòu)激活，而是上游激酶和磷酸酶、氧化還原、SUMO化等多位點(diǎn)修飾的結(jié)果。

3）長期訓(xùn)練導(dǎo)致AMPK瞬時性激活減弱。與久坐者相比，耐力訓(xùn)練者骨骼肌在一次20 min 80% V˙O2max運(yùn)動后即刻AMPKα-Thr172 和ACC-Ser221磷酸化降低，同時AMP/ATP、乳酸和肌酸水平較低，肌糖原和磷酸肌酸水平較高，表明長期訓(xùn)練使骨骼肌ATP生成的能力提高，更好地維持了能荷狀態(tài)（Nielsen et al.，2003）。未經(jīng)訓(xùn)練者骨骼肌在一次2 h 65% V˙O2max運(yùn)動后即刻游離AMP、AMP/ATP、AMPKα1和α2活性、ACC-Ser221磷酸化均大幅度增加，經(jīng)過10天短期訓(xùn)練后再次進(jìn)行相同運(yùn)動，急性反應(yīng)明顯減弱，并且運(yùn)動后即刻這些指標(biāo)數(shù)值均低于訓(xùn)練前（Mcconell et al.，2005）。在12周長期訓(xùn)練后進(jìn)行一次1 h 65% V˙O2max的運(yùn)動，運(yùn)動后即刻骨骼肌游離AMP、AMP/ATP、AMPKα1/2、β2、γ1/γ3和ACC2蛋白水平、α-Thr172磷酸化水平、α1/α2β2γ1和總AMPK活性與安靜時相比均無明顯變化（Mortensen et al.，2013）。這些研究表明，長期運(yùn)動訓(xùn)練后工作肌肉保持能量穩(wěn)態(tài)的能力增強(qiáng)，顯著減弱了急性運(yùn)動對AMPK的影響。

因此，AMPK的不同激活形態(tài)可能來自不同的運(yùn)動情境以及取材時間。AMPK對運(yùn)動的響應(yīng)表現(xiàn)出明顯的鈍化現(xiàn)象。急性運(yùn)動通過AMP引起的變構(gòu)激活，因訓(xùn)練適應(yīng)會減弱。整合運(yùn)動生理學(xué)的觀點(diǎn)認(rèn)為，運(yùn)動是對全身內(nèi)穩(wěn)態(tài)的挑戰(zhàn)，引起大量細(xì)胞、組織和器官的廣泛擾動。為了應(yīng)對挑戰(zhàn)，多種反應(yīng)協(xié)調(diào)發(fā)生，以削弱由運(yùn)動引起的肌肉能量和氧氣需求增加所產(chǎn)生的內(nèi)穩(wěn)態(tài)威脅（Hawley et al.，2014）。既然AMPK能感受細(xì)胞能量狀態(tài)，那么出現(xiàn)運(yùn)動“鈍化”現(xiàn)象，也符合這一觀點(diǎn)。運(yùn)動適應(yīng)導(dǎo)致AMPK下游蛋白磷酸化響應(yīng)下降，減少運(yùn)動引起的系統(tǒng)紊亂，反映機(jī)體抗干擾能力提升。

5 AMPK多位點(diǎn)修飾與復(fù)雜生理環(huán)境

從AMPK的結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及激酶活性的調(diào)節(jié)來看，AMPK的激活不是簡單的有或無、開或關(guān)。AMP與γ亞基的結(jié)合、變構(gòu)劑與ADaM位點(diǎn)的結(jié)合、多位點(diǎn)的磷酸化和去磷酸化、α-Cys的氧化等修飾及其相互作用，讓AMPK呈現(xiàn)多種蛋白構(gòu)象。這些構(gòu)象對一些公認(rèn)的AMPK激活標(biāo)記物提出了挑戰(zhàn)。在以往研究中，多用Thr172的磷酸化作為AMPK的激活標(biāo)記，抗體也是圍繞Thr172的磷酸化進(jìn)行設(shè)計(jì)，這與AMPK活性調(diào)控的多位點(diǎn)是不相符的。也有研究把ACC Ser79磷酸化作為AMPK的激活標(biāo)記，這與AMPK底物廣泛、選擇性低也不相符。由于AMPK不同亞型具有不同的定位和下游靶標(biāo)，甚至不同的上游激酶，因此使用亞型特異性抗體和其他測定工具捕獲AMPK活性顯得尤為關(guān)鍵。不同類型的AMPK激活態(tài)與特定生理環(huán)境、病理狀態(tài)是相適應(yīng)的，表現(xiàn)為不同位點(diǎn)的磷酸化，并非AMPK一激活，所有位點(diǎn)同步磷酸化（Heidorn-Czarna et al.，2021；Jiang et al.，2021；Matzinger et al.，2020）。由于研究方法的限制，以往只能檢測少數(shù)幾個位點(diǎn)的修飾，并將其作為AMPK激酶活性的標(biāo)記。磷酸化蛋白組學(xué)可以更好展示，AMPK的激活是多位點(diǎn)修飾組合的結(jié)果（Sun et al.，2021）。表2以AMPKα亞基為例作了部分歸納。

表2 AMPKα亞基的多位點(diǎn)修飾與生理環(huán)境的對應(yīng)關(guān)系Table 2 Correspondence between Multi-site Modification of AMPK α Subunit and Physiological Environment

可以看出，在不同的運(yùn)動情境或藥物處理下，AMPK具有復(fù)雜的激活形式。進(jìn)一步表明，AMPK是細(xì)胞應(yīng)答所有環(huán)境刺激的通用調(diào)控因子，并非以往許多研究定義的運(yùn)動因子或運(yùn)動敏感基因。運(yùn)動情境只是環(huán)境刺激的一種特例。急性運(yùn)動、長期訓(xùn)練、長期訓(xùn)練后的急性運(yùn)動代表了以往研究中最常見的3種運(yùn)動情境，盡管都可以觀察到AMPK激活，甚至都以Thr172磷酸化為表現(xiàn)形式，但后續(xù)的生理效應(yīng)可能完全不同。近來一項(xiàng)研究對人體耐力、沖刺和抗阻運(yùn)動下的骨骼肌進(jìn)行磷酸化蛋白組學(xué)分析，確定了5 486個運(yùn)動調(diào)節(jié)的磷酸化位點(diǎn)，在這3種運(yùn)動方式中只有77個位點(diǎn)被共同磷酸化，其中包含AMPKα2-Ser377、Ser491兩個位點(diǎn)，表明這兩個位點(diǎn)可能是不同運(yùn)動的共同分子響應(yīng)。對不同類型運(yùn)動的磷酸化分析發(fā)現(xiàn)，在耐力運(yùn)動3 h后，只有一個細(xì)絲蛋白B（filamin b，F(xiàn)LNB）的Ser2454磷酸化位點(diǎn)有差異，這表明磷酸化蛋白組已經(jīng)完全恢復(fù)到運(yùn)動前基礎(chǔ)水平。這與沖刺和抗阻運(yùn)動形成鮮明對比，短跑和抗阻運(yùn)動3 h后，分別還有2 904和687個磷酸化位點(diǎn)有差異，這些位點(diǎn)分別對應(yīng)848和84個蛋白的修飾（Blazev et al.，2022）。由此可知，運(yùn)動激活A(yù)MPK只是起點(diǎn)事件，不同運(yùn)動方式之間磷酸化蛋白組學(xué)差異極大。后續(xù)的復(fù)雜場景遠(yuǎn)沒有被解釋，或者被簡單解釋了（如AMPK促進(jìn)脂肪氧化、葡萄糖攝取、線粒體代謝等）。

6 總結(jié)

綜合近幾十年的研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動與AMPK的研究已經(jīng)陷入解釋困境。急性運(yùn)動激活A(yù)MPK，長期訓(xùn)練AMPK激活則會出現(xiàn)“鈍化”現(xiàn)象，其復(fù)雜性與個體對運(yùn)動強(qiáng)度的反應(yīng)性有關(guān)。對健康而言，AMPK的基礎(chǔ)活性提高，有助于維持能量平衡和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，應(yīng)對體力活動不足以及能量攝入過剩的現(xiàn)實(shí)。運(yùn)動激活A(yù)MPK產(chǎn)生多器官的健康效應(yīng)，這一解釋都基于這一前提。對運(yùn)動能力而言，AMPK應(yīng)激活性提高，有助于細(xì)胞分解能源物質(zhì)合成ATP，但破壞了能量平衡和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)。過度的AMPK激活將導(dǎo)致細(xì)胞死亡、生理系統(tǒng)崩潰。因此，AMPK的運(yùn)動“鈍化”現(xiàn)象被認(rèn)為是機(jī)體的自我保護(hù)。這是對AMPK的另一種解釋范式。也就是說，無論在研究中觀測到AMPK激活還是失活，都可以參照AMPK激活的健康效應(yīng)和AMPK“鈍化”的保護(hù)效應(yīng)進(jìn)行解釋。如果不對AMPK進(jìn)行深入的蛋白結(jié)構(gòu)剖析，后續(xù)研究只能在這種解釋中盤繞。

基于AMPK的結(jié)構(gòu)生物學(xué)分析，有兩點(diǎn)值得運(yùn)動科學(xué)研究時借鑒：1）AMPK對蛋白底物的選擇性很低，具有結(jié)構(gòu)上的保守性。這決定AMPK一旦激活，將是對細(xì)胞乃至整個機(jī)體的系統(tǒng)性調(diào)控。AMPK激活的健康效應(yīng)和AMPK“鈍化”的保護(hù)效應(yīng)，這兩種解釋范式都是片面的，因?yàn)闆]有證據(jù)辨別Thr172磷酸化在運(yùn)動中是有益的，比如在亨廷頓舞蹈病中就是有害的。2）AMPK的多位點(diǎn)修飾決定了其蛋白復(fù)合物的結(jié)構(gòu)復(fù)雜性和蛋白質(zhì)表面的柔性。這表明AMPK作為蛋白激酶的功能和活性，不是簡單地進(jìn)行“開”和“關(guān)”，而是可以多層次連續(xù)性調(diào)節(jié)。磷酸化蛋白組學(xué)有助于更深入描述AMPK激活后細(xì)胞內(nèi)蛋白的磷酸化狀態(tài)，但對AMPK不同活性狀態(tài)的深度刻畫必須依賴結(jié)構(gòu)生物學(xué)解析。對AMPK的結(jié)構(gòu)生物學(xué)解析可以深入理解AMPK激酶調(diào)控及其下游信號的復(fù)雜性，進(jìn)一步揭示復(fù)雜生理環(huán)境下（包括運(yùn)動情境）AMPK多位點(diǎn)修飾對健康和運(yùn)動能力的不同意義。突破運(yùn)動與AMPK研究的解釋困境，更需要結(jié)構(gòu)生物學(xué)方法去深入解析AMPK的多位點(diǎn)修飾，探討AMPK在運(yùn)動情境中可能存在的多種活性形態(tài)或中間狀態(tài)。