甘全喜，李曉勇，范銀燕

膽堿能和多巴胺能系統(tǒng)之間失衡是精神分裂癥病理生理學(xué)假說之一[1,2]。研究表明，煙堿型乙酰膽堿受體（nicotinic acetylcholine receptor，nAChR）（尤其是α7亞型）功能障礙與精神分裂癥感覺運(yùn)動(dòng)缺陷相關(guān)[1]。α7 nAChR激動(dòng)劑（如A-582941）不僅可改善精神分裂癥認(rèn)知缺陷，還可逆轉(zhuǎn)γ-氨基丁酸能缺陷，如降低大鼠腦組織中小清蛋白和谷氨酸脫羧酶的表達(dá)[3,4]。增強(qiáng)腦組織中α7 nAChR的功能可能是治療精神分裂癥的潛在方案。但α7 nAChR激動(dòng)劑常在低劑量時(shí)療效低，在高劑量時(shí)迅速脫敏，存在“倒U”型的量效曲線[4]，而α7 nAChR的正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以克服激動(dòng)劑快速脫敏這一不利條件[5]。正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與受體結(jié)合時(shí)不會(huì)誘導(dǎo)下一步反應(yīng)，但會(huì)增強(qiáng)α7 nAChR天然和外源激動(dòng)劑的作用[6]。α7 nAChR激動(dòng)劑通過正構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)其作用，而正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑通過受體的變構(gòu)結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)其作用[7]。但α7 nAChR的激動(dòng)劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)精神分裂癥社會(huì)行為缺陷的影響的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制還尚未徹底闡明。因此，本研究建立慢性精神分裂癥大鼠模型，探討α7 nAChR激動(dòng)劑、Ⅰ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑、Ⅱ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和非典型抗精神病藥物對(duì)大鼠社會(huì)行為的影響及其潛在的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

雄性SD大鼠48只購自湖北省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，8～12周齡，體質(zhì)量180～250 g，標(biāo)準(zhǔn)條件飼養(yǎng)。MK-801購自美國Sigma公司；α7 nAChR激動(dòng)劑A-582941購自美國Adooq公司；CCMI（Ⅰ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑）、PNU-120596（Ⅱ型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑）、氯氮平（非典型抗精神病藥物）和二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）均購自美國MedChemExpress公司。BCA蛋白定量試劑盒、ELISA試劑盒購自武漢默沙克生物科技有限公司。兔抗鼠α7 nAChR、磷酸二酯酶（phosphodiesterase，PDE）4A和PDE4D一抗購于美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模 所有大鼠隨機(jī)分為：對(duì)照組，模型組（MK-801+DMSO），激動(dòng)劑組（MK-801+A-582941），Ⅰ型變構(gòu)組（MK-801+CCMI），Ⅱ型變構(gòu) 組（MK-801+PNU-120596），藥 物 治 療 組（MK-801+氯氮平）；每組8只。后5組大鼠腹腔注射MK-801（0.2 mg/kg），2次/d（8∶00和20∶00），連續(xù)7 d[8]；對(duì)照組在同一時(shí)間點(diǎn)注射相同體積的生理鹽水。7 d洗脫期后，對(duì)照組和模型組腹腔注射等體積10%DMSO，激動(dòng)劑組腹腔注射1 mg/kg A-582941，Ⅰ型變構(gòu)組腹腔注射1 mg/kg CCMI，Ⅱ型變構(gòu)組腹腔注射3 mg/kg PNU-120596，藥物治療組腹腔注射5 mg/kg氯氮平；1次/d，連續(xù)10 d。

1.2.2 社會(huì)行為測試 在黑色有機(jī)玻璃盒（50 cm×50 cm×30 cm）、半光條件下進(jìn)行。第1天為適應(yīng)期，第2天為測試期。測試方法：將待測鼠A和不熟悉的健康鼠B放到同一個(gè)小室中，自由度過10 min，記錄每只待測鼠的跟隨、回避和嗅探行為的時(shí)間。每只大鼠的總交互作用：跟隨行為時(shí)間+嗅探行為時(shí)間-回避行為時(shí)間。由2位實(shí)驗(yàn)者根據(jù)視頻記錄進(jìn)行評(píng)分，持續(xù)3 d，取2者3次的平均分為最后的數(shù)據(jù)。

1.2.3 指標(biāo)檢測 社會(huì)行為測試結(jié)束后，麻醉處死大鼠取腦，在冰上分離前額葉皮質(zhì)和海馬組織。ELISA試劑盒檢測各組前額葉皮質(zhì)和海馬組織中環(huán)磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平。采用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液中的總蛋白，取20μg定量后的總蛋白，SDS-PAGE凝膠分離總蛋白，3%BSA封閉45 min；加入α7 nAChR、PDE4A和PDE4D一抗（1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜；TBST洗3次，加入二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗3次；化學(xué)發(fā)光。Image J軟件統(tǒng)計(jì)處理?xiàng)l帶，GAPDH為內(nèi)參。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠社會(huì)行為比較

與對(duì)照組比較，模型組跟隨行為和總交互作用時(shí)間顯著降低（P＜0.05），回避行為時(shí)間顯著增加（P＜0.05）；Ⅰ型變構(gòu)組總交互作用時(shí)間顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動(dòng)劑組跟隨行為和總交互作用時(shí)間顯著增加（P＜0.05），回避行為時(shí)間顯著降低（P＜0.05）；Ⅰ型變構(gòu)組、Ⅱ型變構(gòu)組和藥物治療組的回避行為時(shí)間顯著降低（P＜0.05），而跟隨行為和總交互作用時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；各組間嗅探行為時(shí)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組大鼠社會(huì)行為比較（s,±s）

表1 各組大鼠社會(huì)行為比較（s,±s）

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

組別對(duì)照組模型組激動(dòng)劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8跟隨行為4.52±0.23 2.01±0.16①5.49±0.21②1.97±0.11 3.05±0.18 3.40±0.15回避行為1.34±0.05 3.21±0.09①1.75±0.06②0.87±0.05②1.68±0.10②1.22±0.08②嗅探行為28.39±3.71 21.43±5.25 32.50±6.18 18.62±4.02 27.95±4.68 25.33±5.01總交互作用31.57±4.56 21.21±3.19①36.26±5.36②19.70±3.57①29.31±3.03 27.53±3.41

2.2 各組大鼠α7 nAChR蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組前額葉皮質(zhì)和海馬組織中α7 nAChR蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動(dòng)劑組、Ⅰ型變構(gòu)組、Ⅱ型變構(gòu)組和藥物治療組前額葉皮質(zhì)和海馬組織中α7 nAChR蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），見表2。

表2 各組大鼠α7 nAChR蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠α7 nAChR蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

組別對(duì)照組模型組激動(dòng)劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8前額葉皮質(zhì)1.58±0.27 0.72±0.14①1.16±0.19②1.67±0.23②1.59±0.20②1.19±0.12②海馬0.52±0.09 0.23±0.04①0.47±0.10②0.59±0.06②0.50±0.08②0.40±0.09②

2.3 各組大鼠cAMP水平比較

與對(duì)照組比較，模型組前額葉皮質(zhì)cAMP水平顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動(dòng)劑組、Ⅰ型變構(gòu)組、Ⅱ型變構(gòu)組和藥物治療組前額葉皮質(zhì)cAMP水平顯著增加（P＜0.05）；各組間大鼠海馬組織中cAMP水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 各組大鼠cAMP水平比較（pmol/mL,±s）

表3 各組大鼠cAMP水平比較（pmol/mL,±s）

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

分組對(duì)照組模型組激動(dòng)劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8前額葉皮質(zhì)13.06±2.49 7.43±1.51①12.95±2.07②13.40±2.13②12.71±2.84②12.88±1.97②海馬13.81±3.05 13.89±2.64 13.28±3.19 12.67±2.50 12.53±2.72 12.29±2.38

2.4 各組大鼠PDE4A和PDE4D蛋白表達(dá)比較

與對(duì)照組比較，模型組前額葉皮質(zhì)中PDE4A和PDE4D蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）；Ⅰ型變構(gòu)組額葉皮質(zhì)和海馬中的PDE4A顯著降低（P＜0.05）。與模型組比較，激動(dòng)劑組、Ⅰ型變構(gòu)組和藥物治療組前額葉皮質(zhì)中PDE4A和PDE4D蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），Ⅱ型變構(gòu)組前額葉皮質(zhì)僅PDE4D蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。其余各組間海馬組織中PDE4A和PDE4D蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表4。

表4 各組大鼠PDE4A和PDE4D蛋白表達(dá)比較（±s）

表4 各組大鼠PDE4A和PDE4D蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與對(duì)照組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05

分組對(duì)照組模型組激動(dòng)劑組Ⅰ型變構(gòu)組Ⅱ型變構(gòu)組藥物治療組只數(shù)8 8 8 8 8 8前額葉皮質(zhì)PDE4A 0.38±0.08 0.96±0.13①0.51±0.11②0.16±0.04①②0.20±0.06 0.29±0.06②PDE4D 0.40±0.14 0.89±0.20①0.42±0.12②0.25±0.09②0.36±0.10②0.57±0.13②海馬PDE4A 0.31±0.12 0.29±0.08 0.27±0.07 0.11±0.05①②0.27±0.11 0.36±0.15 PDE4D 0.27±0.10 0.35±0.14 0.29±0.09 0.23±0.06 0.26±0.05 0.28±0.08

3 討論

精神分裂癥是一種嚴(yán)重的精神疾病，其癥狀主要分為3類：陽性（妄想等）、陰性（缺乏社交和動(dòng)機(jī)等）和認(rèn)知（學(xué)習(xí)和注意缺陷）癥狀。目前主要采用的典型和非典型抗精神病藥物治療精神分裂癥[9]。但研究發(fā)現(xiàn)，非典型藥物在治療陰性和認(rèn)知癥狀方面效果不如典型抗精神病藥物[10]，患者還可能出現(xiàn)粒細(xì)胞缺乏癥和代謝綜合癥等副作用。而長期使用典型抗精神病藥也會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的錐體外系副作用。因此，探尋治療精神分裂癥的新方法及新藥物對(duì)治療極具價(jià)值。

精神分裂癥的病理生理學(xué)假說中被廣泛接受的是谷氨酸能亢進(jìn)假說。皮質(zhì)腦干途徑中的谷氨酸能N-甲基-D-天冬氨酸受體（N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDAR）功能降低會(huì)導(dǎo)致精神分裂癥癥狀[9]。NMDAR拮抗劑（如MK-801）可導(dǎo)致嚙齒動(dòng)物的精神分裂癥樣行為和神經(jīng)生物學(xué)變化[11]。本研究采用MK-801建立慢性精神分裂癥大鼠模型，結(jié)果顯示，MK-801可有效降低大鼠的跟隨行為和總交互作用，增加大鼠的回避行為，大鼠出現(xiàn)社會(huì)交互行為缺陷，即神經(jīng)分裂癥樣行為缺陷。

α7 nAChR功能障礙與精神分裂癥行為缺陷密切相關(guān)[1,2]。α7 nAChR激動(dòng)劑是治療精神分裂癥的新穎且有前途的藥物[12]，但臨床療效仍不確定。另一種改善α7 nAChR功能的方法是其正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，其似乎也是治療精神分裂癥的有潛力的新方法。本研究表明，激動(dòng)劑在改善精神分裂癥大鼠社交行為缺陷方面比正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑更有優(yōu)勢。這種差異不是很容易解釋，已知激動(dòng)劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的主要區(qū)別之一是單獨(dú)的激動(dòng)劑可以在受體上產(chǎn)生應(yīng)答，而正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑僅可以增加激動(dòng)劑的現(xiàn)有應(yīng)答[6,7]。另外，α7 nAChR激動(dòng)劑可引起突觸前神經(jīng)元釋放內(nèi)源性乙酰膽堿[4]。盡管本研究尚未研究與社會(huì)行為相關(guān)的大腦組織中乙酰膽堿（nAChR天然激動(dòng)劑）的水平，但我們的數(shù)據(jù)顯示，單獨(dú)使用正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑時(shí)，由于內(nèi)源性激動(dòng)劑的缺乏，導(dǎo)致正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的療效受限，而外源性激動(dòng)劑可能更好地彌補(bǔ)了內(nèi)源性激動(dòng)劑數(shù)量減少的這種情況。

目前關(guān)于α7 nAChR激動(dòng)劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)胞內(nèi)第二信使系統(tǒng)（如腦中的cAMP系統(tǒng)）功效的了解有限?；诖?，本研究主要闡明它們是否能夠克服MK-801對(duì)細(xì)胞內(nèi)主要運(yùn)輸途徑（包括cAMP及其上游調(diào)節(jié)劑PDE4A和PDE4D途徑）的損傷作用。研究表明，PNU-120596可增加參與學(xué)習(xí)與記憶相關(guān)的cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）的磷酸化[16]。本研究結(jié)果顯示，MK801可顯著增加前額葉皮質(zhì)中PDE4A和PDE4D的表達(dá)，這被α7nAChR激動(dòng)劑、正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和氯氮平所逆轉(zhuǎn)。但是，這些影響在海馬中并未出現(xiàn)（除了CCMI）。MK-801也可顯著降低前額葉皮質(zhì)中cAMP水平，而在海馬中則沒有變化。此外，MK-801誘導(dǎo)海馬和前額葉皮質(zhì)中α7 nAChR蛋白表達(dá)下調(diào)，而α7nAChR激動(dòng)劑、正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和氯氮平均可逆轉(zhuǎn)增加海馬和前額葉皮質(zhì)中α7 nAChR的蛋白表達(dá)。報(bào)道已表明，α7 nAChR激動(dòng)劑而非正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可誘導(dǎo)細(xì)胞中的受體表達(dá)上調(diào)[17]。原因可能為細(xì)胞對(duì)陰陽離子平衡的一種保護(hù)作用，α7 nAChR激動(dòng)劑由于阻止了過多的正離子進(jìn)入細(xì)胞而引起受體快速脫敏，但細(xì)胞可能需要招募更多新的受體來進(jìn)行下一次生理刺激，因此導(dǎo)致α7 nAChR上調(diào)。而正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑不會(huì)引起受體上調(diào)，是因?yàn)樗鼈冊谏砬闆r下不會(huì)使α7 nAChR脫敏[18]。已有研究顯示I型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑不抑制激動(dòng)劑誘導(dǎo)的受體上調(diào)，因?yàn)槠鋵?duì)脫敏動(dòng)力學(xué)沒有影響；而II型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑抑制它，是因?yàn)槠淇墒功?7 nAChR重新敏化并且不需要再上調(diào)受體表達(dá)[17]。在本研究中，腦中α7 nAChR表達(dá)的結(jié)果與先前報(bào)道不同。本研究中，MK-801給藥的大鼠，激動(dòng)劑、正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑和氯氮平均對(duì)α7 nAChR有上調(diào)作用，這可能是它們對(duì)MK-801誘導(dǎo)的腦損傷的逆轉(zhuǎn)作用。

本研究還有不足之處，I型與II型正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑是否在體內(nèi)的功效、安全性和耐受性等方面有差異，正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑在體內(nèi)是否還具有其他優(yōu)勢，都需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。但本研究結(jié)果提示α7 nAChR在精神分裂癥的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制可能與cAMP/PDE4通路有一定的關(guān)系，值得繼續(xù)研究。

綜上所述，α7 nAChR激動(dòng)劑和正變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對(duì)精神分裂癥樣的社會(huì)缺陷有一定的改善作用，其分子機(jī)制可能與PDE-4/cAMP通路有一定的關(guān)，確切的結(jié)論尚需進(jìn)一步研究。