張健

（上海交通大學醫(yī)學院，上海 200025）

變構(gòu)效應（allosteric effect）是一種精確調(diào)節(jié)生物大分子功能的機制，指大部分為蛋白質(zhì)的生物大分子在遠離底物位點或功能位點的其他區(qū)域存在變構(gòu)位點，這些位點通過傳遞配體結(jié)合等作用來造成大分子活性改變的過程。從20世紀初對血紅蛋白的玻爾效應研究開始，到上世紀60年代由Monod和Jacob教授首次提出變構(gòu)效應這一概念，再到目前美國FDA批準的多個變構(gòu)藥物上市，變構(gòu)效應及其在藥物設計中的應用正越來越得到研究者的關(guān)注，變構(gòu)效應更是被稱為“生命的第二秘密”。

變構(gòu)藥物設計的核心在于發(fā)現(xiàn)變構(gòu)位點與合理設計變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，從而通過間接的方式調(diào)節(jié)靶標蛋白活性。相比于靶向蛋白功能位點的正構(gòu)藥物來說，變構(gòu)藥物具有一系列天然優(yōu)勢：其一，變構(gòu)位點理論上可以位于蛋白表面的任何位置，比起長期進化選擇后的蛋白功能位點，變構(gòu)位點保守性更低，從而變構(gòu)調(diào)節(jié)劑具有更好的亞型選擇性和更低的副作用，具有臨床應用價值；其二，當?shù)孜锖湍繕说鞍捉Y(jié)合能力較強或者涉及口袋平坦寬大的蛋白-蛋白相互作用時，很難開發(fā)直接靶向底物位點的藥物分子，而變構(gòu)調(diào)節(jié)劑因并不直接結(jié)合在底物位點，此時依然可以調(diào)控蛋白活性；其三，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑可以和正構(gòu)位點的分子共同作用，對蛋白活性進行更加精細和復雜的調(diào)節(jié)，在精準醫(yī)學領域具有應用可能；其四，由于變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對特定構(gòu)象的結(jié)合，只有在正構(gòu)小分子存在時，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑才會對蛋白活性進行調(diào)節(jié)，這不僅進一步減少了副作用，也有利于組織特異性給藥途徑的探索。近10年來，變構(gòu)小分子數(shù)量的激增也證明了變構(gòu)效應在藥物設計領域受到極大重視。

基于Sirtuin 6（SIRT6）的變構(gòu)激動劑設計是合理變構(gòu)藥物設計的一個典型范例。SIRT6是一種組氨酸去乙?；?，其功能是將乙?；嚢彼醾?cè)鏈的乙?；D(zhuǎn)移到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）上，在抗炎、DNA衰老修復和腫瘤控制中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6過表達的小鼠明顯更加長壽，且癌細胞更快凋亡，而對正常細胞沒有影響。因此，SIRT6激動劑的發(fā)現(xiàn)可能具有重要的臨床意義。然而，傳統(tǒng)靶向正構(gòu)位點的藥物設計策略很難達到激動效果。針對酶激動的難靶問題，變構(gòu)方法則可以大顯身手。筆者課題組采用自主開發(fā)的Allosite變構(gòu)位點識別方法，預測了潛在的SIRT6正構(gòu)位點背側(cè)的變構(gòu)位點。在虛擬篩選超過500萬個化合物后，基于變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的打分原則和實驗驗證，成功獲得了EC50在200 μmol· L-1左右的2個化合物，并通過基于結(jié)構(gòu)的藥物設計方法將EC50優(yōu)化到5 μmol· L-1。小分子和SIRT6蛋白的共晶表明，Allosite有效識別了具有激動活性的變構(gòu)位點，細胞和動物模型實驗也驗證了激動劑的抗肝癌效果。這項研究不僅為靶向SIRT6蛋白的藥物設計提供了良好的先導化合物，促進了對其機制的研究，也為其他酶激動劑的變構(gòu)設計提供了成功范例。

變構(gòu)藥物設計因其巨大價值在引起世界各國科研機構(gòu)和藥物研發(fā)公司重視的同時，也面臨著諸多挑戰(zhàn)，主要包括以下幾點：1）有價值的變構(gòu)位點發(fā)現(xiàn)困難。正構(gòu)配體通常結(jié)合在明顯而保守的正構(gòu)位點，而理論上，除了正構(gòu)位點之外的任何位置都可能成為變構(gòu)位點，這造成了變構(gòu)位點確定的困難，同時也難以測定變構(gòu)位點與正構(gòu)位點間的作用偶聯(lián)。2）變構(gòu)耐藥突變?nèi)菀装l(fā)生。由于變構(gòu)位點進化壓力小，變構(gòu)位點更容易發(fā)生突變，從而造成變構(gòu)調(diào)節(jié)劑失效，另外由于變構(gòu)效應涉及蛋白內(nèi)信號通路，通路上的突變也會造成變構(gòu)效應的變化。3）變構(gòu)效應具有種屬特異性。對人源蛋白有效的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對于鼠源蛋白可能就會失效，這對于藥物設計的實驗檢驗步驟較為不利。4）變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與蛋白的共晶復合物不易獲得。通常變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與蛋白結(jié)合力不如正構(gòu)調(diào)節(jié)劑，構(gòu)效關(guān)系不易追溯，同時具有較低的水溶性，因此難以獲得調(diào)節(jié)劑-蛋白共晶結(jié)構(gòu)，從而影響了臨床實驗的進行。

作為生命科學、醫(yī)學和化學的交叉領域，變構(gòu)藥物設計在目前投入大、風險高的新藥發(fā)現(xiàn)領域是一個不可忽視的新方向。近年來，在綜合運用實驗手段和計算機輔助藥物設計方法的基礎上，變構(gòu)領域的方法學研究已取得了一系列進展，對變構(gòu)藥物設計的蓬勃發(fā)展起到了助推作用。在變構(gòu)數(shù)據(jù)庫方面，AlloSteric Database（ASD）和ASBench等高質(zhì)量數(shù)據(jù)資源對位點預測起到了重要作用；在變構(gòu)位點發(fā)現(xiàn)方面，Allosite、Corrsite、PARS等方法從變構(gòu)位點的不同性質(zhì)出發(fā)進行預測，為研究者們尋找變構(gòu)位點提供了極大的便利；在變構(gòu)信號傳遞和突變分析方面，AlloDriver、AlloSigMA、MCPath等方法對變構(gòu)效應的機制探究做出了一定的貢獻，也促進了變構(gòu)先導化合物的優(yōu)化；在變構(gòu)調(diào)節(jié)劑打分和預測方面，Alloscore可用于結(jié)合活性預測，AlloFinder和CovCys等可用于自動化變構(gòu)分子探測，均已經(jīng)在變構(gòu)藥物設計領域有所建樹。從實驗角度出發(fā)，X射線衍射和冷凍電鏡技術(shù)的發(fā)展提供了更多可用于變構(gòu)藥物設計的生物大分子結(jié)構(gòu)，核磁共振波譜法也對于變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的機制研究和輔助結(jié)構(gòu)測定有著很大幫助。近年來，雙電子-電子共振光譜法、氫氘交換質(zhì)譜法等方法的發(fā)展也在變構(gòu)效應驗證和探索中發(fā)揮了作用?；谧儤?gòu)研究方法快速發(fā)展，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑發(fā)現(xiàn)逐漸規(guī)范化、流程化的事實，變構(gòu)藥物已經(jīng)從偶然發(fā)現(xiàn)進入到基于結(jié)構(gòu)的合理藥物設計這一階段。

隨著變構(gòu)藥物設計進入新階段，一些曾經(jīng)難成藥的蛋白已經(jīng)陸續(xù)有了靶向性的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，我國科研人員在變構(gòu)效應開發(fā)方面也有了初步的成效。以蛋白酪氨酸激酶SHP2變構(gòu)抑制劑設計為例，研究者沒有選擇難以靶向的高度保守且?guī)д姷拇呋稽c進行藥物設計，而是基于變構(gòu)位點，試圖通過變構(gòu)抑制劑將蛋白穩(wěn)定在自抑制構(gòu)象來發(fā)揮抗腫瘤效果。研究者首先針對常見致病突變E76A進行了20 000個化合物的生化篩選，獲得了對E76A突變體特異性有效，但對正常SHP2無效的化合物，并通過構(gòu)效關(guān)系進一步優(yōu)化，獲得了優(yōu)化后的化合物和蛋白的共晶結(jié)構(gòu)。從結(jié)構(gòu)提示的重要相互作用出發(fā)，研究者進一步優(yōu)化了小分子調(diào)節(jié)劑，將其IC50控制在0.7 μmol· L-1，選擇性提高到了30倍左右。最終的化合物在分子水平能夠抑制下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等過程，在細胞水平也能發(fā)揮廣譜的抗癌作用。該SHP2的變構(gòu)抑制劑對于開發(fā)新的癌癥療法有所裨益。近期，新發(fā)現(xiàn)的針對磷酸甘油酸變位酶1（PGAM1）的變構(gòu)抑制劑對非小細胞肺癌的控制效果也值得關(guān)注。以之前變構(gòu)抑制劑的共晶結(jié)構(gòu)為基礎，研究者通過調(diào)節(jié)磺酰胺的位置，控制了抑制劑和底物的競爭作用，最后成功開發(fā)了HKB99作為PGAM1的抑制劑。該抑制劑不僅可以負向調(diào)控3-磷酸甘油酸向2-磷酸甘油酸的轉(zhuǎn)化，抑制腫瘤代謝和溫伯格效應，也可以削弱PGAM1和α-平滑肌肌動蛋白的相互作用，從而抑制癌細胞生長和轉(zhuǎn)移，還可以通過活性氧依賴的c-Jun氨基末端激酶（JNK/c-Jun）信號通路引發(fā)癌細胞凋亡?？傮w上高效控制了非小細胞肺癌的生長和轉(zhuǎn)移，對未來變構(gòu)藥物設計也提供了一定參考。在變構(gòu)激動劑方面，α7型尼古丁乙酰膽堿受體（α7nAChR）的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑開發(fā)可以提供較好的范例。α7nAChR的激動有利于諸如精神分裂癥、阿爾茨海默病等神經(jīng)精神疾病的控制，由于神經(jīng)系統(tǒng)中有多個該蛋白的其他亞型，設計高選擇性的變構(gòu)激動劑的需求度很高。從已知2-乙基硫烷基-5-氨基噻唑結(jié)構(gòu)出發(fā)，研究者首先合成了一個小的化合物庫，并篩選其激動活性，對激動活性較好的化合物做不同修飾，之后基于構(gòu)效關(guān)系進一步優(yōu)化結(jié)合效力和選擇性最好的一類化合物。最終成功設計了化合物JWX-A1223a作為α7nAChR的選擇性激動劑，同時揭示N6-（2-氯-6-甲基）-苯基是重要的活性基團，為之后的藥物設計鋪平了道路?？偟膩碚f，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑設計可以在腫瘤控制、神經(jīng)疾病治療等方面提供新策略，而合理變構(gòu)藥物設計是推動這部分研究不可或缺的力量。

總之，經(jīng)過百余年的發(fā)展，變構(gòu)調(diào)節(jié)劑發(fā)現(xiàn)從“霧里看花”的隨機猜測和偶然發(fā)現(xiàn)，逐漸進入了基于結(jié)構(gòu)的合理設計這一階段。借助日新月異的實驗方法和計算手段，研究人員已經(jīng)逐漸掌握了變構(gòu)效應的有關(guān)規(guī)律。作為藥物設計領域的一片藍海，變構(gòu)效應必將吸引更多的科研工作者，最終將為人類健康事業(yè)做出應有的貢獻。