韓 拓 周 靜 李 盈 徐 陽 李 成 姬 婧 張春艷 李永勤 張 巖△ 王聰霞

1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 (陜西 西安,71004) 2.延安大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科 3.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)已經(jīng)成為全球最為常見的慢性肝臟疾病之一,據(jù)統(tǒng)計(jì),全球約25%的成年人患有NAFLD[1]。肥胖、2型糖尿病是NAFLD發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素[2]。有研究表明,55%～70%的2型糖尿病(T2DM)患者中合并有NAFLD,37.3%已出現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎(NASH)[3]。闡明T2DM與NAFLD之間的共同發(fā)病機(jī)制有賴于穩(wěn)定且高效的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。然而,目前多數(shù)研究經(jīng)常使用的動(dòng)物模型雖在一定程度上能夠模擬T2DM患者肝臟病理改變,但都存在不足之處[4]。此外,T2DM和NAFLD都屬于增齡性疾病,而現(xiàn)有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)很少有在老齡鼠中開展。本研究利用C57BL/6J老齡小鼠,通過高脂飲食(HFD)聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立T2DM合并NAFLD的老齡小鼠模型,為今后相關(guān)研究提供更理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 高脂飼料(購(gòu)自廣州睿迪生物公司,貨號(hào)#D12492,含60%的脂肪),鏈脲佐菌素(購(gòu)自Sigma公司,貨號(hào)#S0130),油紅O粉末(購(gòu)自Sigma公司,貨號(hào)#O0625),蘇木素-伊紅染液(購(gòu)自陜西中暉赫彩有限公司),總膽固醇與三酰甘油測(cè)定試劑盒(購(gòu)自中生北控生物科技公司),BCA蛋白定量試劑盒(購(gòu)自碧云天生物公司)。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 全自動(dòng)血液生化分析儀(貝克曼公司,型號(hào)#AU5800),電子分析天平(奧豪斯儀器有限公司,型號(hào)#CP224C),臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(貝克曼公司,型號(hào)#Microfuge 20R),輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡公司,型號(hào)#HistoCore MULTICULT),正置顯微鏡成像系統(tǒng)(德國(guó)萊卡公司,型號(hào)#DM2000LED)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與造模方案 18周齡C57BL/6J雄性小鼠共16只購(gòu)自西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SYXK(陜) 2018-001),飼養(yǎng)于清潔級(jí)環(huán)境,室內(nèi)溫度(22±2)℃,自由飲食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后,隨機(jī)分為模型組與對(duì)照組(n=8只/組)。模型組小鼠全程給予高脂飼料(HFD)喂養(yǎng),對(duì)照組小鼠給予普通飼料。自第3周開始,模型組小鼠連續(xù)5 d腹腔注射50 mg/kg的鏈脲佐菌素(STZ,注射前過夜禁食14 h),對(duì)照組給予等體積檸檬酸/檸檬酸鈉溶液腹腔注射。注射結(jié)束后3 d和1 w后分別于尾尖采血測(cè)禁食4～5 h后的血糖水平,血糖超過11.0 mmol/L表明糖尿病造模成功。期間模型組先后有3只小鼠死亡,對(duì)照組無小鼠死亡。每周監(jiān)測(cè)體重,繼續(xù)飼喂至第6 w造模結(jié)束,腹腔麻醉、眼球采血,分離心臟、肝臟及腎臟,進(jìn)行血漿生化與組織病理檢測(cè)。

1.4 血漿生化檢測(cè) 小鼠摘眼球取血,EDTA抗凝后4℃、3 000 r/min離心15 min,收集上層血漿。采用全自動(dòng)血液生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血漿谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、血肌酐、尿素氮、胱抑素C,以及血漿葡萄糖、總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇水平。

1.6 H&E組織病理染色 肝、心、腎組織于4%多聚甲醛固定48 h以上,流動(dòng)水沖洗30 min,進(jìn)行組織脫水、包埋與石蠟切片,切片厚6 μm。常規(guī)脫蠟入水,蘇木素染液浸染3 min,流動(dòng)水漂洗數(shù)秒,伊紅染液浸染3～5 min,顯微鏡下觀察。梯度酒精脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片。

1.7 肝臟脂質(zhì)含量檢測(cè) 取小鼠肝臟50 mg,用眼科剪在冰上快速剪碎并倒入玻璃勻漿器中,加入2 ml預(yù)冷的PBS,將勻漿器下端插入冰水中充分研磨5～8 min,制備肝組織勻漿。10 000 r/min、4℃離心10 min,取上清液備用。參照試劑盒說明書操作,使用紫外可見分光光度計(jì)檢測(cè)上清液與血漿總膽固醇和三酰甘油含量。采用BCA法測(cè)定上清液中蛋白濃度,以校正肝臟內(nèi)總膽固醇與三酰甘油含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示,兩樣本均數(shù)的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠一般情況與體重變化 造模前兩組小鼠一般情況良好,活動(dòng)自如,體重接近(P>0.05)。模型組給予HFD喂食2周后,體重增加較對(duì)照組更明顯,盡管組間差異并無顯著性(P>0.05)。經(jīng)連續(xù)5 d過夜禁食與腹腔注射STZ或檸檬酸鈉溶液后,兩組小鼠體重均迅速減輕。對(duì)照組小鼠在后續(xù)4周中體重逐漸恢復(fù),而模型組小鼠體重則持續(xù)降低,造模結(jié)束時(shí)甚至低于對(duì)照組(P<0.05,圖1)。

圖1 小鼠體重變化(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=8只/組)

2.2 小鼠主要臟器重量比較 造模結(jié)束后,小鼠腹腔麻醉、摘眼球取血,分離肝臟、心臟及腎臟并稱重。與對(duì)照組相比,模型組小鼠肝臟重量顯著增加(P<0.05),肝臟指數(shù)增加(P<0.01),而心臟、腎臟重量則無明顯改變(P>0.05,圖2)。

圖2 小鼠主要臟器質(zhì)量比較(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤,n=8只/組)

2.3 主要臟器組織病理染色 H&E染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照小鼠肝臟小葉結(jié)構(gòu)完整,肝細(xì)胞大小、形態(tài)正常;模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡與氣球樣改變,部分細(xì)胞核溶解消失,小葉結(jié)構(gòu)破壞,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加。同時(shí),模型組小鼠心肌纖維排列紊亂、血管周圍單核細(xì)胞增多;腎小球周圍炎癥細(xì)胞聚集增多(圖3)。

2.4 血糖與肝腎功能檢測(cè) 如圖4所示,與對(duì)照組比較,模型組小鼠血漿葡萄糖水平明顯升高(P<0.001),谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著增加(P<0.001),腎損傷指標(biāo)胱抑素C水平增加(P<0.05),盡管尿素氮與血肌酐含量組間無明顯差異(P>0.05)。

圖4 小鼠肝腎功能指標(biāo)檢測(cè)

2.5 血脂譜水平 與對(duì)照組比較,模型組小鼠血漿總膽固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白膽固醇與低密度脂蛋白膽固醇水平均顯著升高(P<0.01或P<0.001),見圖5。

圖5 血脂譜水平

2.6 肝臟油紅O染色與脂質(zhì)含量 油紅O染色結(jié)果顯示,正常對(duì)照小鼠肝臟內(nèi)脂滴非常細(xì)小,模型組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯、蓄積增多,肝內(nèi)總膽固醇與甘油三酯含量明顯增加(P<0.05或P<0.01,圖6)。

圖6 肝臟油紅O染色(×100)與肝內(nèi)脂質(zhì)含量

3 討論

隨著現(xiàn)代生活方式和飲食習(xí)慣的改變,NAFLD的發(fā)病率與患病人數(shù)正在不斷增加,已成為最常見的慢性肝病之一,全球約有1/4的人群患有NAFLD[1,5]。我國(guó)NAFLD患病率更是高達(dá)29.2%,其中肥胖、T2DM及胰島素抵抗與NAFLD的流行密切相關(guān)[6]。T2DM患者合并NAFLD的情況非常普遍。據(jù)統(tǒng)計(jì),全球約有55.5%的T2DM患者合并有NAFLD,37.3%的患者進(jìn)展為NASH,17.0%的患者出現(xiàn)晚期肝纖維化[3]。T2DM患者出現(xiàn)嚴(yán)重肝臟相關(guān)疾病或死亡的風(fēng)險(xiǎn)較非糖尿病患者升高2.25倍(95%CI:1.83～2.76)[7]?，F(xiàn)常采用的糖尿病或NAFLD動(dòng)物模型,為闡明T2DM及相關(guān)脂肪肝病發(fā)病機(jī)制與藥物研發(fā)做出了巨大貢獻(xiàn)[8,9]。然而,不同的疾病模型其發(fā)病機(jī)制與病理表現(xiàn)存在較大差異,并不能完全模擬和反映T2DM患者中NAFLD的疾病進(jìn)展與病理機(jī)制[4,10]。

目前,糖尿病常見造模方法包括基因缺陷動(dòng)物、高脂飲食和化學(xué)藥物誘導(dǎo)等[11]。前者常見有ob/ob小鼠、db/db小鼠、Zucker大鼠、SHR/N-cp大鼠及JCR:LA-cp大鼠等[10]。這些嚙齒類動(dòng)物模型均是由于瘦素或瘦素受體缺陷而導(dǎo)致攝食過多,最終發(fā)展為肥胖,出現(xiàn)類似T2DM樣表現(xiàn)[10]。這實(shí)際上與人類T2DM發(fā)病機(jī)制存在很大差異,因?yàn)樵诜逝趾蚑2DM患者中通常并不缺乏瘦素,甚至存在“瘦素抵抗”現(xiàn)象[12,13]。此外,基因缺陷小鼠價(jià)格昂貴、實(shí)驗(yàn)成本較高,這也極大限制了其在科學(xué)研究中的應(yīng)用。高脂飲食能夠誘導(dǎo)胰島素抵抗與外周高胰島素血癥,以及糖尿病心肌病等發(fā)生,已被廣泛用于糖尿病動(dòng)物造模[9,14]。然而,高脂飲食造模周期較長(zhǎng),通常達(dá)3～4個(gè)月以上,且目前研究報(bào)道中所使用的高脂飼料配比,尤其是脂肪和糖水化合物含量,以及造模周期、小鼠品系及周齡等差異較大,缺乏規(guī)范性與可比性[4,15]。相比之下,化學(xué)藥物誘導(dǎo),如STZ、四氧嘧啶及糖皮質(zhì)激素等,因其經(jīng)濟(jì)性、操作方便和快速出模而被廣泛使用[11]。其中STZ與四氧嘧啶主要通過短期大量破壞胰島β細(xì)胞,導(dǎo)致胰島素分泌絕對(duì)不足,是1型糖尿病造模的經(jīng)典模型。也有國(guó)內(nèi)學(xué)者采用地塞米松腹腔注射聯(lián)合高脂乳劑灌胃5 d快速誘導(dǎo)BALB/c小鼠發(fā)生肝脂肪變性[16]。然而,這種方式實(shí)際類似于臨床上庫(kù)欣綜合征或長(zhǎng)期使用激素引起的脂肪肝患者,與大多數(shù)NAFLD患者發(fā)病機(jī)制存在較大差異。此外,T2DM與NAFLD均屬于增齡性疾病,老年人群中的發(fā)病率顯著增加[6,17]。然而,現(xiàn)有糖尿病或脂肪肝動(dòng)物實(shí)驗(yàn)很少在老齡鼠中開展。

本研究利用老齡C57BL/6J小鼠,通過高脂飲食喂養(yǎng)6周聯(lián)合低劑量STZ連續(xù)腹腔注射5 d,成功建立了T2DM相關(guān)脂肪肝老齡小鼠模型。模型組小鼠肝臟重量與肝臟指數(shù)明顯增加,肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)脂肪空泡與氣球樣改變,小葉結(jié)構(gòu)破壞,并伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)增加;心肌組織與腎皮質(zhì)亦出現(xiàn)相應(yīng)病理改變。同時(shí),血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶及胱抑素C水平顯著升高,提示肝腎功能損傷發(fā)生,符合T2DM合并NAFLD的病理特征。此外,模型組小鼠血漿中葡萄糖、血脂系列均顯著升高,肝臟油紅O染色顯示脂滴大量蓄積,肝內(nèi)總膽固醇與三酰甘油含量增加,均證實(shí)NAFLD與肝脂肪變性發(fā)生。

綜上所述,本研究通過高脂飲食喂養(yǎng)聯(lián)合STZ造模,快速有效地建立起T2DM合并NAFLD的老齡小鼠模型,從而較好地模擬臨床T2DM患者發(fā)生脂肪肝的病理過程。該造模方法穩(wěn)定可靠、可行性強(qiáng),且操作簡(jiǎn)單、周期較短,為今后相關(guān)發(fā)病機(jī)制研究與治療藥物研發(fā)提供了理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。